专利名称：在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体，尤其是在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体。另外本发明涉及产生该抗体的杂交瘤和该抗体的用途。
背景技术：
人Dlk-1 (delta-like I homo log (Drosophila) ; δ 样 I 同源物(果妮)；以下也称为“hDlk-Ι”)是全长为383个氨基酸残基的单次跨膜型的I型膜蛋白，其在细胞外区域具有6个EGF样基序。其细胞外区域与Notch/Delta/Serrate家族显示出同源性。hDlk_l基因作为在GRP (gastrin releasing peptide,胃泌素释放肽)应答性的肺小细胞癌来源的细胞株中表达的分子(非专利文献I)或作为抑制前脂肪细胞分化的因子被克隆(非专利文献2)。hDlk-Ι由于与作为细胞分化控制因子的Notch受体的配体δ的氨基酸序列具有同源性，通常用DLKl这样的基因标识来命名，此外，虽然具有Pref-1 (非专利文献2)、pG2(非专利文献3)、SCP-1 (非专利文献4)和ZOG (非专利文献5)多个基因标识，但它们基本是同一分子。而且，hDlk-Ι的细胞外区域的细胞膜附近被一种尚未鉴定的蛋白酶切断，并分泌到血液中。游离hDlk-1 (hDlk-Ι细胞外区域)与225 262个氨基酸残基的被称为FA-1(Fetal antigen-1,胎儿抗原一 I)(非专利文献6)的糖蛋白质是同一分子。hDlk-Ι基因及其基因产物在未分化的增殖能力高的胚胎细胞中显示出高表达。尤其是，在胚胎肝脏、胚胎肾脏、胚胎骨`骼肌、胚胎脑等中显示出高表达，但出生后，在大部分组织中没有发现表达，在正常的成体组织中，表达局限于肾上腺、胎盘、垂体中(专利文献1、非专利文献2)。而且，即使在成体组织中，在被认为是未分化的干细胞和前体细胞的细胞中也发现了 hDlk-Ι的表达。例如，hDlk-Ι在成体肝脏中未分化的具有多向分化潜力(multilineage potential)的肝卵圆细胞(非专利文献7、8)、骨/软骨/脂肪细胞的干细胞即间充质干细胞(非专利文献9)中的表达已有报道，这提示其与这些组织干细胞的性质、例如未分化能力的维持等相关。hDlk-Ι的这种局限于胎儿期的细胞和干细胞中表达的模式，以及具有EGF样基序的基因/基因产物的家族(Notch受体，Notch配体(δ，Jagged, serrate)等)一般通过EGF样基序介导的细胞间相互作用来控制细胞的增殖和分化，由此提示hDlk-Ι也具有这种功能。事实上，已知随着脂肪前体细胞的分化而表达降低，而且若在脂肪前体细胞中强制表达hDlk-Ι基因，则脂肪分化被抑制(非专利文献2)。但是，目前，与hDlk-Ι相互作用的分子(配体)的详细情况尚不清楚。
另一方面，据报道hDlk-Ι基因及其基因产物在各种癌和肿瘤中也以高频率表达。迄今为止，作为已确认其表达的癌的种类，在实体癌中，已知有神经内分泌肿瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、I型神经纤维瘤病、小细胞肺癌、肝癌、肾癌和卵巢癌(专利文献1、2和非专利文献1、3、10、11、12、13、14)，在血癌中，已知有骨髓增生异常综合征(专利文献3和非专利文献15、16)和急性髓系白血病(非专利文献16)。据报道如果在红白血病细胞株(erythroleukemia) K562细胞中导入hDlk-Ι基因，贝U细胞增殖受到促进(非专利文献16)，同样，如果在成胶质细胞瘤细胞中导入hDlk-Ι基因，不仅细胞增殖被促进，而且细胞的接触抑制也丧失，获得锚着非依存性的(anchorage-dependent)细胞增殖能力，这提示hDlk-Ι与致癌之间的关联性(非专利文献17)。<专利文献>专利文献1:W0 2005/052156专利文献2:TO 02/081625专利文献3:日本特开2001-269174号<非专利文献>非专利文献I:Laborda, J.et al.，J.Biol.Chem.，vol.268 (6)，p.3817-3820(1993)
非专利文献2:Smas，C.M.et al., Cell, vol.73 (4) ,p.725-734 (1993)非专利文献3: He I man, L.J.et a1., Pr o c.Natl.Acad.Sc1.USA, vol.84, p.2336-2339 (1987)非专利文献4:Maruyama, K.et al., Unpublished, Genebank accession number D16847 (1993)非专利文献5:Halder, S.K.et al., Endocrinology, vol.139, p.3316-3328( 1998)非专利文献6:Fay, T.N.et al., Eur.J.0bstet.Gynecol.Reprod.Biol., vol.29, p.73-85 (1988)非专利文献7:Tanimizu, N.et a1., Gene ExpressionPatterns, vol.5, p.209-218 (2004)非专利文献8: Jensen, CH.et al., Am.J.Pathol., vol.164 (4)，p.1347-1359(2004)非专利文献9:Abdallah, B.M.et al., J.Bone Miner.Res., vol.19(5), p.841-852(2004)非专利文献10:Jensen, C.H.et al., Br.J.Dermatol., vol.140 (6), p.1054-1059(1999)非专利文献11 Jensen, C.H.et al., Tumour Biol., vol.20(5), p.256-262( 1999)非专利文献12:Yin, D.et al.，Int.J.0ncol.，vol.24 (4)，p.1011-1015 (2004)非专利文献13:Yin，D.et al., Oncogene, vol.25 (13)，p.1852-1861 (2006)非专利文献14:Fukuzawa, R.et al., J.Clin.Pathol., vol.58, p.145-150 (2006)非专利文献15:Miyazato, A.et al., Blood, vol.98, p.422-427 (2001)非专利文献16:Sakajiri, S.et al., Leukemia, vol.19 (8), p.1404-1410 (2005)非专利文献17:Yin，D.et al., Oncogene, vol.25 (13)，p.1852-1861 (2006)
发明内容
如上所述，在正常组织中，hDlk-Ι的表达局限于胎儿期的细胞或干细胞；癌组织中，hDlk-Ι则在各种肿瘤中高频率表达，并且hDlk-Ι是细胞膜蛋白/分泌蛋白，由此认为hDlk-Ι在各种肿瘤的治疗等中是好的靶标。并认为以该hDlk-Ι为靶标时，抗hDlk-Ι抗体是有用的。因此，本发明要解决的问题在于提供具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体，尤其是在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1单克隆抗体。而且，还在于提供产生该抗体的杂交瘤、该抗体与药剂的复合体、肿瘤的诊断用或治疗用药物组合物、肿瘤的检测方法、肿瘤的检测用或诊断用试剂盒。本发明人为了解决上述问题进行了积极的研究。结果发现了与人Dlk-1特异性反应的抗体(尤其是抗人Dlk-1单克隆抗体)，其具有抗肿瘤活性；以及该抗体与各种药剂的复合体(免疫结合物(immunoconjugate)),并确认了它们在体内具有抗肿瘤活性。而且，还发现这些抗体和复合体对于肿瘤的治疗、诊断和检测有用，从而完成本发明。即，本发明内容如下。