一种监测dna合成期生物发光报告基因及其应用的制作方法

专利名称：一种监测dna合成期生物发光报告基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞分子生物学领域，主要涉及一种监测DNA合成期的生物发光报告基因，本发明还涉及该基因在抗肿瘤药物筛选中的应用。
背景技术：
细胞从一次分裂结束开始，经过物质积累，直到下一次细胞分裂结束为止，称为一个细胞周期。一个细胞周期可以人为地分为4个时期，即DNA合成前期(Gl期)、DNA合成期 (S期)、DNA合成后期(G2期)和有丝分裂期(M期)。正常细胞周期的运转由多种机制控制， 以确保细胞分裂的有序进行，而当细胞周期调节失控时会导致肿瘤的发生。肿瘤细胞与一般正常细胞的最大差别是在于它能够一直无限的增殖，这是肿瘤细胞的细胞周期已不受正常调控最明显的证据。如果能够利用药物去抑制肿瘤细胞的细胞周期，使肿瘤细胞停止生长，甚至诱导肿瘤细胞发生程序性死亡，那么就能够达到杀死肿瘤细胞治疗恶性肿瘤的目的。S期是细胞进行大量DNA复制的阶段，组蛋白和非组蛋白也在此期大量合成，最后完成染色体的复制。DNA复制需要多种酶的参与，包括DNA聚合酶、DNA连接酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、核苷酸还原酶等。由于S期是细胞周期的关键时刻，因此目前许多抗肿瘤药物都是针对影响肿瘤细胞的S期所研发的。在抗癌药物的研发过程中，传统的动物实验方法需要肿瘤生长到一定程度后处死动物切除肿瘤，然后通过免疫组化等技术才能获得检测指标。这种具有侵袭性的研究方法， 需要处死大量的动物，不能在同一组动物身上重复试验，很难直观、活体、动态地连续观察肿瘤的生长转移情况，特别是无法研究药物作用下影响细胞的增殖动态变化以及细胞死亡的动力学变化等重要的时空信息。因此，建立一种可以在活体小动物实时、反复、非侵袭性地研究抗肿瘤药物模型不仅可以加速药物的研发，快速优化新的治疗方案，降低在研发药物上所用动物的数量，而且还可以对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估，对于抗肿瘤药物的筛选及其作用机制研究具有重要意义。分子光学成像技术作为一种非侵入性动态成像技术，以其高分辨率、高灵敏度正越来越多的应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面，成为近年来动物模型研究最重要的进展，这一技术的完善和发展使非侵袭性研究抗肿瘤药物的分子机制成为可能。该技术可以利用活体生物发光或荧光成像实时及连续动态监测活细胞在动物体内的各种生物学过程，因而能够在不处死实验动物的前提下，实时监测体内疾病变化的整个过程，可以对同一动物体进行连续观察，减少动物个体间差异的影响，还可以减少实验动物的数量。鉴于上述情况，本发明拟利用荧光素酶基因标记细胞周期蛋白A2 (cyclinA2),从而构建一种具备高度敏感性，可以实时、反复地测定S期变化的光学影像报告系统，用于探讨研究筛选 S期敏感的抗肿瘤药物。cyclinA2由432个氨基酸组成，其中210 295位氨基酸为“ cyclin box，，， 在N末端47 55位氨基酸序列称为“destruction box(D-Box)",D-Box决定泛素连接酶 APCwk2tl是否特异性地与CyClinA2结合，是泛素化介导的蛋白降解的重要信号。CyClinA2与CDK2结合，在G广S转变过程中被活化，从而调控S期进展。在整个细胞周期中， cyclinA2的变化是受转录、翻译及翻译后修饰来调节的。在Gl晚期开始逐渐增加，S期积累到峰值，早中期后通过依赖APC/C泛素化途径降解，CDC20分子在此降解过程中发挥重要作用。因此CyClinA2可以视为一种细胞周期S期的特异性蛋白，反映CyClinA2蛋白的转录与翻译后调控的报告基因可以报告细胞周期的S期。基于以上CyClinA2的调控机制，本发明通过基因工程技术将CyClinA2基因全长与荧光素酶基因融合作为S期的报告基因，在离体培养的细胞株中验证了其作为筛选S期特异性抗肿瘤药物的分子影像报告系统的可行性，并为在体筛选S期抗肿瘤药物及研究S期的调控机制奠定基础。

发明内容
本发明的目的是提供一个实时、非侵袭性地监测DNA合成期(S期)的生物发光报
告基因。本发明的另一目的是提供该基因在以S期为靶点的抗肿瘤药物筛选领域中的应用。本发明的目的是这样实现的
一种监测DNA合成期生物发光报告基因，其特征在于将细胞周期蛋白A2与荧光素酶基因融合，从而形成一种可以用于监测细胞周期S期的生物发光报告基因，其核苷酸序列为
