专利名称：Pcv2重组杆状病毒构建及其亚单位疫苗制备方法
技术领域：
本发明涉及一种PCV2重组构建及其亚单位疫苗制备方法，具体说是指一种PCV2 重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒构建及其亚单位疫苗制备方法，属生物技术领域兽用生物制品行业。
背景技术：
猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，无囊膜，是目前发现的最小的动物病毒。根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，将PCV可分为PCV-I和PCV-2。PCV-I尚未知有致病性；PCV-2具有致病性，能引起猪表现多种临床症状。PCV-I基因组全长1759bp，PCV-2全长1768bp或1767bp，二者序列同源性小于80%。现已经证实，PVC有两个主要的阅读框，ORFl和0RF2。ORFl是最大的阅读框，与病毒的复制转录有关。0RF2编码病毒的Cap蛋白，可以与PCV-2的抗血清反应， 是主要的免疫原。猪圆环病毒现已成为全球广泛传播的猪病病毒，其具有流行范围广、各生长阶段猪感染严重、混合感染突出等特点。PCV2在我国的流行始于2000年，在我国该病毒的阳性率也呈逐年上升的趋势，2001-2002年在我国华南地区出现过一次爆发高潮，目前在许多省份危害严重，给我国养猪业造成了巨大的损失，严重威胁了我国养猪业的发展。目前世界上研发的圆环病毒疫苗主要种类有PCV2全病毒灭活疫苗CIRC0VAC ； PCV1-PCV2嵌合病毒灭活疫苗SuvaXynPCV2 ；杆状病毒表达多肽PCV2基因工程疫苗 CircoFLEX和Porci 1 isPCV，其中SuvaxynPCV2是第一个在美国获得了完整许可证的疫苗。与其他表达系统相比，杆状病毒表达系统具有以下的优越性杆状病毒的衣壳和基因组大，可容纳101Λ左右外源DNA且不影响复制，还可同时进行多个外源片段的表达； 应用晚期蛋白启动子，即使外源基因产物对细胞有毒性，也不影响表达水平(韩庆功、崔艳红、刘宝国.昆虫杆状病毒表达系统在禽流感病毒研究中的应用.吉林农业科学.2010， 35(1) :38-41,44.)；杆状病毒具有明显的宿主界限，对脊椎动物无致病性，也不能在脊椎动物细胞内复制表达更不能整合，因此对众多生物具有很高安全性；多角体蛋白与PlO基因是非必需片段，启动子均很强；外源基因插入多角体蛋白基因的座位引起后者的缺失或失活，无多角体蛋白形成，从而导致重组病毒在自然环境下极易失活，不会造成对人的危害和对环境的污染；昆虫细胞作为真核细胞能完成外源蛋白的一系列转译后加工修饰，表达产物的理化和生物学特性与天然产物相似度很高；其病毒在昆虫细胞内产量高，因此可以高效表达转座基因蛋白。此外，昆虫细胞的无血清培养技术已经十分成熟，表达产物的下游处理更加方便。利用传统的猪肾细胞培养技术生产圆环病毒灭活疫苗，病毒效价低，抗原含量不足，生物安全性差。利用杆状病毒表达系统对PCV2 Cap蛋白进行高效表达，可得到更高含量的抗原蛋白，且下游处理工艺更加成熟，对圆环病毒流行的监测和防控都有巨大的应用价值。
发明内容
为了解决和抑制猪圆环病毒的广泛传播，本发明的目的是提供一种更有效的预防猪圆环病毒2型感染的的猪圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗和其构建及生产方式，亦可制备PCV2特异性快速诊断用品。本发明所指PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒是用分子生物学手段后获得的含有密码子优化后的PCV2 0RF2核苷酸序列(SEQ ID No. 3)和氨基酸序列(SEQ ID No. 4)能高效表达PCV2表面抗原(Cap蛋白)的苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)，本发明以下简称为PCV2重组杆状病毒或重组杆状病毒。本发明主要通过以下技术方案实施的1.构建一株含SEQ ID No. 3核苷酸序列和SEQ ID No. 4氨基酸序列、能高效表达 PCV2表面抗原(Cap蛋白)的PCV2重组杆状病毒。2.