在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体，尤其是在体内具有抗肿瘤活性的 抗人Dlk-1抗体。另外本发明涉及产生该抗体的杂交瘤和该抗体的用途。
【背景技术】
[0002] 人D化-1 (delta-likeIhomolog(Drosophila) ; 5 样 1 同源物（果禍）；W下也称 为"hD化-1")是全长为383个氨基酸残基的单次跨膜型的1型膜蛋白，其在细胞外区域具 有6个EGF样基序。其细胞外区域与Notch/Delta/Serrate家族显示出同源性。hD；Lk-l基 因作为在GRP(gastrinreleasingpeptide,胃泌素释放肤）应答性的肺小细胞癌来源的细 胞株中表达的分子（非专利文献1)或作为抑制前脂肪细胞分化的因子被克隆（非专利文 献2)。hD化-1由于与作为细胞分化控制因子的Notch受体的配体5的氨基酸序列具有同 源性，通常用DLK1该样的基因标识来命名，此外，虽然具有Pref-1 (非专利文献2)、pG2 (非 专利文献3)、SCP-1 (非专利文献4)和Z0G(非专利文献5)多个基因标识，但它们基本是同 一分子。
[000引而且，hD化-1的细胞外区域的细胞膜附近被一种尚未鉴定的蛋白酶切断，并分 泌到血液中。游离hD化-1化1)化-1细胞外区域）与225~262个氨基酸残基的被称为 FA-l(Fetalantigen-1，胎儿抗原-1)(非专利文献6)的糖蛋白质是同一分子。
[0004] hD化-1基因及其基因产物在未分化的增殖能力高的胚胎细胞中显示出高表达。尤 其是，在胚胎肝脏、胚胎肾脏、胚胎骨骼肌、胚胎脑等中显示出高表达，但出生后，在大部分 组织中没有发现表达，在正常的成体组织中，表达局限于肾上腺、胎盘、垂体中（专利文献 1、非专利文献2)。
[0005] 而且，即使在成体组织中，在被认为是未分化的干细胞和前体细胞的细胞中 也发现了hD化-1的表达。例如，hD化-1在成体肝脏中未分化的具有多向分化潜力 (multilineagepotential)的肝卵圆细胞（非专利文献7、8)、骨/软骨/脂肪细胞的干细 胞即间充质干细胞（非专利文献9)和前列腺的基底细胞层的前列腺上皮前体细胞（非专 利文献18)中的表达已有报道。另外，据报道；在小鼠的间充质干细胞中，游离Dlk-1(小鼠 D化-1细胞外区域）使E服/MAP激酶活化，诱导Sox-9的表达，从而抑制向脂肪细胞的分化， 同时诱导向软骨细胞的分化，但它们对向成骨细胞的分化和软骨细胞的成熟产生抑制（非 专利文献19、20)。该些提示hDlk-1与组织干细胞的性质、例如未分化能力的维持等相关。
[0006] hD化-1的该种局限于胎儿期的细胞和干细胞中表达的模式，W及具有EGF样基序 的基因/基因产物的家族（Notch受体，Notch配体（5 ,Jagged,serrate)等）一般通过 EGF样基序介导的细胞间相互作用来控制细胞的增殖和分化，由此提示hD化-1也具有该种 功能。事实上，已知随着脂肪前体细胞的分化而表达降低，而且若在脂肪前体细胞中强制表 达hD化-1基因，则脂肪分化被抑制（非专利文献2)。但是，目前，与hD化-1相互作用的分 子（配体）的详细情况尚不清楚。
[0007] 另一方面，据报道hD化-1基因及其基因产物在各种癌和肿瘤中也W高频率表达。 迄今为止，作为已确认其表达的癌的种类，在实体癌中，已知有神经内分泌肿瘤、神经母细 胞瘤、神经胶质瘤、1型神经纤维瘤病、小细胞肺癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、大肠癌、乳腺癌和膜 脏癌（专利文献1、2、4、5和非专利文献1、3、10、11、12、13、14、21)，在血癌中，已知有骨髓 发育异常综合征（专利文献3和非专利文献15、16)和急性髓系白血病（非专利文献16)。 据报道如果在红白血病细胞株（e巧t虹ole址emia)K562细胞中导入hD化-1基因，贝Ij细胞增 殖受到促进（非专利文献16)，同样，如果在成胶质细胞瘤细胞中导入hD化-1基因，不仅细 胞增殖被促进，而且细胞的接触抑制也丧失，获得销着非依存性的（anchorage-dependent) 细胞增殖能力，该提示hD化-1与致癌之间的关联性（非专利文献17)。
[0008] W往，针对人的肝癌细胞，作为在体外在补体存在下显示出细胞毒性的抗hD化-1 单克隆抗体，已知作为大鼠抗hD化-1单克隆抗体的1CU4C4和31C4(克隆名）（专利文献 1)，另一方面，还已知该些克隆抗体不显示体内（人癌细胞荷瘤小鼠中的治疗模型）的抗肿 瘤活性（肿瘤生长抑制活性）（专利文献4、5)。