( I)在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1的抗体。上述肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。在上述(I)的抗体中，抗肿瘤活性例如可以例举肿瘤血管生成抑制活性。上述(I)所述的抗体，例如，可以例举多克隆抗体和单克隆抗体。上述(I)所述的抗体，例如，可以例举H链V区域的⑶Rl 3的氨基酸序列依次分别为序列号30 32所示的氨基酸序列`、和/或L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列依次分别为序列号33 35所示的氨基酸序列。作为本发明的抗体，可以例举杂交瘤所产生的抗体、基因重组抗体等。所谓杂交瘤，是指使通过对人以外的哺乳动物免疫抗原而获得的B细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而获得的、产生具有所希望的抗原特异性的抗体的细胞。作为基因重组抗体，包括嵌合抗体(人源化嵌合抗体)、人化抗体、人抗体或它们的抗体片段等通过基因重组制备的抗体。基因重组抗体中，具有单克隆抗体的特征、抗原性低、血中半衰期延长的抗体优选作为治疗药。其中，作为嵌合抗体，例如，可以例举H链V区域的氨基酸序列由序列号23所示的氨基酸序列构成，L链V区域的氨基酸序列由序列号25所示的氨基酸序列构成。(2)由保藏号为FERM BP-10707的杂交瘤产生的抗人Dlk-1的单克隆抗体。(3)由保藏号为FERM BP-10899的杂交瘤产生的抗人Dlk-1的单克隆抗体。(4)由保藏号为FERM BP-10900的杂交瘤产生的抗人Dlk-1的单克隆抗体。上述(I) (4)中所述的抗体，例如，可以例举与序列号2所示的人Dlk-1的氨基酸序列中的第26位 第85位的氨基酸构成的区域、第92位 第167位的氨基酸构成的区域、或第131位 第244位的氨基酸构成的区域中的至少一部分结合(识别该部分)的抗体。(5)作为上述(I) (4)中所述的抗体，例如，可以例举与由保藏号为FERMBP-10707、FERM BP-10899或FERM BP-10900的杂交瘤所产生的单克隆抗体所结合(识别)的部位(例如表位)结合的抗体。(6)来源于上述(I) (5)中任意一项所述的抗体的抗体片段。上述(6)所述的抗体片段，可以例举例如含有序列号30 32所示的氨基酸序列的抗体片段，具体而言可以例举含有序列号23所示的氨基酸序列的抗体片段。上述(6)所述的抗体片段，例如，可以例举含有序列号33 35所示的氨基酸序列的抗体片段，具体而言可以例举含有序列号25所示的氨基酸序列的抗体片段。(7)产生上述(I)所述的抗体的杂交瘤。(8)保藏号为FERM BP-10707的产生抗人Dlk-1的单克隆抗体的杂交瘤。(9)保藏号为FERM BP-10899的产生抗人Dlk-1的单克隆抗体的杂交瘤。(10)保藏号为FERM BP-10900的产生抗人Dlk-1的单克隆抗体的杂交瘤。(11)含有上述(I) (5)中任意一项所述的抗体和具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物的抗体-药剂复合体。(12)含有上述(6)所述的抗体片段和具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物的抗体片段-药剂复合体。 在上述(11)和(12 )所述的复合体中，肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。在上述(11)和(12)所述的复合体中，抗肿瘤活性例如可以例举肿瘤血管生成抑制活性。(13)含有选自于由上述(I) (5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少I种的药物组合物。上述(13)所述的组合物例如可以例举用于肿瘤的治疗的组合物，作为肿瘤的治疗，例如，可以例举抑制肿瘤血管生成。而且，该组合物可以例举例如没有体重减少的副作用的组合物。上述(13)所述的组合物可以例举例如用于肿瘤的诊断的组合物。在上述(13)所述的组合物中，肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。(14)含有选自于由上述(I) (5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少I种的肿瘤治疗剂。上述(14)所述的治疗剂，例如，可以例举没有体重减少的副作用的治疗剂。在上述(14)所述的治疗剂中，肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。(15)含有选自于由上述(I) (5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少I种的肿瘤血管生成抑制剂。上述(15)所述的抑制剂，例如，可以例举没有体重减少的副作用的抑制剂。上述(15 )所述的抑制剂中，肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。(16)含有选自于由上述(I) (5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少I种的肿瘤诊断剂。
上述(16)所述的诊断剂中，肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。(17)—种肿瘤的检测方法,其特征在于,使选自于由上述(I) (5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少I种与从生物体采集的试样反应，检测反应的抗体的信号。上述肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。(18)—种肿瘤的诊断和/或治疗方法，其包括向患者给予选自于由上述(I) (5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少I种，或给予上述(13)的药物组合物。上述肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。作为上述(18)的方法，例如，可以例举通过阻碍或抑制肿瘤的血管生成而进行肿瘤治疗的方法。(19)肿瘤的诊断用和/或治疗用的上述(I) (5)中任意一项所述的抗体、上述
(6)所述的抗体片段、或上述(11)或(12)所述的复合体。上述肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。(20)上述(I) (5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段、或上述(11)或(12)所述的复合体在制备用于诊断和/或治疗肿瘤的药物中的用途。上述肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。(21)含有选自于由上述(I) (5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少I种的肿瘤的检测用、诊断用或治疗用试剂盒。上述肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。
图1是表示在使用表达hDlk-Ι的肝癌细胞株(Huh-7-hDlk细胞)的异种移植治疗(Xenograft Treatment)模型中，给予公知的(W0 2005/052156)抗hDlk-Ι单克隆抗体3个克隆(1C1、4C4、31C4)时的结果的图。各抗体在第I天(Dayl)、第4天(Day4)、第7天(Day7)和第10天(DaylO)共计4次(箭头)进行腹腔内给药。A:大鼠 IgG (对照组)(#),1C1 (O)B:大鼠 IgG (对照组)(#),4C4 (O)