本发明PCV2重组杆状病毒的构建方法为(1)以根据文献中0RF2基因序列设计引物，扩增PCV2HZ株DNA为模板，以 Seq-U(SEQ ID No. 1. )ID No. 2)为引物，用 TaKaRa rTaq 酶进行 PCV2-0RF2 片段的PCR扩增；反应程序为95变性5min后进入循环，94 V变性60s，56°C退火45s，72°C 延伸30s, 30个循环后，72°C充分延伸IOmin。取5 μ L扩增产物加1 μ L 6 X Loading Buffer 混勻后，于琼脂糖凝胶中电泳，分析扩增产物。0RF2基因克隆扩增产物DNA，经过PCR检测结果与预期的结果一致，约为760bp。(2)将扩增产物经双酶切后连接到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒穿梭载体pPAK/ mod上，再转化至大肠杆菌DHlOBac感受态细胞中，提取高纯度的质粒pPAK/CY ；(3)将pPAK/CY质粒与缺失0RF16^基因的苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒基因组 DNA共转染昆虫细胞，筛选得到重组的杆状病毒；(4)根据蚀斑克隆方法纯化病毒，并感染Sf9_F细胞；通过血清免疫荧光方法鉴定筛选出高表达量的阳性重组杆状病毒Bac/CY株(此毒株已于2011年09月沈日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 5267)。3.亚单位疫苗制备采用悬浮细胞培养技术培养昆虫细胞Sf9_F，培养环境为 270C 120r/min,培养约4 其细胞处在对数生长期时将接入重组的杆状病毒Bac/CY，再经过7 培养，收获感染细胞，病毒效价能达到108_°TCID5Q/ml以上，反复冻融3次，用PBS离心洗涤方法数次后取上清，上述重组蛋白提纯加入佐剂并经过乳化即可生产出对PCV2的 0RF2亚单位疫苗。
图IPCR扩增产物电泳2穿梭载体示意3穿梭质粒示意4免疫小鼠的血清中和抗体滴度实验图5细胞生长曲线图6抗原表达含量对比图
具体实施例方式下面将结合具体实施例来辅助说明本发明，本领域一般技术人员可据此更好的理解本发明，但下述实施例仅作为技术示范，并不对本发明构成任何限制。本发明克隆并优化PCV2 HZ株(本发明人由浙江省感染2型圆环病毒的发病猪分离、鉴定得到)0RF2序列，并将其重组至穿梭载体pPAK/mod(购自Clonetech Laboratories, Inc.)上。将苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒基因组BacPAK6 (购自Clonetech Laboratories, Inc.)以限制性内切酶Bsu36I (购自Takara Bio, Inc.)酶切，使其缺失 0RF1629基因。提取pPAK/mod质粒与上述缺失0RF16^基因的BacPAK6杆状病毒基因组共转染昆虫细胞Sf9-F株(购自Cambivac，Ltd.)，得到一株Bac/CY株重组杆状病毒，利用重组杆状病毒，感染昆虫细胞Sf9-F，培养48-7 后，高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白，病毒蛋白混合物经灭活，纯化，乳化后，制成亚单位疫苗。一、PCV2重组杆状病毒构建1.猪圆环病毒2型浙江株0RF2基因的克隆按照hvitrogen DNAzol 说明书提取猪圆环病毒2型HZ株DNA作为模板，以 Seq-U(序列 1:5，-AGTGCTCGGAGGATCCATGACGTATCCAGGGAGGC-3，)与 Seq-D (序列 2:5' -G AGCAGATCTTTAGGTGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAG-3 ‘)作为扩增引物，用 TaKaRariTaq 酶进行 PCV2-0RF2片段的PCR扩增，反应程序为95变性5min后进入循环，94°C变性60s，56°C退火 4&，721延伸308，30个循环后，721充分延伸101^11。取5 4 1^扩增产物加1口1^ 6XLoading Buffer混勻后，于琼脂糖凝胶中电泳，分析扩增产物。0RF2基因克隆扩增产物DNA，经过PCR检测结果与预期的结果一致，约为760bp(已包含了引物长度)，片段测序结果表明， 该片段为PCV2-0RF2片段。