[0009] <专利文献>
[0010] 专利文献 1 ;W0 2005/052156
[0011] 专利文献 2 ;W0 02/081625
[0012] 专利文献3 :日本特开2001-269174号
[0013] 专利文献 4 ;W0 2008/056833
[0014] 专利文献 5 ;W0 2009/116670
[0015] <非专利文献>
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[0020] 非专利文献 5 ;Halder,S.K.etal. ,Elndocrinology,vol. 139,p. 3316-3328 (1998) [00引]非专利文献 6Jay,T.N.etal. ,Eur.J.Obstet.Gynecol.Reprod. Biol. ,vol. 29,p. 73-85(1988)
[0022] 非专利文献 7:Tanimizu,N.eta1 . ,GeneExpression 化tterns,vol. 5,p. 209-218 (2004)
[0023] 非专利文献 8 ;Jensen,CH.etal. ,Am.J.Pathol. ,vol. 164 (4) ，p. 1:347-1359(2004)
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[0032]非专利文献 17 ;Yin,D.etal. ,Oncogene,vol. 25 (13),p. 1852-1861 (2006)
[0033]非专利文献 18 ;Ceder,J.A.etal.，化r.化ol.，Vol. 54 化），pl：M4-1353 (2008)
[0034]非专利文献 19 ;Sul,服.，Mol.化docrinol.，vol. 23(ll)，pl717-1725(2009)
[00巧]非专利文献 20 ;Wang，Y.etal.，Mol.CellBiol.,vol. 30(14)，p：M80-3492 (2010)
[0036]非专利文献 21 ;Yanai,H.etal. ,J.Biochem. ,vol. 148 (1),p85_92 (2010)
【发明内容】
[0037] 如上所述，在正常组织中，hD化-1的表达局限于胎儿期的细胞或干细胞；癌组织 中，hD化-1则在各种肿瘤中高频率表达，并且hD化-1是细胞膜蛋白/分泌蛋白，由此认为 hD化-1在各种肿瘤的治疗等中是好的祀标。并认为W该hD化-1为祀标时，抗hD化-1抗体 是有用的。另外，例如为了用作癌治疗用抗体，更理想的是，在使用了人癌细胞的荷瘤小鼠 治疗模型中通过抗体单独给药而显示出显著的抗肿瘤活性，而且，在液剂处方中和人或猴 的血中具有稳定的抗原结合活性的保持能力。
[0038] 因此，本发明要解决的问题在于提供具有抗肿瘤活性的抗hD化-1抗体，具体来说 是在体内具有抗肿瘤活性的抗hD化-1单克隆抗体、尤其是该抗体为人源化抗体。另外，还 在于提供产生该抗体的杂交瘤、该抗体与药剂的复合体等。此外，在于提供使用上述抗体或 上述复合体等的、肿瘤的诊断用或治疗用药物组合物、肿瘤细胞的细胞调亡诱导用药物组 合物、肿瘤治疗剂、肿瘤诊断剂、肿瘤细胞的细胞调亡诱导剂、肿瘤的治疗方法、肿瘤的检测 方法、肿瘤细胞的细胞调亡诱导方法、肿瘤的检测用或诊断用试剂盒、W及肿瘤细胞的细胞 调亡诱导用试剂盒等。
[0039] 本发明人为了解决上述问题进行了积极的研究。结果发现了与hD化-1特异性反 应的抗体（尤其是抗hDlk-1单克隆抗体），该抗体具有抗肿瘤活性（尤其是人源化抗体）， 并确认了它们在体内具有抗肿瘤活性。另外，该种抗体在人源化抗体的制作中得W成功。此 夕F，还发现该些抗体和复合体对于肿瘤的治疗、诊断和检测、W及肿瘤细胞的细胞调亡诱导 有用，从而完成了本发明。
[0040]目P，本发明如下所述。
[0041] (1) 一种抗人〇化-1的抗体，其中，H链V区域的氨基酸序列包含序列号35、40、69、 73、77、81、85和89中的任一者所示的氨基酸序列，L链V区域的氨基酸序列包含序列号45 所示的氨基酸序列。
[004引上述（1)的抗体，例如，可W举出在体内具有抗肿瘤活性的抗体。此处，作为肿瘤， 例如，可W举出选自由人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌、人膜脏癌、人小细胞肺癌和人神经母细 胞瘤组成的组中的至少1种。