AAGCTTGCCACCATGTTGGGCAACTCTGCGCCGGGGCCTGCGACCCGCGAGGCGGGCTCGGCGCTGCTAGCA TTGCAGCAGACGGCGCTCCAAGAGGACCAGGAGAATATCAACCCGGAAAAGGCAGCGCCCGTCCAACAACCGCGGAC CCGGGCCGCGCTGGCGGTACTGAAGTCCGGGAACCCGCGGGGTCTAGCGCAGCAGCAGAGGCCGAAGACGAGACGGG TTGCACCCCTTAAGGATCTTCCTGTAAATGATGAGCATGTCACCGTTCCTCCTTGGAAAGCAAACAGTAAACAGCCT GCGTTCACCATTCATGTGGATGAAGCAGAAAAAGAAGCTCAGAAGAAGCCAGCTGAATCTCAAAAAATAGAGCGTGA AGATGCCCTGGCTTTTAATTCAGCCATTAGTTTACCTGGACCCAGAAAACCATTGGTCCCTCTTGATTATCCAATGG ATGGTAGTTTTGAGTCACCACATACTATGGACATGTCAATTGTATTAGAAGATGAAAAGCCAGTGAGTGTTAATGAA GTACCAGACTACCATGAGGATATTCACACATACCTTAGGGAAATGGAGGTTAAATGTAAACCTAAAGTGGGTTACAT GAAGAAACAGCCAGACATCACTAACAGTATGAGAGCTATCCTCGTGGACTGGTTAGTTGAAGTAGGAGAAGAATATA AACTACAGAATGAGACCCTGCATTTGGCTGTGAACTACATTGATAGGTTCCTGTCTTCCATGTCAGTGCTGAGAGGA AAACTTCAGCTTGTGGGCACTGCTGCTATGCTGTTAGCCTCAAAGTTTGAAGAAATATACCCCCCAGAAGTAGCAGA GTTTGTGTACATTACAGATGATACCTACACCAAGAAACAAGTTCTGAGAATGGAGCATCTAGTTTTGAAAGTCCTTA CTTTTGACTTAGCTGCTCCAACAGTAAATCAGTTTCTTACCCAATACTTTCTGCATCAGCAGCCTGCAAACTGCAAA GTTGAAAGTTTAGCAATGTTTTTGGGAGAATTAAGTTTGATAGATGCTGACCCATACCTCAAGTATTTGCCATCAGT TATTGCTGGAGCTGCCTTTCATTTAGCACTCTACACAGTCACGGGACAAAGCTGGCCTGAATCATTAATACGAAAGA CTGGATATACCCTGGAAAGTCTTAAGCCTTGTCTCATGGACCTTCACCAGACCTACCTCAAAGCACCACAGCATGCA CAACAGTCAATAAGAGAAAAGTACAAAAATTCAAAGTATCATGGTGTTTCTCTCCTCAACCCACCAGAGACACTAAA TCTGCAAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGC CATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGA ACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGC AGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTC AACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAA AAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGT TCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATT GCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAG ATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCC ATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAA GAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTT CGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTA AGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACA TCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAA GGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTA TGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATA GCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGT GGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCCGACG ATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGAT TACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCT TACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAA。本发明技术方案包括构建pGL3-CYCA-Luc重组表达载体，该载体含有上述核苷酸序列。本发明的技术方案包括pGL3-CYCA-Luc重组表达载体在以细胞周期S期为靶点的抗肿瘤药物筛选中的应用。本发明以包含人CyClinA2基因全长的PBS质粒为模板，在cyclinA2基因两端设计引物，扩增cyclinA2 cDNA全长并克隆至pGL3-Control载体Luc基因的5’端，形成一种可表达融合蛋白的真核重组表达载体，即“pGL3-CYCA-Luc”载体。该载体转染至肿瘤细胞后可表达融合蛋白“CYCA-Luc”。体外实验证明该融合蛋白可通过泛素化依赖性途径降解，呈细胞周期依赖性变化并能用于监测S期特异性抗肿瘤药物作用效果。本发明将在筛选针对S期的抗肿瘤药物等领域中发挥重要作用。下面对本发明内容作进一步的详述。构建真核重组表达载体pGL3-CYCA-Luc。利用I^rimer软件设计引物，以PBS质粒为模板扩增cyclinA2 cDNA全长，引物具体如下
Sense :GCGCAAGCTTGCCACCATGTTGGGCAACTCTGCGC，引物中加入 Kozak 序列以提高翻译起始效率。Anti-sense :GCCAAGCTTGCAGATTTAGTGTCTCTGGTGGGTTG
PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，在1200 bp位置可见明显条带。利用限制性内切酶Hind III分别酶切PCR产物和载体pGL3-Control并回收产物。本实验中为防止载体自连，酶切后的载体进行去磷酸化处理。酶切产物回收后，用T4 DNA连接酶在4 V连接过夜。转化大肠杆菌DH5 α，在含抗生素Amp平板上筛选重组子，通过酶切鉴定和测序确定得到重组表达载体pGL3-CYCA-Luc。本发明中重组表达载体具有以下基本结构启动子(3￥40)、融合蛋白编码区(0701丨1^2-111(^作^86)、终止密码子(144)、0嫩序列(0嫩复制起始点等)顺序连接而成的双链环状DNA分子，如图1所示。将构建好的重组表达载体以脂质体法瞬时转染U20S细胞，通过Western blot鉴定转染细胞株是否表达融合蛋白CYCA-Luc。结果显示，使用荧光素酶和CyClinA2的抗体在110 KD位置均可发现特异性条带，体外荧光素酶活性分析结果显示转染pGL3-CYCA-Luc 质粒的细胞荧光素酶相对强度比转染pcDNA3. 1质粒即对照组高4000倍左右，表明融合蛋白可在转染细胞株表达。随后利用G418筛选获得稳定转染株细胞，命名为 “U20S-CYCA-LUC”。在接下来得实验中，通过细胞周期同步化方法进一步分析了融合蛋白CYCA-Luc 是否随细胞周期变化。本发明中S期同步化药物为mimosine。流式分析结果显示，mimosine 处理细胞20 h后，随着释放时间的增加，S期细胞比例逐渐增加。Westren bloot和荧光素酶活性分析结果显示，随着S期细胞比例的增加CYCA-Luc表达和荧光素酶相对强度增加， 提示CYCA-Luc表达与S期细胞比例密切相关。后期促进复合物(anaphase-promoting complex/cyclosome, APC/C)在调控有丝分裂的过程中起到重要的作用。APCedc^在有丝分裂途径前中期被激活，通过泛素化依赖性途径降解CyClinA2。为确定融合蛋白是否呈泛素化依赖性降解，本发明中使用CDC20 小分子干扰RNA封闭⑶C20表达，以确定⑶C20表达下调后是否可导致CYCA-Luc表达的上调。将⑶C20小分子干扰RNA以脂质体法转染U20S-CYCA-Luc细胞后，分别进行荧光素酶活性分析和Western blot检测。结果表明，⑶C20小分子干扰RNA可使 U20S-CYCA-Luc细胞荧光素酶相对强度升高和CYCA-Luc表达上调，而NC (阴性对照)则无明显变化，表明CYCA-Luc呈泛素化依赖性途径降解。确定CYCA-Luc呈泛素依赖性途径降解后，本发明随后验证了该融合蛋白是否可以作为生物发光报告蛋白准确反映S期特异性抗肿瘤药物作用效果。使用目前临床常用的 S期特异性药物如5-氟尿嘧啶(5-FU)和羟基喜树碱(HCPT)作用U20S-CYCA-LUC细胞使其发生S期阻滞，通过荧光素酶活性分析和western blot检测确定是否可以引起细胞的荧光素酶相对强度升高和CYCA-Luc表达上调。