C:大鼠 IgG (对照组)(#),31C4 (O)在A C中，各组的个体数用N表示，各测定值(肿瘤体积)用平均值土标准误差表示。这些实验至少进行3次独立的实验。任意一个情况下，对于在裸小鼠皮下建立的肝癌都看不到抗肿瘤活性。
图2是在使用Huh-7-hDlk细胞的异种移植治疗模型中，评价新抗hDlk_l单克隆抗体克隆D1-2-14 (小鼠IgGl)的抗肿瘤活性的图。A:经时表示对照组(小鼠IgG)和D1-2-14给药组的肿瘤生长(平均值土标准误差)。箭头表示给予抗体(20mg/kg体重,腹腔内给药)。*P〈0.01 (通过Student’s t检验)B:A的试验中，把第14天(Dayl4)(实验最后一天)时各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。各图上所示的数值为平均值土标准误差。*P〈0.01 (通过Student’ S t检验)C:表示在独立的其它实验中评价D1-2-14的抗肿瘤活性的结果。*P〈0.01 (通过Student’ s t 检验)图3是在使用Huh-7-hDlk细胞的异种移植治疗模型中，评价A:克隆2-13 (大鼠 IgG2b)、B:克隆 BA-1-3D (小鼠 IgG2a)、C:克隆 D1-6 (小鼠 IgGl)、D:克隆 M3-1 (小鼠IgGl)的抗肿瘤活性的图。肿瘤体积用平均值土标准误差表示，星号表示差异显著性检验(*Ρ〈0.01, **Ρ〈0.05,通过 Student’ s t 检验)的结果。图4是表示抗hDlk-Ι单克隆抗体(克隆2-13)在采用表达hDlk-Ι的大肠癌细胞株(SW480-hDlk细胞)的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。将SW480-hDlk细胞移植到裸小鼠皮下，建立大肠癌组织。在箭头指示的时间点进行腹腔内给予抗体(20mg/kg体重)。肿瘤体积用平均值土标准误差表示(*P〈0.01, **P〈0.05,通过Student’ s t检验)。图5是表示使用HEK293_hDlk细胞通过流式细胞术进行的抗hDlk_l单克隆抗体反应性的图。各图上所示的编号表示克隆编号。涂黑的部分是同种型对照抗体。黑线是抗hDlk-Ι单克隆抗体。图6是表示采用Huh-7-hDlk细胞通过流式细胞术进行的抗hDlk-Ι单克隆抗体的反应性的图。各图上所示的编号表示克隆编号。涂黑的部分是同种型对照抗体。黑线是抗hDlk-Ι单克隆抗体。
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图7是为分析抗hDlk-Ι单克隆抗体所识别的表位而制备的缺失了各EGF样基序的突变体的示意图。图8是表示克隆D1-2-14的表位分析的结果的图。A:在C0S-7细胞中通过脂质体瞬时导入所述hDlk-Ι基因的突变体基因，24 72小时后进行FAC S分析的图(左:小鼠IgGl、右:D1-2-14)。设门部分表示克隆D1-2-14所识别的各突变体表达细胞。B:是用阳性对照(抗hDlk-Ι多克隆抗体)和克隆D1-2-14对表达EGF (1-2)的C0S-7细胞的涂片标本进行免疫染色的照片。染成茶褐色的部分表示EGF (1-2)的表达。图9是表示克隆D1-6、BA-1-3D和2_13的表位分析的结果的图。A:是在C0S-7细胞中通过脂质体瞬时导入所述hDlk-Ι基因的突变体基因，24 72小时后进行FACS分析的图。设门部分表示各克隆识别的各突变体表达细胞。B:是用克隆D1-6、BA-1-3D和2-13对表达EGF (1-2)的C0S-7细胞的涂片标本进行免疫染色的照片。箭头表示的染成茶褐色的部分表示EGF (1-2)的表达。图10是表示克隆M3-1通过FACS进行表位分析的结果的图。在C0S-7细胞中通过脂质体瞬时导入所述hDlk-Ι基因的突变体基因，24 72小时后进行FACS分析的图。设门部分表示克隆D1-2-14所识别的各突变体表达细胞。图11是表示抗hDlk-Ι单克隆抗体结合抗原后的内化活性的分析结果的图。
A:使HEK293-hDlk细胞与抗hDlk_l单克隆抗体(克隆M3_l、M1-290和M3-4)反应(4°C，20分钟)，用PBS清洗2次后，于37°C进行图中所述时间的孵育。然后，使之与PE标记抗小鼠IgG反应，进行FACS分析。数值用相对值表示，所述相对值为以不孵育时(O分钟)的平均萤光强度作为100%时的相对值。B:是表示使 FITC 标记的克隆 M3-1 (FITC-M3-1)与 HEK293_hDlk 细胞反应(4°C，20分钟)，用PBS清洗2次后，于37°C下孵育120分钟时的平均萤光强度的变化的图。黑柱表示:像A那样，使未标记的M3-1与细胞反应后，于37°C下孵育120分钟，与PE标记的抗小鼠IgG反应时的平均萤光强度的变化。图12是表示罗丹明标记的抗hDlk-Ι单克隆抗体结合抗原后的内化活性的分析结果的图。A:是使 HEK-293-hDlk 细胞与罗丹明标记-M3-1 (Rho-M3_l)反应(4°C，20 分钟)，用PBS清洗2次后，立即制备涂片标本，用萤光显微镜观察Rho-M3-l的定位的照片。橙色所示的部分表示Rho-M3-l的定位,观察到在细胞膜中定位。B E:是使 Rho-M3-l (B)、Rho-D1-1 (C)、Rho-Ml-290 (D)和 Rho-M3_4 (E)与HEK293-hDlk细胞反应，用PBS清洗2次后，于37°C下孵育15分钟后，制备涂片标本，用萤光显微镜观察各克隆的定位的照片。观察到识别相同表位(EGF4-6)的Rho-M3-l和Rho-D1-1均进入到细胞内，以点状定位的样子。
图13是表示结合了阜草素(Saporin)的抗hDlk-Ι单克隆抗体对于Huh-7-hDlk细胞和SK-N-Fl细胞的细胞损伤活性的图。A:是表示对照(小鼠IgG-皂草素(IgG-SAP))和M3-1-SAP对Huh_7_hDlk细胞的效果的图。纵轴用相对值表示，所述相对值为以未添加时的细胞的存活率为100%时的相对值(N=3，平均值土标准偏差)。B:是表示对照(IgG-SAP)、M3-l-SAP 和 M1-290-SAP 对 SK-N-Fl 细胞的效果的图。图14是表示Huh-7-hDlk细胞的异种移植模型中，给予小鼠IgG (20mg/kg体重)、M3-1-SAP (5mg/kg体重)和M1-290-SAP (5mg/kg体重)时的、A:给药后的各小鼠的体重变化、B:小鼠存活率的图。值用平均值土标准偏差表示。箭头表示给予抗体时间。图15是表示Huh-7-hDlk细胞的异种移植模型中，腹腔内给予小鼠IgG(.；N=8)和M3-1-SAP (O:N=8)时的肿瘤生长抑制效果的图。箭头表示给予抗体时间。值用平均值土标准偏差表示(*Ρ〈0.01, **Ρ〈0.05,通过 Student’ s t 检验)。图16是表示Huh-7-hDlk细胞的异种移植模型中，肿瘤内给予A和B即小鼠IgG(.:N=5)和M3-1-SAP (O:N=5) (40 μ g)时的肿瘤生长抑制效果(A)和体重变化(B)的图和腹腔内给予C和D即PBS (.:N=4)和顺钼(Cisplatin) (O:N=4) (5mg/kg体重)时的肿瘤生长抑制效果(C)和体重变化(D)的图。在任意一张图中，箭头均表示给予抗体时间，值用平均值土标准偏差表示(*P〈0.01，#P〈0.05，通过Student’ s t检验)。图17是表示用抗hDlk-Ι抗体对人大肠癌组织阵列(Cybrdi公司制、CC05-01-001)进行免疫染色时的代表例的照片。茶褐色部分表示用抗hDlk-Ι抗体染色的癌组织。hDlk-Ι阴性是指如N0.48的切片(69岁男性，腺癌，阶段III)所示，完全没有观察到染色的区域的切片。N0.19 (55岁女性，腺癌，阶段II)显示出非常强的染色性，将显示出与N0.19同等的染色性的切片作为hDlk-Ι强阳性。另外，将N0.25 (75岁男性，腺癌，阶段II)所示那样的、可明确地确认为hDlk-Ι阳性但染色性弱的切片作为hDlk-Ι弱阳性。图18是表示用抗hDlk-Ι抗体对人乳腺癌组织阵列(Cybrdi公司制、CC08-02-002)进行免疫染色时的代表例的照片。茶褐色部分表示用抗hDlk-Ι抗体染色的