将回收鉴定后的PCV2-0RF2片段与pGEM-T easy载体(购自Promega Corporation)连接，参照!Iomega pGEM-T easy载体试剂盒说明进行操作。取上述连接产物，在无菌条件下加入到感受态细胞中，混勻后冰浴30min。迅速放入42°C水浴中热激 90s，立即取出后，冰浴2 ;3min使之冷却。将热激后的混合物加入800 μ L预热至37°C的 LB培养液(Amp-)中，37°C，170r/min摇床中振荡培养1.证。将培养物5000r/min室温离心 2min,弃去800 μ L上清。混勻剩余的培养液和细胞沉淀，均勻涂布于Amp+平板上。倒置平皿于37°C培养箱培养过夜挑取转化菌落。从LB平板挑取重组转化阳性菌落，接种于3mL含100 μ g/mLAmp的LB培养液中， 200r/min、37°C振荡培养1 16h(或过夜)。无菌移取上述菌液1. 5mL置于灭菌离心管中，参照Qiagen Plasmid mini kit试剂盒进行质粒提取。2.用限制性内切酶Xho I和BamH I对PCV2 0RF2基因进行双酶切，1 %琼脂糖凝胶电泳检查观察结果。回收酶切后的PCV2 0RF2片段。3.重组穿梭质粒pPAK/mod的构建将pPAK8 质粒(Clonetech Laboratories, Inc.)以限制性内切酶 Xho I 和 BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离并回收酶切后的PPAK8质粒。紫外分光光度计分析回收片段的纯度与浓度。酶切后的PPAK8质粒与酶切后的PCV2 0RF2片段以1 3的摩尔比加入10 μ L连接体系中，16°C连接过夜。以全部连接产物转化100 μ L的DHlOBac感受态细胞 (Clonetech Laboratories, Inc.)，^^取可疑转化菌胃，参照 Qiagen Plasmid mini kit i式剂盒进行质粒提取，Xho I和BamH I双酶切鉴定是否含有重组质粒pPAK/CY。挑取重组转化阳性菌落，接种于6mL含抗生素的培养液中，200rpm、37°C振荡培养12h 16h(或过夜)。无菌移取上述菌液1.5mL分装置于灭菌离心管中，参照Qiagen Plasmid mini kit试剂盒进行质粒提取。获得高纯度的pPAK质粒。质粒同时进行序列测定，进一步确认含有PCV2-0RF2片段。4.重组质粒pPAK/CY与杆状病毒0RF16^缺失基因组DNA共转染SF9-F细胞本发明采用BacPAK杆状病毒表达系统选择了一个特殊构建的杆状病毒，该病毒基因组BacPAK6经过Bsu36 I单酶切后，得到缺失了 0RF16^基因的杆状病毒基因组DNA， 只有当与pPAK/CY质粒上携带的0RF16^基因共同转染成功，才可以产生重组病毒颗粒。取长至对数生长期的Sf9_F细胞以3xl04细胞/cm2的密度接种密度，接种直径为 35mm的培养皿，得到Sf9_F单层细胞。取2个微量离心管，将纯化提取的重组质粒pPAK/ CY、阳性对照质粒、无菌水、0RF1629缺失的杆状病毒基因组按比例混合，设置阴性对照与阳性对照，以pBacPAK8-GUS质粒替代pPAK/mod做为阳性对照，阴性对照不含pPAK/mod质粒及杆状病毒基因组。向混合好的体系中加入4微升Bacfectin转染试剂Ononetech Laboratories, Inc.)后，充分混勻，逐滴加至Sf9_F单层细胞上，27度孵育5小时后，吸去上层液体，加入1.5mLBacPAK完全培养基，同时向阳性对照上层培养基中添加50微升 X-gluc底物，27度培养约5天。阳性对照应转为蓝色，证明转染正常。检查Sf9-F细胞病变情况，当转染的Sf9-F细胞出现病变后，收获pPAK/CY转染的Sf9-F细胞培养物上清，该上清中即含有重组杆状病毒。5.重组病毒的纯化与鉴定取少量初代重组杆状病毒，10倍倍比稀释后，接种单层Sf9_F细胞，27度孵育1小时后，吸走病毒液，加入含有1 %琼脂的BacPAK完全培养基，置27度培养箱，加湿培养4 6天。逐天观察细胞病变情况，挑取单一蚀斑后，接种新的Sf9-F细胞，待活细胞比例降至 20%以下收获，获得数个杆状病毒单克隆。病毒液以蚀斑法测定效价，按蚀斑形成单位计