结果显示5-FU和HCPT可使U20S-CYCA_Luc 细胞CYCA-Luc表达上调和荧光素酶相对强度升高，提示该蛋白可以用于监测S期特异性抗肿瘤药物活性。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果通过基因工程技术将S期特异性蛋白CyClinA2克隆于荧光素酶基因上游，形成重组表达载体pGL3-CYCA-Luc。通过上述研究工作，将融合蛋白CYCA-Luc作为监测S期的生物发光报告蛋白。该报告蛋白可受泛素化依赖性的蛋白体系调控，可在培养的细胞株中通过光学信号变化准确反映S期特异性抗肿瘤药物作用效果。该发明应用活体小动物后，利用活体成像系统可实现在体条件下实时、反复、非侵袭性地研究S期特异性抗肿瘤药物，从而避免传统方法中需要处死实验动物等诸多局限。因此，该发明不仅可以加速药物的研发速度，快速优化新的治疗方案，降低在研发药物上所用动物的数量，而且还可以对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估，对于S期特异性抗肿瘤药物的筛选及其作用机制研究具有重要意义。


图1 :pGL3-CYCA-Luc构建及酶切鉴定。其中A: pGL3-CYCA_Luc构建示意图；B: pGL3-CYCA-Luc 酶切结果。图2 :pGL3-CYCA-Luc在U20S细胞中表达。其中A western blot结果；B 荧光素酶活性分析结果。图3 细胞周期同步化分析。其中A 流式分析结果；B western blot结果；C 焚光素酶活性分析结果。图4 ⑶C20小分子干扰实验结果。其中A western blot结果；B 荧光素酶活性分析结果。图5 =S期特异性抗肿瘤药物作用实验。其中A western blot结果；B 荧光素酶活性分析。
具体实施例方式(一)构建真核重组表达载体pGL3-CYCA_Luc
1.引物设计利用primer软件设计一对引物。在上游引物5’端加入保护碱基、 HindIII酶切位点及Kozak序列，下游引物5’端加入保护碱基和HindIII酶切位点。整理好的引物序列送宝生物工程(大连)有限公司合成。2. PCR扩增目的片段反应体系50 μ , Premix ExTaq 25 μ ；模板 (PBS-cyclinA2) 5 μ ；引物 1 20 Mm, 1. 5 μ ；引物 2 20 Mm, 1. 5 μ ；灭菌水 17 μ 。充分混勻后，在 PCR 仪上完成下列操作94°C 5 min,98°C 10 s，56°C 30 s，72°C 1 min，30 cycles。3.质粒及PCR产物的酶切与回收总体系20 μ , Hind III 1 μ , 10 X Mbuffer 2 μ ，PCR产物或质粒DNA<1 Pg，灭菌水补齐至20 μ 。4.线性质粒的去磷酸化反应总体系50 μ , DNA Fragments in TE Buffer 5 pmol, 10 X ALKaline, Phosphatase Buffer 2 μ , dH20 up to 50 PL，37°C 反应 30 min, DNA回收试剂盒回收反应产物，20 μ TE Buffer溶解沉淀。5. PCR产物与目的片段的连接总体系25 μ , Τ4 DNA连接酶1 μ ，10 X Mbuffer 2 μ ，PCR 产物 0.3 pmol, pGL3-control 0. 03 pmol，灭菌水补齐至 25 PL，4°C过
夜连接。6.转化至感受态细胞将-80 V下保存的100 μ 感受态细胞置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均勻悬浮；加入1 PLpGL3-control质粒，DNA浓度为0.5 μβ/μ ，轻轻混勻；冰上放置30 min ；42 °C水浴热激90 s ；冰上放置5 min ；加ImL无Amp的LB 培养液，37 V培养60 min，使细菌恢复正常生长状态；室温下4000 rpm离心5 min，用枪头吸掉1 mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮；将细菌涂布在Amp/LB琼脂平板上， Amp工作浓度100；37 °C正向放置1 h，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置培养过夜。7.质粒的小量提取、酶切鉴定及测序详细步骤见TaKaRa公司MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0产品说明书。酶切步骤如下