癌组织。照片上面部分是组织阵列中所含的正常乳腺组织被抗hDlk-Ι抗体染色时的照片。左:N0.07 (68岁女性，正常乳管；hDlk-l阴性)、右:N0.01 (43岁女性，正常乳腺小叶；hDlk-Ι弱阳性)。箭头表示hDlk-Ι弱阳性的部位。照片下面部分表示浸润性导管癌患者的照片。左:N0.08 (45岁女性，阶段II;hDlk-Ι阴性)，中央:N0.56 (28岁女性，阶段II ;hDlk_l弱阳性)，右:N0.20 (59岁女性，阶段II;hDlk-l强阳性)。图19是表示在Huh-7-dlk细胞异种移植治疗模型中，克隆D1-2-14的用量依赖性抗肿瘤活性的图。图20是表示在SK-N-Fl细胞异种移植治疗模型中，克隆DI_2_14的用量依赖性的抗肿瘤活性的图。A:表示开始给予抗体以后的肿瘤生长。肿瘤体积用平均值土标准误差表示(*Ρ〈0.01, **Ρ〈0.05,通过 Student’ s t 检验)。B:是表示给予抗体后第23天(Day23)时摘出的癌组织的重量的图。图21是表示克隆D1-2-14H链(重链)可变区(VH)的cDNA碱基序列(序列号22)和推定氨基酸序列(序列号23)的图。信号肽用西文斜体字表示。画了双下划线的谷氨酸(E)表示成熟肽的N末端氨基酸残基。CDR序列(下划线)按照Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH PublicationN0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定义。克隆D1-2-14VH的⑶Rl 3的氨基酸序列依次分别不于序列号30 32。图22是表示克隆D1-2-14L链(轻链)可变区(VL)的cDNA碱基序列(序列号24)和推定氨基酸序列(序列号25)的图。信号肽用欧文斜体字表示。画了双下划线的天冬氨酸(D)表示成熟肽的N末端氨基酸残基。⑶R序列(下划线)按照Kabat等人(1991 ;上述)的定义。克隆D1-2-14VL的⑶Rl 3的氨基酸序列依次分别示于序列号33 35。图23是表示克隆D1-2-14VH基因的碱基序列(序列号26)和氨基酸序列(序列号27)的图。5’末端添加了 SpeI位点，3’末端添加了 Hind III位点(分别添加了下划线。)。用欧文斜体字文字表示的碱基序列表示相当于内含子的序列。图24是表示克隆D1-2-14VL基因的碱基序列(序列号28)和氨基酸序列(序列号29)的图。在5’末端添加了 Nhe I位点，在3’末端添加了 EcoR I位点(分别添加了下划线。)。用欧文斜体字文字表示的碱基序列表示相当于内含子的序列。
图25是嵌合D1-2-14基因表达载体(pChD1-2-14)的概略图。该载体从SalI位点起顺时针地包括由人巨细胞病毒主要即刻早期动子(human cytomegalovirus (CMV)majorimmediate early promoter)和用于抗体重链基因的转录开始的增强子起始的重链翻译单元。接着CMV区域的是VH外显子、人Y I重链恒定区(夹着内含子地包含CH1、铰链区域、CH2和CH3的外显子)的基因序列和CH3，接着是mRNA加工的聚A位点。重链基因序列后存在由CMV启动子和增强子起始的轻链翻译单元，接着是与VL外显子和在上游有内含子部分的人K链恒定区的外显子(CL)以及K基因的聚A信号。该轻链基因后接SV40早期启动子、大肠杆菌来源的黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因(xanthine guaninephosphoribosyl transferase (gpt) gene)和含有SV40的聚A位点的片段。最后,该质粒具有含有细菌的复制起点和β -内酰胺酶基因的PUC19质粒的一部分。图26是小鼠D1-2-14和嵌合D1-2-14 (ChDI_2_14)的用SDS-PAGE展开后并经CBB染色的图。MW表示分子大小标准参照物，箭头分别表示条带的分子量(kD)。图27是表示利用纯化FA-1 (hDlk_l细胞外区域)的固相ELISA的、D1-2-14和ChD1-2-14的抗原结合活性的图。〇表示小鼠IgGl抗体(克隆D1-2-14)，.表示嵌合抗体(ChD1-2-14)。图28是表示使用HEK293-hDlk细胞，通过流式细胞术进行的D1-2-14和ChD1-2-14的反应性的图。涂黑的图是同种型对照抗体，黑线(白色空心)图分别是D1-2-14和 ChD1-2-14。图29是用流式细胞术分析人肝癌细胞株中细胞表面Dlk-1的表达的图。标号为“I”的线表不小鼠IgGl,标号为“2”的线表不抗人Dlk-1抗体,表不将各细胞染色时的图。图30是用流式细胞术分析人乳腺癌细胞株中的细胞表面Dlk-1的表达的图。标号为“I”的线表不小鼠IgGl,标号为“2”的线表不抗人Dlk-1抗体,表不将各细胞染色时的图。图31是用流式细胞术分析人白血病细胞株中的细胞表面Dlk-1的表达的图。标号为“I”的线表不小鼠IgGl,标号为“2”的线表不抗人Dlk-1抗体,表不将各细胞染色时的图。图32是表示Huh-7-dl k细胞异种移植治疗模型中的摘出的癌组织中的Flk-1/VEGF-R2的免疫组化染色的图。A:是分别用抗小鼠Flk-1/VEGF_R2抗体对取自(摘自)小鼠IgG给药组(对照组)和克隆D1-2-14给药组的癌组织的新鲜冷冻切片进行免疫染色的照片(物镜200倍)。照片中，箭头状的标记(▲)示出的区域表示Flk-1/VEGF-R2阳性的肿瘤血管内皮细胞。B:是用抗小鼠Flk-1/VEGF-R2抗体对从IgG给药组(2个个体)和D1-2-14给药组(4个个体)分别采集的新鲜冷冻切片进行免疫染色，在各个切片中，对于物镜200倍下8 13个视场(IgG给药组:共21个视场、D1-2-14给药组:共35个视场)，对Flk_l/VEGF_R2阳性的肿瘤血管内皮细胞计数，表示每I个视场的细胞数的图(*p〈0.01，通过Student’ st检验)。图33是表示Huh-7-dlk细胞异种移植治疗模型中摘出的癌组织中的Flk-1/VEGF-R2的基因表达的图。A:从IgG给药组(N=7)和DI_2_14给药组(N=7)分别摘出肿瘤后，用Trizol试剂提取RNA，然后合成第I链cDNA，分别使用各第I链cDNA作为模板，通过PCR法(30个循环)确认小鼠Flk-1/VEGF-R2 (mFlk_l)和小鼠/人GAPDH (GAPDH)的基因表达的电泳图像的图。下图是用NIH image定量mFlk_l和GAPDH的PCR扩增产物的条带并以比例(mFlk-1/GAPDH)表示的图。B:是除了通过PCR法进行35个循环的扩增反应以外，与A同样情况的图。
具体实施例方式以下，对本发明进行详细地说明。本发明的范围不局限于这些说明，在不损害本发明的主要内容的范围内可以在以下的例示的基础上适当变更而实施。而且，本说明书包括作为本申请优先权主张的基础的日本特愿2006-305355号说明书的全部内容。而且，本说明书中引用的所有的出版物，例如现有技术文献和公开公报、专利公报以及其它的专利文献作为参照并入本说明书。1.本发明的概要如前所述，人Dlk-1 (delta-like I homolog (果蚬);hDlk_l)是全长为 383 个氨基酸残基的单次跨膜型的I型膜蛋白质，其在细胞外区域具有6个EGF样基序。而且，已知hDlk-Ι基因及其基因产物在各种癌和肿瘤细胞中以高频率表达。一般来说，由于难以制得在体内显示抗肿瘤活性的抗体，因此即使制备抗hDlk-Ι单克隆抗体，大多在体外具有抗肿瘤活性，但在体内并不显示出相同活性。而且，由于针对hDlk-Ι的癌细胞的增殖等功能的区域、hDlk-Ι的配体(或受体)和细胞内信号传递途径等尚不清楚，缩小靶点来有效地进行抗体制备也基本是不可能的。这种状况下，本发明中，通过从多个克隆中进行筛选，成功地获得了在体内具有抗肿瘤活性的克隆。