笪弁。取圆型盖玻片数个，置M孔板中，加入100 μ 1多聚赖氨酸包被1小时，PBS冲洗 3次，向M孔板中加入Sf9-F细胞3xl04个/cm2，培养过夜后，以感染复数MOI 10. 0接种经过克隆的杆状病毒，27度培养4天，丙酮固定，以PCV2阳性血清做为一抗，免疫荧光法检测抗原表达，筛选高表达量的阳性毒株，并命名为重组杆状病毒(苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)Bac/ CY(CGMCCNo. 5267)。6.重组杆状病毒株的特定重组蛋白的表达及分析抗原捕获ELISA定量法分析抗原表达量以CsCl密度梯度离心的方法纯化PCV2 HZ株，与弗氏佐剂混合后，免疫4_5周龄家兔2只。分别在观，42，56天进行二免，三免及四免。前两次免疫用弗氏完全佐剂，后两次免疫用弗氏不完全佐剂。最终在第63天进行血清采集。
用ftOtein A凝胶层析柱对兔抗_PCV2 IgG进行纯化，Bradford法测定纯化的抗
体含量。利用包被液对兔抗-PCV2 IgG进行1 10000倍稀释后，包被于微量滴定板中， 100 μ L/孔，4°C密封培育过夜。然后用含有吐温20的磷酸缓冲液PBS洗涤该平板三次。 而后用BSA封闭液进行封闭，37 °C密封作用60min。继续用含有吐温20的磷酸缓冲液PBS洗涤该平板三次。下一步将预先稀释200倍或500倍的待测抗原样品加入到平板第一列各孔中，然后依次倍比稀释，37°C密封作用60min。用洗液洗涤三次。抗PCV2 Cap蛋白的单抗(购自VMRD，he.)用稀释液进行1 500倍稀释后加入到各孔中，100 μ L/孔， 37°C密封作用60min。用洗液洗涤三次。用含有BSA的稀释液1 10000稀释碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG 二抗，每孔加入100 μ L，37°C密封作用60min。用洗液洗涤三次。加入100 μ L底物显色，37°C密封作用30min，而后用每孔加入100 μ L 3Μ的NaOH终止反应。 然后通过酶标仪进行读数，确定抗原稀释终点，以此为基准，计算抗原含量。Sf9-F昆虫细胞以120r/min 27°C摇瓶悬浮培养，当浓度达到1 2X 106/mL且活细胞比例高于95%时，以感染复数(M. 0.1. )1.0的比例接入重组的杆状病毒。经过3-4天培养，IOOOOg离心Imin分离细胞碎片和上清，以上述抗原捕获ELISA法检测抗原表达量。 本发明所涉及重组病毒接种少量悬浮培养的昆虫细胞，目的蛋白表达量可达150μ g/ml左右ο7.重组杆状病毒Bac/CY在小鼠上免疫原性反应研究。接种重组杆状病毒Bac/CY在Sf9_F昆虫细胞上培养72h，将其收获并_20°C /37°C 冻融三次，3000g离心10分钟，取上清。以抗原捕获ELISA检测抗原含量。随机选取8只成年昆明鼠，腹膜内注射16yg/只0. Iml ；同时随机另选取8只成年小鼠作对比实验，同样采取腹膜内注射生理盐水。第一次免疫14天后等量加强免疫一次， 第观天眼球采血分离血清。将倍比稀释的中和血清和200个TCID50的PCV2病毒混合37°C温育1小时后接种 HQ5细胞的细胞板，然后加入细胞生长液培养72h。去除病毒液，用1 1的乙醇和丙酮固定细胞板30分钟；用PBS清洗细胞板3次，加入5%脱脂奶封闭处理Ih ；然后用PBS清洗， 加入1 400稀释的抗PCV2病毒的一抗作用1.5小时，然后用PBS清洗3次，加入1 200 稀释的含FITC的二抗避光处理1小时。然后再用PBS清洗3次。最后在免疫荧光显微镜下观察，判定小鼠血清的中和抗体效价。实验结果如附图4，实验结果发现在两次免疫后小鼠中和血清中和效价最高为 1 128，最低1 32。说明收获病毒液内表达出的PCV2 Cap蛋白可以诱导小鼠产生很强的细胞免疫，本发明制成的PCV2 Cap蛋白具有很好的免疫原性。二、以本发明构建的重组杆状病毒株(Bac/CY)，接种昆虫细胞表达的PCV2 Cap蛋白产物为抗原，制备亚单位疫苗。取培养至对数生长期的Sf9_F细胞，苔酚蓝染色并计数细胞数，细胞数量应在l-26/ml之间，活细胞比例应在98 %以上。依据细胞计数结果，接种所需病毒数量。 270C 120r/min培养，每对小时取样一次。