第一组总体系 20 μ L,DNA 3 yL, 10 X Buffer 2 yL，无菌水 15 μ L ；第二组总体系 20 μ L,DNA 3 yL, 10 X Buffer 2 μ L,NheIl μ L, 14 μ L无菌水；第三组总体系20 μ L, DNA 3 μ L, 10 X Buffer 2 μ L，NcoIl μ L, 14 μ L 无菌水；第四组总体系 20 μ L, DNA 3 μ L, 10 X Buffer 2 μ L，NcoIl μ L，NheIl μ L, 13 μ L 无菌水。轻轻混勻， 37 V酶切2 h，结果见图1。提取质粒送至公司测序，测序结果显示DNA序列及插入方向正确，表明成功构建重组表达载体pGL3-CYCA-Luc。(二)建立U20S-CYCA-Luc稳定转染株细胞
将构建好的pGL3-CYCA-Luc质粒以脂质体法瞬时转染U20S细胞，具体方法为将 U20S细胞培养于六孔培养板至汇合70%左右；根据Lipofectamine 2000的说明书加 8. 0 μ g pGL3-CYCA-Luc 质粒及 20 yL 的 Lipofectamine 2000 进行转染。转染 48 h 后消化细胞，RLB裂解，制备蛋白样品，通过Western blot鉴定融合蛋白表达。结果显示， 使用荧光素酶和CyClinA2的抗体在110 KD位置均可发现特异性条带，而未转染细胞则未见条带，表明融合蛋白已在稳定转染株细胞表达。体外荧光素酶活性分析结果显示稳定转染株细胞荧光素酶表达活性比对照细胞高4000倍左右，如图2所示。这些结果表明，我们构建的真核重组表达载体可在哺乳动物细胞中表达融合蛋白。为获得稳定表达融合蛋白的细胞，本发明中使用1000 Pg/mL浓度的G418对转染细胞进行了筛选。由于pGL3-CYCA-Luc质粒无G418抗性基因Neo，因此在转染 pGL3-CYCA-Luc质粒同时需共转染pcDNA3. 1质粒，该质粒含Neo基因。具体转染的方法为首先，在EP管中加入500 μ 无血清培养基，然后加入15 μ Lipo 2000(Invitrogen 公司)转染试剂，轻轻混勻后，室温下静置5 min0取12 μg质粒，其中含有pcDNA3. 1和 pGL3-CYCA-Luc两种质粒，二者比例为1 10，加入以上的混合物中，轻轻混勻。室温下静置 20 min后，取以上混合物加入培养皿中，置于5% CO2、湿度95%和37°C条件下培养。 24 h后，把培养皿中的培养液换为含有G418的常规DMEM培养液进行筛选。待对照细胞即未转染质粒的细胞被全部被杀死后，将细胞置于药物浓度为800 Pg/mL的DMEM培养液中继续培养。在上述条件下，细胞能够持续生长，表明稳定转染细胞株已被成功建立。建立的细胞株用于进一步分析使用。(三)在培养细胞株研究融合蛋白CYCA-Luc是否报告S期。1.细胞周期同步化在60mm的培养皿中加适量的U20S-CYCA_Luc细胞，将细胞培养至指数生长期的早期，密度约为50%左右；弃掉培养基，加入含0.2 mmol mimosine (sigma公司)的培养基继续培养20 h ；弃掉含mimosine的培养基，用PBS液洗2次，换普通培养基继续培养；在更换培养基后的0、3、6、9、12 h各时间点收获细胞样品用于流式分析细胞周期。2.流式分析细胞周期将上述收获的细胞用PBS洗二遍；用70%的冰浴酒精过夜固定；离心去乙醇，PBS清洗一次；每管细胞样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液(碧云天)，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37°C避光温浴30 min。流式检测和分析。实验结果表明， 随着释放时间的延长，S期细胞所占比例逐渐增加，如图3所示。3.荧光素酶活性分析和Western blot检测将上述收获的细胞用PBS洗二次后转至ImL EP管中；每个样品中加入100 μ RLB裂解液，制备蛋白样品；BCA法测定蛋白浓度，将蛋白浓度调至相等，利用荧光发光仪(lumat LB 9507，BERTHO⑶公司)检测荧光素酶相对活性及Western blot检测融合蛋白表达，以确定该报告蛋白是否在S期积聚。结果显示，mimosine处理细胞20 h后，随着释放时间的延长荧光素酶相对强度和CYCA-Luc 表达量均逐渐增加，说明报告蛋白的表达的变化与S期细胞数量的变化相一致，如图3所
7J\ ο4.确定CYCA-Luc是否受泛素化依赖性降解调控。细胞周期进入有丝分裂期后，CyClinA2被APCede2tl,即E3连接酶复合物降解， 所以这一降解的过程属泛素化依赖性。这一内容中主要探讨CDC20基因沉默后，能否引起CYCA-Luc重新积聚以确定本发明的融合蛋白CYCA-Luc降解途径是否依赖APCdc^活性。首先用DEPC水处理相关实验用品，在60 mm培养皿中加入适量的U20S-CYCA_Luc 细胞；根据 Lipofectamine2000 Gnvitrogen 公司)的说明书加入 200 pmol siRNA 及 10 μ L的Lipofectamine 2000进行转染；48 h后用RLB裂解液裂解细胞；利用BCA法测蛋白浓度，蛋白样品分两部分，一部分用做荧光素酶活性检测，一部分用做western blot 分析。结果显示，利用siRNA干扰⑶C20后，CYCA-Luc的表达上调、荧光素酶相对强度增强，表明CYCA-Luc通过⑶C20介导的泛素化依赖性途径降解，如图4所示。⑶C20 siRNA 序列如下