首先，本发明人通过使用公知的抗hDlk-Ι抗体的免疫组织化学，在迄今为止确认了 hDlk-Ι的表达的前述癌和肿瘤细胞以外，还新发现了 hDlk-Ι在大肠癌和乳腺癌中也表达。然后，本发明人以制备可以在个体水平上使得表达hDlk-Ι的癌细胞死亡或可以抑制肿瘤生长的抗hDlk-Ι抗体，即在体内具有抗肿瘤活性的抗hDlk-Ι抗体作为目的，重新制备了约100个克隆的抗hDlk-Ι单克隆抗体。而且，就这些克隆，将各种癌细胞株移植到裸小鼠皮下，用这样建立的荷瘤小鼠进行体内的药效(抗肿瘤作用)评价。其结果是，成功地获得了多个显示出显著的肿瘤生长抑制活性的克隆(克隆名:D1-2-14、2-13、BA-1-3D, D1-6、M3-1)。而且，本发明人在上述抗hDlk-Ι抗体中发现了在向表达hDlk-Ι的细胞内的移动能力(内化活性)方面优异的抗体，制备出含有这种抗体和具有抗肿瘤活性和细胞杀伤活性的化合物的抗体-药剂复合体。该复合体，作为所谓的免疫结合物，其对目标肿瘤细胞内的药物送达能力优异。本发明人发现使用具有上述抗肿瘤活性的抗hDlk-Ι抗体和抗体-药剂复合体，对于各种肿瘤的治疗或肿瘤的诊断和检测有用。2.抗hDlk-Ι抗体的制作(I)抗原的制备hDlk-Ι的氨基酸序列(序列号2)的信息，例如在NCBI (GenBank)的网站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上以“登录号:NP_003827”公布。而且,编码hDlk-1的氨基酸序列的碱基序列(序列号I)的信息在同一网站上以“登录号:NM 003836”公布。作为抗原，可以使用含有hDlk-Ι的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的多肽或肽(也简称为肽)，可优选使用含有hDlk-Ι的细胞外区域(FA-1)的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部)的肽。hDlk-Ι的细胞外区域为如前所述的含有6个EGF样基序(EGF-1 EGF-6)的区域，为含有序列号2所示的氨基酸序列中的第26位 第244位的氨基酸的区域，优选为序列号2所示的氨基酸序列中的“第24位”至“第248 285位”的氨基酸构成的区域(约225 262个氨基酸残基)。其中，就作为抗原使用的肽来说，上述“氨基酸序列的至少一部分”的长度没有特别限定，例如优选含有6个EGF样基序中的I个或2个以上的区域。更优选例如含有EGF-1和EGF-2的区域(即序列号2所示的氨基酸序列中的第26位 第85位的氨基酸构成的区域)、含有EGF-3和EGF-4的区域(即序列号2所示的氨基酸序列中的第92位 第167位的氨基酸构成的区域)、和含有EGF-4、EGF-5和EGF-6的区域(即序列号2所示的氨基酸序列中的第131位 第244位的氨基酸构成的区域)。作为抗原的肽的制作方法可以是化学合成，也可以通过采用大肠杆菌等的基因工程法合成，可以使用本领域技术人员公知的方法。进行肽的化学合成时，可以通过肽合成的公知方法进行合成。而且，其合成也可以使用固相合成法和液相合成法中的任意一种。还可以使用市售的肽合成装置(例如，岛津制作所制:PSSM-8等)。在用基因工程学方式合成肽时，首先设计并合成编码该肽的DNA。该设计和合成例如可以使用以含有全长hDlk-Ι基因的载体等作为模板，使用设计为可以合成所希望的DNA区域的引物，通过PCR法进行。然后，通过将上述DNA连接到适当的载体上而获得蛋白质表达用重组载体，将该重组载体导入宿主中并使得目的基因可以表达，由此获得转化子(Sambrook J.et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001)。使用可以在宿主微生物中自我增殖的噬菌体或质粒作为载体。而且还可以使用动物病毒、昆虫病毒载体。重组载体的制作可如下进行，即用适当的限制性酶切断纯化的DNA，插入适当的载体DNA的限制性酶位点等中而与载体连接。作为转化时使用的宿主，只要是可以表达目的基因的宿主即可，没有特别的限定。例如，可以例举细菌(大肠杆菌、枯草杆菌等)、酵母、动物细胞(C0S细胞、CHO细胞等)、昆虫细胞或昆虫。还可以使用山羊等哺乳动物作为宿主。向宿主导入重组载体的方法是公知的。然后，培养前述转化子，从其培养物中收集作为抗原使用的肽。“培养物”是指(a)培养上清、(b)培养细胞或者培养菌体或其破碎物中的任意一种。培养后，目的肽在菌体内或细胞内产生时，通过破碎菌体或细胞来提取肽。而且，目的肽在菌体外或细胞外产生时，直接使用培养液或通过离心分离等除去菌体或细胞。然后，可以通过单独使用可以在肽的分离纯化中使用的一般的生物化学方法，例如硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等或将这些方法组合使用，来分离纯化目的肽。本发明中，还可以使用无细胞蛋白质合成系统，通过体外翻译获得作为抗原的肽。此时，可以使用以RNA作为模板的方法和以DNA作为模板的方法(转录/翻译)这2种方法。作为无细胞蛋白质合成系统，可以使用市售的系统，例如Expressway 系统(Invitrogen公司)、PURESYSTEM (注册商标；post genome研究所)、TNT系统(注册商标；Promega公司)
坐寸ο如上所述获得的肽还可以结合到适当的载体蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)^.孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin, KLH)、人甲状腺球蛋白、鸡Y-球蛋白等。
另外，抗原可以是在hDlk-Ι的氨基酸序列(序列号2)或前述的序列的部分序列中缺失、置换或添加了 I个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的肽。例如，还可以使用hDlk-Ι的氨基酸序列或其部分序列中缺失I个或多个(优选I个或多个(例如I个 10个，更优选I个 5个))氨基酸，I或多个(优选I个或多个(例如I个 10个，更优选I个 5个))氨基酸被其它氨基酸置换，或添加了 I个或多个(优选I个或多个(例如I个 10个，更优选I个 5个))其它氨基酸的氨基酸序列所构成的肽。本发明中，作为用于导入于细胞等的基因，可以例举编码hDlk-Ι蛋白质或其部分片段的基因、或编码其突变型的蛋白质或片段的基因。作为这种基因，例如可以使用具有序列号I所不的喊基序列或其部分序列的基因。而且，作为用于导入于细胞等的基因，还可以使用与序列号I所示的碱基序列互补的序列在严紧条件下杂交，且编码具有hDlk-Ι活性的蛋白质的碱基序列或其部分序列。“严紧条件”是指杂交后清洗时的条件，缓冲液的盐(钠)浓度为10 500mM，温度为42°C 72°C，优选上述盐浓度为50 300mM，温度为55 68°C的条件。为了在基因中导入突变，可以通过Kunkel法或带缺口的双链体(Gappedduplex)法等公知方法进行，例如使用利用定点突变法的突变导入用试剂盒GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen 公司 制)、TaKaRa Site-DirectedMutagenesis System (Mutan-K、Mutan-Super Express Km 等:TAKARA BIO 公司制)来进行。(2)多克隆抗体的制作将制备的抗原给予到用于免疫的哺乳动物。哺乳动物没有特别限定，例如可以例举大鼠、小鼠和兔等，其中优选小鼠。每一只动 物的抗原给药量，可以根据佐剂的有无适当设定。作为佐剂，可以例举弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝佐剂等。免疫主要可以通过注入到静脉内、脚掌、皮下、腹腔内等来进行。而且，免疫的间隔没有特别限定，以数天至数周的间隔优选I周的间隔进行I 10次、优选2 3次免疫。然后，在最后的免疫日起3 7天后，通过酶免疫测定法(ELISA或EIA)或放射性免疫测定法(RIA)等测定抗体效价，可以在出现所希望的抗体效价之日采血，获得抗血清。