抗原捕获ELISA法检测抗原表达量。研究试验对制备重组蛋白在昆虫细胞的表达参数进行了优化，用5个感染单位种毒接种昆虫细胞，用表达的5批次重组蛋白作为抗原进行了亚单位疫苗的研制。将重组蛋白培养物与免疫佐剂乳化制备亚单位疫苗。制作方法如下首先将重组病毒培养物收获后，冻融三次进行细胞破碎，在HITACHI连续流离心机内17000r/min离心，出去细胞碎片。配制IM溴乙胺氢溴酸盐(BEA)溶液及20%的硫代硫酸钠溶液，过滤除菌后备用。将离心后的上清液在37°C中进行温度平衡，加入终浓度 0. 25%的酚红后，缓慢向病毒上清液中加入BEA，混勻后用2M的NaOH调pH值至7. 5 8. 0 ； 37°C灭活18h，之后再用2M的HCl调pH值至6. 5，最后加入硫代硫酸钠溶液中和过剩的BEA， 37°C孵育池后4°C保存备用。激流反应器AP20C培养的Sf 9-F细胞，接种重组杆状病毒株Bac/CY (CGMCC No. 5267)，高量表达PCV2 Cap蛋白。昆虫细胞的生长受制于氧气的供给与营养的消耗，往往不能达到较高的细胞密度，用激流式培养的方式(见附注)，可以在产生低剪切力的同时，使系统内的溶氧均一得到更高的细胞培养密度。接种该细胞后，检测结果显示，目的蛋白表达量更高。试验操作程序将5L SF900-II昆虫细胞培养基注入AP20C系统激流袋(购自 AmProtein-China, Inc.)内，27°C 50r/min pH 7. IDO 60%运转过夜，检验系统是否无菌。 接种培养至7. 57ml的Sf9-F细胞悬液共200ml，27°C 80r/min其余参数不变。每隔6小时取样一次，待细胞生长至36/ml时，以10个感染复数(MOI)接种CGMCC No. 5267株病毒种子悬液，培养参数不变。每隔12小时取样一次，IOOOOg离心lmin，分离细胞与上清，细胞沉淀以等体积PBS重悬，检测上清与沉淀中抗原表达量。试验结果接种Sf9_F细胞于激流袋，经84小时培养，细胞数达到2.986个/ml (附图5)。接种重组杆状病毒后继续培养6天，抗原表达检测结果显示病毒感染初期，抗原蛋白主要集中在细胞沉淀中，上清中抗原含量很少；病毒感染后期，抗原主要分布于上清中； 抗原表达最高水平出现在接毒后120小时，总抗原含量可达238. 17 μ g/ml (附图6)。以下进行乳化的过程首先进行油相与水相的配制白油与司本-80按照94%和6%的配比进行配制，混勻，并进行高压灭菌，待温度降低至20 30°C时备用。将吐温-80进行高压灭菌，待温度降低至20 30°C时备用。将稀释至50 μ g/ml的抗原原液与灭菌的吐温_80按照95%和 5%的比例进行混勻，并让吐温-80充分的溶解在抗原液中，储存至2 8°C备用。油相与水相配制完成后按1 1的比例进行乳化分装，抗原最终含量约为25 μ g/ ml。按兽用《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇〇五年版三部中国农业出版社，2006，本发明简称《中国兽药典》)要求进行了半成品与成品疫苗的检验，用检验合格制品进行临床试验。试验结果用试制的PCV2_Cap亚单位疫苗2倍剂量(4mL/头)肌肉接种25日龄仔猪5头，临床观察洲天未见无异常反应，证明疫苗制品对本动物是安全的。疫苗免疫效力试验是采用0. 5mL、lmL、2mL三种剂量免疫25日龄仔猪，每组5头，设未接种疫苗对照猪 3头。所有疫苗免疫后观天抗体检测全部转阳；强毒攻击试验结果表明，ImL和2mL免疫组均获得100%保护，0. 5mL组获得80% (4/5)保护率。三、亚单位疫苗的检验1.使用本发明方法表达的PCV2 Cap蛋白制备亚单位疫苗并进行安全性检验。