[004引上述（1)的抗体，例如，可W举出人源化抗体。
[0044]上述（1)的抗体，例如，可W举出单克隆抗体。
[004引上述（1)的抗体，例如，可W举出与序列号2所示的人D化-1的氨基酸序列中的包 含第24位~第91位氨基酸的区域的至少一部分结合的抗体。
[004引似一种抗体片段，其来源于上述（1)的抗体。
[0047]上述似的抗体片段，例如，可W举出含有序列号35、40、69、73、77、81、85和89中 的任一者所示的氨基酸序列的抗体片段、和含有序列号45所示的氨基酸序列的抗体片段、 W及含有序列号35、40、69、73、77、81、85和89中的任一者所示的氨基酸序列和序列号45 所示的氨基酸序列的抗体片段。
[004引做一种抗体-药剂复合体，其含有上述（1)的抗体和具有抗肿瘤活性和/或细胞 杀伤活性的化合物。
[0049] (4) -种抗体片段-药剂复合体，其含有上述（2)的抗体片段和具有抗肿瘤活性和 /或细胞杀伤活性的化合物。
[0050] 妨一种药物组合物，其含有选自由上述（1)的抗体、上述似的抗体片段、和上述 (3)或（4)的复合体组成的组中的至少1种。
[0051] 上述巧）的药物组合物，例如，可W举出用于肿瘤的治疗的药物组合物，尤其可W 举出没有体重减少的副作用的药物组合物。另外，上述巧）的药物组合物，例如，可W举出 用于肿瘤的诊断的药物组合物。此外，上述巧）的药物组合物，例如，可W举出用于肿瘤细 胞的细胞调亡诱导的药物组合物。
[005引做一种肿瘤治疗剂，其含有选自由上述（1)的抗体、上述似的抗体片段、和上述 (3)或（4)的复合体组成的组中的至少1种。
[0053] 上述化）的肿瘤治疗剂，例如，可W举出没有体重减少的副作用的肿瘤治疗剂。
[0054] (7) -种肿瘤细胞的细胞调亡诱导剂，其含有选自由上述（1)的抗体、上述似的 抗体片段、和上述（3)或（4)的复合体组成的组中的至少1种。
[0055]此处，在上述巧）的药物组合物、上述化）的肿瘤治疗剂、和上述（7)的细胞调亡 诱导剂中，作为肿瘤，例如，可W举出选自由人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌、人膜脏癌、人小细 胞肺癌和人神经母细胞瘤组成的组中的至少1种。
[005引做一种肿瘤的治疗方法，其包括向患者给药选自由上述（1)的抗体、上述似的 抗体片段、和上述（3)或（4)的复合体组成的组中的至少1种。
[0057] 上述巧）的治疗方法，例如，可W举出在患者中没有体重减少的副作用的治疗方 法。
[0058] (9) 一种肿瘤的检测方法，其包括；使选自由上述（1)的抗体、上述（2)的抗体片 段、和上述（3)或（4)的复合体组成的组中的至少1种与从生物体采集的试样反应，检测反 应的抗体和/或抗体片段的信号。
[0059] (10) -种肿瘤细胞的细胞调亡诱导方法，其包括使选自由上述（1)的抗体、上述 (2)的抗体片段、和上述（3)或（4)的复合体组成的组中的至少1种与从生物体采集的试样 反应，检测反应的抗体和/或抗体片段的信号。
[0060] 此处，在上述巧）的治疗方法、上述（9)的检测方法、和上述（10)的细胞调亡诱导 方法中，作为肿瘤，例如，可W举出选自由人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌、人膜脏癌、人小细胞 肺癌和人神经母细胞瘤组成的组中的至少1种。
[006。（11) 一种肿瘤的治疗用、诊断用或检测用试剂盒，其含有选自由上述（1)的抗体、 上述（2)的抗体片段、和上述（3)或（4)的复合体组成的组中的至少1种。
[006引（。）一种肿瘤细胞的细胞调亡诱导用试剂盒，其含有选自由上述（1)的抗体、上 述（2)的抗体片段、和上述（3)或（4)的复合体组成的组中的至少1种。
[0063] 此处，在上述（11)和（12)的试剂盒中，作为肿瘤，例如，可W举出选自由人大肠 癌、人乳腺癌、人肝癌、人膜脏癌、人小细胞肺癌和人神经母细胞瘤组成的组中的至少1种。
【附图说明】
[0064] 图1是表示小鼠抗hD化-1单克隆抗体克隆BA-1-3D的H链（重链）可变区（VH) 的cDNA碱基序列（序列号12)和推定氨基酸序列（序列号13)的图。氨基酸残基用一 个字母标记表示，信号肤（从该推定氨基酸序列的N末端起19个氨基酸构成的肤）用西 文斜体字表示。画了双下划线的谷氨