在上述抗体的提取方法中，在需要纯化抗体时，可以通过适当选择或组合硫酸铵盐析法、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等公知方法来进行纯化。然后，通过ELISA法等测定抗血清中的多克隆抗体的反应性。(3)单克隆抗体的制作(3-1)抗体产生细胞的提取本发明的抗hDlk-Ι抗体并没有限制，但优选为单克隆抗体。将制备的抗原给予用于免疫的哺乳动物，例如大鼠、小鼠和兔等。每只动物的抗原给药量可以根据有无佐剂适当设定。佐剂与上述同样。免疫方法也与前述同样。而且，在最后的免疫日起I 60天后，优选为I 14天后，提取抗体产生细胞。作为抗体产生细胞，可以例举脾细胞、淋巴结细胞和外周血细胞等，其中优选淋巴结细胞和脾脏细胞。(3-2)细胞融合为了获得杂交瘤(抗体产生细胞株)，进行抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。作为与抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞，可以使用小鼠等动物的一般可以获得的已建立的细胞株。作为使用的细胞株，优选具有药剂选择性，具有未融合的状态下在HAT选择培养基(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷)中无法生存而只有在与抗体产生细胞融合的状态下可以生存的性质的细胞株。作为骨髓瘤细胞，例如可以例举P3-X63-Ag8.653、P3-X63-Ag8(X63)、P3-X63_Ag8.Ul (P3U1)、P3/NS I/1-Ag4-1 (NSl)和 Sp2/0_Ag 14 (Sp2/0)等小鼠骨髓瘤细胞株。骨髓瘤细胞的选择，可以适当考虑与抗体产生细胞的适合性而进行。然后，使骨髓瘤细胞与抗体产生细胞进行细胞融合。细胞融合时，在不含血清的DMEM和RPM1-1640培养基等动物细胞用培养基中，混合I X IO6 I X IO7个/mL的抗体产生细胞和2 X IO5 2 X IO6个/mL的骨髓瘤细胞。抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞比(抗体产生细胞:骨髓瘤细胞)没有限制，但通常优选为1:1 10:1，更优选为3:1。然后，在细胞融合促进剂的存在下进行融合反应。作为细胞融合促进剂，例如可以使用平均分子量为1000 6000道尔顿(D)的聚乙二醇等。而且,还可以使用利用电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置，使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合。(3-3)杂交瘤的挑选和克隆从细胞融合处理后的细胞中挑选出目的杂交瘤。作为该方法，将细胞悬浮液用例如含有胎牛血清的RPM1-1640培养 基等适当稀释后，接种于微板上，在各孔中加入选择培养基，以后适当更换选择培养基进行培养。其结果是，在选择培养基中开始培养后，可以将14天前后开始生长的细胞作为杂交瘤。然后，在逐步增殖的杂交瘤的培养上清中，筛选是否存在与hDlk-Ι反应的抗体。杂交瘤的筛选可以按照通常的方法，没有特别限制。例如，可以采集已长出杂交瘤的孔中所含的培养上清的一部分，通过ELISA、EIA和RIA等进行筛选。融合细胞的克隆可以通过有限稀释法等进行。通过流式细胞术等判断与hDlk-1显示出强反应性的抗体，选择产生该抗体的杂交瘤，建立克隆。(3-4)单克隆抗体的提取作为培养已建立的杂交瘤并从获得的培养物中提取单克隆抗体的方法，可以采取通常的细胞培养法或腹水形成法等。“培养”是指在培养皿或培养瓶中使杂交瘤生长，或如下使杂交瘤在动物的腹腔内增殖。细胞培养法中，可以在含有10%胎牛血清的RPM1-1640培养基、MEM培养基或无血清培养基等动物细胞培养的培养基中，在通常的培养条件(例如37°C，5%C02浓度)下培养杂交瘤7 14天，从其培养上清中获得抗体。腹水形成法的情况下，在与骨髓瘤细胞来源的哺乳动物同种系动物的腹腔内给予约I X IO7个杂交瘤，使杂交瘤大量增殖。并且，优选在2 3周后提取腹水。在上述抗体的提取方法中，在需要纯化抗体时，可以通过适当选择或组合硫酸铵盐析法、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等公知方法来进行纯化。(3-5)具有抗肿瘤活性的克隆的挑选本发明的抗hDlk-Ι抗体是在体内具有抗肿瘤活性的抗体。这里，“抗肿瘤活性”是指使肿瘤细胞(癌细胞)死亡的活性或抑制肿瘤生长的活性。本发明中，作为抗肿瘤活性,例如可优选例举肿瘤血管生成抑制活性。而且,作为本发明的抗体可以发挥抗肿瘤活性的人肿瘤(肿瘤细胞)的种类,可以例举已确认hDlk-Ι的表达的前述公知的人肿瘤(具体而言，实体癌有神经内分泌肿瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、I型神经纤维瘤病、小细胞肺癌、肝癌、肾癌和卵巢癌等，血癌有骨髓发育异常综合征和急性髓系白血病等。)和本发明人新确认hDlk-Ι的表达的人大肠癌和人乳腺癌。其中尤其可优选例举大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤中的I种或2种以上。体内的抗肿瘤活性的确认，例如可以使用在小鼠的皮下移植了所希望的肿瘤细胞的荷瘤小鼠，通过对该小鼠给予前述获得的抗体来进行。此时，抗体的给药可以在肿瘤细胞的移植后立即进行(预防模型)，也可以在确认移植肿瘤达到预定体积之后进行(治疗模型)。给药方法并没有限制，例如可以3天I次，以20mg/kg体重进行腹腔内给药。预防模型的情况下，可以通过肿瘤形成频率和肿瘤体积评价抗肿瘤活性的有无和水平。治疗模型的情况下，可以根据肿瘤体积评价抗肿瘤活性的有无和水平。 本发明中，作为在体内具有抗肿瘤活性的抗hDlk-Ι抗体，例如可以优选例举由保藏号为FERM BP-10707的杂交瘤产生的抗hDlk-Ι单克隆抗体(克隆名:M3_1)，由保藏号为FERM BP-10899的杂交瘤产生的抗hDlk-Ι单克隆抗体(克隆名:DI_2_14)和由保藏号为FERM BP-10900的杂交瘤产生的抗hDlk-Ι单克隆抗体(克隆名:DI_6)等。而且，克隆名:D1-2-14的抗hDlk-1单克隆抗体作为在体内具有高抗肿瘤活性的抗体是优选的。其中，保藏号为FERM BP-10707 的杂交瘤命名为“Mouse-Mouse hybridoma:M3-1”，于2006年10月18日保藏，保藏号为FERM BP-10899的杂交瘤命名为“Mouse-Mousehybridoma D1-2-14”，于2007年8月21日保藏，保藏号为FERM BP-10900的杂交瘤称为“Mouse-Mouse hybridoma D1-6”于2007年8月21日保藏，均保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(〒305-8566茨城县筑波市东1-1-1中央第6)。另外，作为本发明的抗hDlk-Ι抗体，例如可优选例举H链V区域的⑶Rl 3的氨基酸序列依次分别为序列号30 32所示的氨基酸序列、和/或L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列依次分别为序列号33 35所示的氨基酸序列的抗体。作为上述H链V区域，例如，优选序列号23所示的氨基酸序列构成的区域，作为上述L链V区域，例如，优选序列号25所示的氨基酸序列构成的区域。而且，作为本发明的抗hDlk-Ι抗体，例如还可优选列举与由保藏号为FERMBP-10707.FERM BP-10899、或FERM BP-10900的杂交瘤产生的单克隆抗体所结合(识别)的部位(例如表位)结合的抗hDlk-Ι抗体。(3-6)抗hDlk-Ι抗体的表位 本发明的抗hDlk-Ι抗体的表位(抗原决定簇)只要是抗原hDlk_l的至少一部分即可，并没有限制，例如，优选为序列号I所示的hDlk-Ι的氨基酸序列中的第26位 第85位的氨基酸所构成的区域(含有hDlk-Ι的EGF-1 EGF-2的区域)、第92位 第167位的氨基酸所构成的区域(含有hDlk-Ι的EGF-3 EGF-4的区域)、或第131位 第244位的氨基酸构成的区域(含有hDlk-Ι的EGF-4 EGF-6的区域)中的至少一部分。其中更为优选含有hDlk-Ι的EGF-4 EGF-6的区域和含有EGF-4 EGF-6的区域，尤其优选含有第92位 第120位的氨基酸所构成的区域(含有hDlk-Ι的EGF-3的区域)。识别该区域(与该区域结合)的抗hDlk-Ι抗体，例如，对肿瘤细胞内的内化活性高，在后述的免疫结合物等用途中极为有用。(4)基因重组抗体和抗体片段(4-1)基因重组抗体