将所述所制备的亚单位疫苗成品接种4头20日龄的仔猪，连续观察30天，在此期间仔猪的精神食欲正常，未见异常变化，通过ELISA方法均可以检测到猪圆环病毒2型抗体。强毒对照组4头仔猪全部出现PCV2感染，并且有3只死亡(即死亡率75%)，尸体组织检验发现均发生淋巴结水肿，肺脏水肿，肾脏发黄或有点状坏死等病变。而对照组4头无任何异常临床表现。所制备的亚单位疫苗成品接种和未接种的妊娠母猪，窝产仔数基本相当，均没有出现死胎等现象，证实该亚单位疫苗是安全的。2.使用本发明方法表达的PCV2 Cap蛋白制备亚单位疫苗并进行效力检验。将所述所制备的亚单位疫苗成品接种4头20日龄的仔猪，且在14天后进行二免， 在二免后21天进行强毒攻毒，攻毒后逐天观察均未出现明显的临床症状，精神食欲正常。 强毒对照组，在攻毒后出现体温升高、食欲减退、消瘦和生长速度缓慢。剖检后发现有淋巴结、肺部水肿，肾脏有点状病变。将所述所制备的亚单位疫苗成品在后备母猪配种前15天接种，然后分别在42、60 天进行强毒攻毒，妊娠母猪均未出现明显的临床症状，精神食欲正常，并能检测到高水平的猪圆环病毒2型血清中和抗体。分娩猪在分娩时未出现死胎等现象。而接种强毒的对照妊娠母猪，部分出现胎儿重吸收，腹围减小妊娠终止，产下死胎及少数弱胎，母猪则出现体温升高、食欲减退、消瘦和生长速度缓慢等现象。这些结果表明，所述亚单位疫苗可以保护猪免受圆环病毒2型强毒株的攻击。3.其他项目检验按《中国兽药典》规定的项目进行疫苗成品的检验。性状外观乳白色乳状液。剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均应不扩散。稳定性在37°C左右条件下放置21日或取疫苗IOmL装于离心管中，以3000r/min 离心15min，应不破乳。黏度按《中国兽药典》规定进行，应不超过200cP。无菌检验按《中国兽药典》规定的方法检验，应无菌生长。甲醛和汞类防腐剂残留量测定按中国兽药典的规定进行，甲醛残留量应不超过 0.2%的甲醛溶液(含40%甲醛)量；苯酚残留量应不超过0.5% ；汞类防腐剂残留量应不超过0.01%。四、以本发明构建的重组杆状病毒株(Bac/CY)，接种昆虫细胞表达的PCV2 Cap蛋白产物为抗原，由于该蛋白具有良好的免疫原性，能按现有技术制备制成猪圆环病毒2型病毒检测试剂盒(如ELISA检测试剂盒)用于非疾病诊断目的检测猪圆环病毒2型病毒流行病学和病毒学研究。将重组杆状病毒表达的PCV2 Cap蛋白120 μ g/ml与等量弗氏佐剂乳化完全，免疫 5-6周龄家兔2只。分别在观，42进行二免，三免。第一次免疫用弗氏完全佐剂，后两次免疫用弗氏不完全佐剂。最终在第50天进行血清采集。用ftOtein A凝胶层析柱对兔抗-PCV2 IgG进行纯化，Bradford法测定纯化的抗
体含量。纯化的抗体用包被液进行1 8000倍稀释后，包被于微量滴定板中，100 μ L/孔，4°C密封培育过夜。然后用含有吐温20的磷酸缓冲液PBS洗涤该平板三次。而后用 BSA封闭液进行封闭，37°C密封作用60min。继续用含有1 %吐温20的磷酸缓冲液PBS洗涤该平板三次。用含有BSA的PBS按1 40的比例稀释待测抗原样品，将稀释好的待检样品100 μ L加入到样品孔中，在其相邻两侧各加入100 μ L阴性血清和阳性血清作为对照，同时设置空白对照孔，37°C密封作用60min。用洗液洗涤三次。抗PCV2 Cap蛋白的单抗 (购自VMRD，Inc.)用稀释液进行1 500倍稀释后加入到各孔中，100 μ L/孔，37°C密封作用60min。用洗液洗涤三次。用含有BSA的稀释液1 10000稀释碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG 二抗，每孔加入100 μ L，37°C密封作用60min。用洗液洗涤三次。加入100 μ L稀释至工作浓度的P-NPP底物显色，37°C密封作用30min，而后用每孔加入100 μ L 3Μ的NaOH 终止反应。然后通过酶标仪读取0D405，计算Ρ/Ν值。以Ρ/Ν彡2.1判定为阳性，介于2.1 和1. 5之间为可疑，低于1. 5为阴性。阴性阳性对照血清都成立时，判定检测结果有效。实施例以下实施例为进一步对本发明进行阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。实施例1亚单位疫苗的制备采用普通细胞培养装置用悬浮培养细胞技术培养昆虫细胞Sf9_F，培养环境为27°C 120r/min，培养约4 其细胞处在对数生长期时将接入重组的杆状病毒Bac/ CY(CGMCCNo. 5267株)，再经过72h培养，收获感染细胞，病毒效价能达到108_°TCID5(1/ml以上，反复冻融3次，用PBS离心洗涤方法数次后取上清，上述重组蛋白提纯加入常规疫苗佐剂并经过乳化即成PCV2重组杆状病毒亚单位疫苗。实施例2激流反应器AP20C培养的Sf9_F细胞，制备亚单位疫苗将Sf9_F细胞接种到激流袋，经84小时培养，细胞数达到2. 