Scramble siRNA:
Sense5' -UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶TT-3‘
Anti-Sense 5' -AC⑶GACACGUUCGGAGAATT-3‘ CDC20 siRNA:
Sense5' -GGGAAUAUAUAUCCUCU⑶TT-3‘
Anti-Sense 5’ -ACAGAGGAUAUAUAUUCCCTT-3， (四)验证S期靶向药物是否诱导融合蛋白CYCA-Luc表达上调为进一步确定本发明的融合蛋白CYCA-Luc是否可以作为生物发光报告蛋白用于筛选细胞周期S期特异性药物，本发明利用目前临床上使用的S期特异性药物，如5-FU和 HCPT处理U20S-CYCA-Luc细胞，并进行荧光素酶活性分析和Western blot检测，以确定 S期靶向药物对CYCA-Luc蛋白表达的影响。M期特异性药物紫杉醇(PTX)在这一实验中作为阴性对照药物。首先用1 Pg/mL的5-FU、HCPT或50 nM的PTX处理U20S-CYCA_Luc 细胞，18 h后收集细胞样品，流式分析细胞周期，检测两种药物对细胞周期分布的影响。收集的另一部分细胞利用RLB裂解液进行裂解，BCA法测定蛋白浓度后进行荧光素酶活性和Western blot检测。流式分析结果显示，5-FU和HCPT处理细胞18 h后，S期细胞数量明显增加，而PTX则使S期细胞数量明显降低。荧光素酶活性分析和Western blot检测结果显示，5-FU和HCPT处理细胞18 h后可使荧光素酶相对强度增加和CYCA-Luc表达上调，而PTX则使荧光素酶相对强度降低和CYCA-Luc表达下调，如图5所示。上述结果提示，细胞周期S期特异性抗肿瘤药物作用U20-CYCA-Luc细胞后可使融合蛋白CYCA-Luc 表达上调和荧光素酶相对强度增加，表明该融合蛋白可作为生物发光报告蛋白用于指示细胞周期S期并用于细胞周期S期特异性抗肿瘤药物筛选。
权利要求
1. 一种监测DNA合成期生物发光报告基因，其特征在于将细胞周期蛋白A2与荧光素酶基因融合，从而形成一种可以用于监测细胞周期S期的生物发光报告基因，其核苷酸序列为AAGCTTGCCACCATGTTGGGCAACTCTGCGCCGGGGCCTGCGACCCGCGAGGCGGGCTCGGCGCTGCTAGCA TTGCAGCAGACGGCGCTCCAAGAGGACCAGGAGAATATCAACCCGGAAAAGGCAGCGCCCGTCCAACAACCGCGGAC CCGGGCCGCGCTGGCGGTACTGAAGTCCGGGAACCCGCGGGGTCTAGCGCAGCAGCAGAGGCCGAAGACGAGACGGG TTGCACCCCTTAAGGATCTTCCTGTAAATGATGAGCATGTCACCGTTCCTCCTTGGAAAGCAAACAGTAAACAGCCT GCGTTCACCATTCATGTGGATGAAGCAGAAAAAGAAGCTCAGAAGAAGCCAGCTGAATCTCAAAAAATAGAGCGTGA AGATGCCCTGGCTTTTAATTCAGCCATTAGTTTACCTGGACCCAGAAAACCATTGGTCCCTCTTGATTATCCAATGG ATGGTAGTTTTGAGTCACCACATACTATGGACATGTCAATTGTATTAGAAGATGAAAAGCCAGTGAGTGTTAATGAA GTACCAGACTACCATGAGGATATTCACACATACCTTAGGGAAATGGAGGTTAAATGTAAACCTAAAGTGGGTTACAT GAAGAAACAGCCAGACATCACTAACAGTATGAGAGCTATCCTCGTGGACTGGTTAGTTGAAGTAGGAGAAGAATATA AACTACAGAATGAGACCCTGCATTTGGCTGTGAACTACATTGATAGGTTCCTGTCTTCCATGTCAGTGCTGAGAGGA AAACTTCAGCTTGTGGGCACTGCTGCTATGCTGTTAGCCTCAAAGTTTGAAGAAATATACCCCCCAGAAGTAGCAGA GTTTGTGTACATTACAGATGATACCTACACCAAGAAACAAGTTCTGAGAATGGAGCATCTAGTTTTGAAAGTCCTTA CTTTTGACTTAGCTGCTCCAACAGTAAATCAGTTTCTTACCCAATACTTTCTGCATCAGCAGCCTGCAAACTGCAAA