作为本发明的抗hDlk-1抗体的优选方式之一，可以例举基因重组抗体。作为基因重组抗体，没有限制，但例如可以例举嵌合抗体、人源化抗体和人抗体等。嵌合抗体(即人源化嵌合抗体)是小鼠源抗体的可变区连接到(接合)人来源的恒定区的抗体(参照 Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81, 6851-6855，(1984)等)，在制作嵌合体时，为了获得这样连结的抗体，可以通过基因重组技术容易地构建。其中，作为小鼠源抗体的可变区，H链V区域例如优选序列号23所示的氨基酸序列构成的区域，L链V区域例如优选序列号25所示的氨基酸序列构成的区域。在制作人源化抗体时，通过从小鼠抗体的可变区将互补性决定区(⑶R)移植到人可变区，框架区(FR)为人来源，CDR由小鼠来源的CDR构成，制备重构的可变区(即CDR移植(⑶R grafting))。然后，将这些人源化的重构的人可变区与人恒定区连结。这种人源化抗体的制作方法在本领域中是众所周知的(参照Nature, 321, 522-525 (1986) ；J.Mol.Biol.，196,901-917 (1987):Queen C et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86:10029-10033 (1989)；日本特表平4-502408号公报(日本特许第2828340号公报；Queen等人)等)。其中，作为可以在本发明的人源化抗hDlk-Ι抗体中使用的小鼠来源的CDR序列，没有限制，例如，作为H链V区域的⑶Rl 3，可例举优选(依次分别)序列号30 32所示的氨基酸序列，作为L链V区域的⑶Rl 3，可以优选例举(依次分别)序列号33 35所示的氨基酸序列。人抗体(完全人抗体),一般是V区域的抗原结合部位即高变区(Hyper Variableregion)，V区域的其它部分和恒定区的结构具有与人的抗体相同的结构。但是，高变部位也可以来源于其它动物。制作人抗体的技术也是公知的，已建立了通过基因工程学的手法来制作人共通的基因序列的方法。人抗体例如可以通过使用含有具有人抗体的H链和L链基因的人染色体片段的人抗体产生小鼠的方法(参照Tomizuka, K.et al., NatureGenetics, (1977)16, 133-143 ；Kuroiwa, Y.et.al., Nuc.Acids Res., (1998)26, 3447-3448 ；Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects, (1999)10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T.and Iijima, S.eds.),Kluwer Academic Publishers ；Tomizuka, K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, (2000) 97，722-727 等)和获得从人抗体文库挑选的曬菌体展示来源的人抗体的方法(参照Wormstone,1.M.et.al, InvestigativeOphthalmology&Visual Science., (2002) 43 (7) , 2301-8 ；Carmen, S.et.al., Briefingsin Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2),189-203 ；Siriwardena, D.et.al., Opthalmology, (2002) 109 (3)，427-431 等)而获得。上述嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，优选为抗体Fe区域中的N-糖苷键复合型糖链为该糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺不与岩藻糖结合的糖链，具体而言可以例举在抗体分子的Fe区域中具有该岩藻糖的I位不与N-糖苷键复合型糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位发生α结合的糖链的基因重组抗体分子所构成的抗体。如果是这种抗体，则可以使ADCC活性极大提高。而且，前述的多克隆抗体和单克隆抗体同样优选这一点(抗体Fe区域中N-糖苷键复合型糖链的特征)。(4-2)抗体片段本发明的抗hDlk-Ι抗体的片段也包含于本发明的抗体中。其中，本发明的抗体片段与本发明的抗hDlk-Ι抗体一样，具有与hDlk-Ι结合的活性，在体内具有抗肿瘤活性。作为该抗体的片段 ，是指抗hDlk-Ι多克隆抗体或抗hDlk-1单克隆抗体的一部分的区域(即，来源于本发明的抗hDlk-1抗体的抗体片段)，例如，可以例举Fab、Fab’、F(ab’ ) 2、Fv (抗体可变区)、单链抗体(H链、L链、H链V区域和L链V区域等)、scFv、双抗体(diabody) (scFv 二聚物)、dsFv (二硫化物稳定化V区域)和至少一部分含有互补性决定区(complementarity determining region:CDR)的月太等。Fab是用蛋白质分解酶中的木瓜蛋白酶处理抗体分子而获得的片段中，H链的N末端侧约一半和L链全体通过二硫键结合的、分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。而且，还可以通过将编码抗体的Fab的DNA插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，通过将该载体导入到原核生物或真核生物而使之表达，制造Fab。F (ab’)2是用蛋白质分解酶中的胃蛋白酶处理抗体分子而获得的片段中，Fab通过铰链区的二硫键结合的稍大的、分子量约为10万的具有抗原结合活性的抗体片段。而且，还可以通过后述的使Fab形成硫醚键或二硫键进行制作。Fab’是切断上述F (ab’)2的铰链区的二硫键的、分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。而且，还可以通过将编码抗体的Fab’片段的DNA插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，通过将该载体导入于原核生物或真核生物而使之表达，制造Fab’。scFv是将I条H链V区域(VH)和I条L链V区域(VL)用适当的肽连接子(P)连结的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其是具有抗原结合活性的抗体片段。scFv可以如下制备，即，获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物中使之表达而进行制造。双抗体是scFv 二聚化形成的抗体片段，其为具有二价的抗原结合活性的抗体片段。二价的抗原结合活性可以是相同的，也可以是其中一方为不同的抗原结合活性。