986个/ml (附图5)。 接种重组杆状病毒CGMCC No. 5267株病毒种子悬液后继续培养6天，抗原表达检测结果显示病毒感染初期，抗原蛋白主要集中在细胞沉淀中，上清中抗原含量很少；病毒感染后期，抗原主要分布于上清中；抗原表达最高水平出现在接毒后120小时，总抗原含量可达 238. 17 μ g/ml (附图6)。其他过程同实施例1。实施例3PCV2重组杆状病毒亚单位疫苗制备可以采用转瓶培养细胞技术培养昆虫细胞Sf9_F，制备PCV2重组杆状病毒亚单位疫苗。其他过程同实施例1。实施例4疫苗检验性状外观乳白色乳状液。剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均不扩散。稳定性在37°C左右条件下放置21日或取疫苗IOmL装于离心管中，以3000r/min 离心15min，不破乳。黏度按《中国兽药典》规定进行，不超过200cP。
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无菌检验按《中国兽药典》规定的方法检验，均无菌生长。安全检验用PCV2-Cap亚单位疫苗2倍剂量(4mL/头)肌肉接种25日龄仔猪5 头，临床观察观天未见无异常反应，证明疫苗制品对本动物是安全的。效力检验疫苗免疫效力试验是采用2mL三种剂量免疫25日龄仔猪5头，设未接种疫苗对照猪3头。所有疫苗免疫后观天抗体检测全部转阳(5/5)，为免疫猪(3/ 仍为阴性；强毒攻击试验，疫苗免疫之后三周滴鼻接种PCV2-HZ株，每头猪接种106_5TCID5tlt5结果表明，ImL和2mL免疫组均获得(5/5) 100%保护，对照组猪(3/ 全部体温升高、食欲减退、精神沉郁，解剖发现肺部淋巴结均出现水肿，肾脏有点状坏死。甲醛和汞类防腐剂残留量测定按中国兽药典的规定进行，甲醛残留量不超过 0.2%的甲醛溶液(含40%甲醛)量；苯酚残留量不超过0.5% ；汞类防腐剂残留量不超过 0. 01%。注激流式生物反应器是一种新型细胞培养设备，采用高效“激流式给氧机制”(W02007/1似664和W02006/13814;3)进行传氧。通过机械振荡产生激流，反复冲刷聚集于培养袋内表面的氧分子层，使氧分子迅速溶解于培养液中，并不断地混合，充分传递，每个细胞都能得到充足的氧，维持细胞正常生长代谢。这种激流式给氧机制避免了传统鼓泡式给氧产生的气泡破裂对细胞形成的损伤和强机械搅拌对细胞形成的剪切力，使细胞培养密度大幅度提高，病毒产量明显增加。
权利要求
1.一种PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒，其特征在于该PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒含SEQ ID No. 3核苷酸序列和SEQ ID No. 4氨基酸序列、能高效表达 PCV2Cap蛋白；该Bac/CY株病毒已于2011年09月沈日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 5267。
2.如权利要求1所述一种PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒构建，其特征在于重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒的构建主要步骤包括(1)以根据文献中0RF2基因序列设计引物，扩增PCV2HZ株DNA为模板，以kq-U (SEQ ID No. 1.)和 kq-D(SEQ ID No. 2)为引物，进行 PCV2-0RF2 片段的 PCR 扩增；(2)将扩增产物连接至克隆载体pGEM-T上进行鉴定；阳性质粒经双酶切后连接到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒穿梭载体pPAK/mod上，再转化至大肠杆菌DHlOBac感受态细胞中，提取高纯度的质粒pPAK/CY ；(3)将pPAK/CY质粒与缺失0RF16^基因的苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒基因组DNA 共转染昆虫细胞，筛选得到重组的苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒；(4)根据蚀斑克隆方法纯化病毒，并感染Sf9-F细胞；通过血清免疫荧光方法鉴定筛选出高表达量的阳性Bac/CY株(CGMCC No. 5267)。