GTTGAAAGTTTAGCAATGTTTTTGGGAGAATTAAGTTTGATAGATGCTGACCCATACCTCAAGTATTTGCCATCAGT TATTGCTGGAGCTGCCTTTCATTTAGCACTCTACACAGTCACGGGACAAAGCTGGCCTGAATCATTAATACGAAAGA CTGGATATACCCTGGAAAGTCTTAAGCCTTGTCTCATGGACCTTCACCAGACCTACCTCAAAGCACCACAGCATGCA CAACAGTCAATAAGAGAAAAGTACAAAAATTCAAAGTATCATGGTGTTTCTCTCCTCAACCCACCAGAGACACTAAA TCTGCAAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGC CATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGA ACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGC AGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTA TGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTC AACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAA AAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGT TCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATT GCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAG ATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCC ATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAA GAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTT CGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTA AGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACA TCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAA GGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTA TGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATA GCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGT GGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGAT TACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCT TACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAA。
2.一种重组表达载体pGL3-CYCA-Luc，该载体含有权利要求1所述核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于该载体在以细胞周期S期为靶点的抗肿瘤药物筛选中的应用。
全文摘要
本发明涉及分子生物学基因合成，主要涉及一种监测DNA合成期生物发光报告基因，本发明还涉及该基因在抗肿瘤药物筛选的应用。本发明以包含人cyclinA2基因全长的PBS质粒为模板，在cyclinA2基因两端设计引物，扩增cyclinA2cDNA全长并克隆至pGL3-control载体Luc基因的5’端，形成一种可表达融合蛋白的真核重组表达载体，即“pGL3-CYCA-Luc”载体。该载体稳定转染至肿瘤细胞后可表达融合蛋白“CYCA-Luc”。体外实验证明该融合蛋白通过泛素化依赖性途径降解，可呈细胞周期依赖性变化并可用于监测S期特异性抗肿瘤药物作用效果。本发明在筛选针对S期的抗肿瘤药物等领域中发挥重要作用。
文档编号C12N15/62GK102358905SQ201110312909
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者张国君, 赵瑞君, 陈志鸿 申请人:汕头大学医学院, 牡丹江医学院