3.含有权利要求1所述的一种PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒的亚单位疫苗， 其特征在于该亚单位疫苗的主要成分是由Bac/CY株PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(CGMCC No. 5267)所表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白。
4.制备权利要求3—种PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，采用悬浮培养细胞技术培养昆虫细胞Sf9-F，培养环境为27°C 120r/ min，培养约4 其细胞处在对数生长期时将接入PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 CGMCCNo. 5267，再经过72h培养，收获感染细胞，病毒效价能达到108_°TCID5(1/ml以上，反复冻融3次，用PBS离心洗涤方法数次后取上清，上述重组蛋白提纯加入常规疫苗佐剂并经过乳化即成PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒亚单位疫苗。
5.如权利要求4所述的一种PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒亚单位疫苗制备方法，其特征在于，可以采用悬浮细胞培养技术培养昆虫细胞Sf9-F以复制PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒CGMCC No. 5267，制备PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒亚单位疫苗。
6.如权利要求4所述一种PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒亚单位疫苗制备方法，其特征在于，可以采用激流式生物反应器培养昆虫细胞Sf9-F以复制PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒CGMCC No. 5267，培养昆虫细胞至1 ^106/ml，震荡速度为80r/ min，溶氧饱和度为60%，培养4 6天并收获，制备PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒亚单位疫苗。
7.权利1所述的一种PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒，其特征在于其PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒CGMCC No. 5267表达的产物可用制备PCV2抗体诊断试剂品.ο
全文摘要
本发明涉及一种PCV2重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒构建及其亚单位疫苗制备方法。新型重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒构建方法，用以表达猪圆环病毒2型主要表面抗原进而制备有较好免疫效果的亚单位疫苗。具体说的是，在新型重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒载体表达系统中，定向插入PCV2 ORF2基因，使得该基因能在昆虫细胞中高效表达且具有良好的免疫原性，制备出相应的亚单位疫苗可以刺激猪产生抵抗猪圆环病毒2型强毒的攻击的保护性免疫反应。
文档编号C12N15/34GK102352347SQ20111031228
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者孟超, 嵇康, 张鹏超, 沈元 申请人:浙江诺倍威生物技术有限公司