双抗体可以如下制备，即，通过获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA并使P的氨基酸序列的长度达到8个残基以下，将该DNA插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物使之表达而进行制造。dsFv是指使VH和VL中的各I个氨基酸残基被换成半胱氨酸残基的多肽通过该半胱氨酸残基间的二硫键结合形成的抗体。被换成半胱氨酸残基的氨基酸残基可以按照Reiter等人公开的方法(Protein Engineering, 7, 697-704, 1994),基于抗体的立体结构预测进行选择。dsFv可以如下制备:通过获得编码抗体的VH和VL的cDNA,构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物中使之表达而进行制造。含有⑶R的肽包含VH或VL的⑶R (⑶R I 3)中的至少I个以上区域而构成。含有多个CDR的肽可以如下制备:通过直接或适当的肽连接子结合。含有CDR的肽可以通过构建编码抗体的VH和VL的⑶R的DNA，将该DNA导入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物中使之表达而进行制造。而且，含有⑶R的肽还可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。 作为本发明的抗体片段，可以是以原有的形状含有N-糖苷键复合型糖链为该糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺不与岩藻糖结合的糖链的抗体Fe区域的一部分或全部的抗体片段，而且，也可以是上述抗体片段与N-糖苷键复合型糖链为该糖链的还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖不与岩藻糖结合的糖链的抗体Fe区域的一部分或全部的融合蛋白质。这种抗体片段可以极大地提高ADCC活性，因而优选。作为本发明的抗体片段的具体例子并没有限制，但可以例举例如至少部分中含有序列号30 32所示的氨基酸序列(H链V区域的CDRl 3)的片段，具体而言，可以例举含有序列号23所示的氨基酸序列(H链V区域)的片段。另外，作为该抗体片段，可以例举至少部分中含有序列号33 35 (L链V区域的⑶Rl 3)所示的氨基酸序列的片段，具体而言可以例举含有序列号25所示的氨基酸序列(L链V区域)的片段。以下本说明书中的说明中，上述抗体片段也包含于本发明的抗hDlk-Ι抗体中。3.抗体-药剂复合体的制作作为使用上述本发明的抗hDlk-Ι抗体的免疫结合物等，可以提供含有该抗体和具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物的抗体-药剂复合体。予以说明，在预先分别制备该抗体分子和具有抗肿 瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物之后，将它们复合化而获得的物质一般被称为免疫结合物。而且，通过使用基因重组技术，将具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物中的蛋白质毒素在基因上与抗体基因连接，作为I个蛋白质(融合蛋白质)表达而获得的物质一般被称为免疫毒素。作为具有抗肿瘤活性的化合物，例如，可以例举阿霉素(doxorubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)、丝裂霉素(mitomycin) C、Auristatin E 等。作为具有细胞杀伤活性的化合物，例如，可以例举皂草素、篦麻毒素、绿脓杆菌外毒素、白喉毒素等，其中优选使用皂草素和绿脓杆菌外毒素。作为抗体-药剂复合体的制作方法并没有限制，例如，可以例举通过二硫键或腙键将抗体与药剂偶联的方法等。上述本发明的抗hDlk-Ι抗体在对表达hDlk-1的目标肿瘤细胞内的内化活性方面优异。因此，通过预先使具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物复合化，可以使这些化合物直接且高选择地作用于肿瘤细胞。本发明的抗体-药剂复合体在向目标肿瘤细胞传送药剂的能力上极为优异。而且，对细胞内的内化活性可以如下评价，S卩，通过用罗丹明等对抗体进行萤光标记，用萤光显微镜等观察向细胞内的进入举动和抗体的定位性。另外本发明中，还可以提供在抗体-药剂复合体中，使用前述抗体片段代替抗体的抗体片段-药剂复合体。抗体片段-药剂复合体的详细内容可以适当应用上述抗体-药剂复合体的说明。以下，本说明书的说明中，抗体片段-药剂复合体也包含于本发明的抗体-药剂复合体中。4.药物组合物本发明的抗hDlk-Ι抗体和抗体-药剂复合体作为包含于药物组合物中的有效成分是有用的。该药物组合物作为肿瘤的治疗用和/或诊断用的药物组合物是有用的。尤其是，由于本发明的抗hDlk-Ι抗体和含有该抗体的抗体-药剂复合体具有肿瘤血管生成抑制活性的抗肿瘤活性，因此优选在肿瘤的治疗用中使用。即，本发明的抗hDlk-Ι抗体和抗体-药剂复合体作为包含于肿瘤治疗剂、肿瘤血管生成抑制剂和肿瘤诊断剂中的有效成分是有用的。
本发明的药物组合物含有本发明的抗hDlk-Ι抗体和/或抗体-药剂复合体作为有效成分，而且优选以包括药学上允许的载体的药物组合物的形态提供。作为本发明的药物组合物的适用对象疾病(肿瘤)，可以例举确认了表达hDlk-Ι的前述公知的人肿瘤和本发明人新确认的表达hDlk-Ι的人大肠癌和人乳腺癌。其中，尤其优选例举大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经细胞瘤中的I种或2种以上。这些疾病可以是单独的，也可以是2种以上并发。所谓“药学上允许的载体”，可以例举赋形剂、稀释剂、增量剂、崩解剂、稳定剂、防腐剂、缓冲剂、乳化剂、芳香剂、着色剂、甜味剂、粘稠剂、矫味剂、增溶剂或其它添加剂等。通过使用I种以上这种载体，可以制备注射剂、液剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂或糖浆剂等形态的药物组合物。这些药物组合物可以经口或非经口给药。作为用于非经口给药的其它形态，包括含有I种以上的活性物质的通过常规方法制备的注射剂等。注射剂的情况中，可以通过溶解或悬浮于生理盐水或市售的注射用蒸馏水等药学上允许的载体中来制造。尤其是，对生物体内给予本发明的抗hDlk-Ι抗体来源的抗体片段(其中尤其是低分子的物质)时，在其基础上还可以使用胶体分散系。胶体分散系可期待具有提高化合物(抗体片段)在生物体内稳定性的效果和将化合物高效输送到特定的内脏器官、组织或细胞的效果。胶体分散系只要为通常使用的即可，没有限制，可以例举聚乙二醇、高分子复合体、高分子凝集体、纳米胶囊、微球体、珠子和水包油系的乳化剂、胶束、混合胶束和以包含脂质体在内的脂质为基础的分散系，优选为具有将化合物高效输送到特定脏器、组织或细胞的效果的多个脂质体、人工膜的小囊泡(Mannino et al.，Biotechniquesj 1988，6，682 ；Blume and Cevcj Biochem.et Biophys.Acta, 1990，1029，91 ；Lappalainen et al.，Antiviral Res.，1994，23，119 ；Chonn andCullisj Current Op.Biotech.，1995，6，698)。本发明的药物组合物的给药量根据患者的年龄、性别、体重和症状、治疗效果、给药方法、处理时间或药物组合物所含的本发明的抗hDlk-Ι抗体和抗体-药剂复合体的种类等而不同。通常，成人每人每次可以在600 μ g到6000mg的范围内给予，但并不限于此范围。例如通过注射剂给予时，对人患者I次的给药中，每Ikg体重可以平均I天以I次 数次给予ΙΟΟμ g IOOmg的量。作为给予的形态，可以例举静脉内注射、皮下注射、皮内注射、肌肉内注射或腹腔内注射等，优选为静脉内注射。而且，注射剂根据情况还可以调制成非水性的稀释剂(例如聚乙二醇、橄榄油等植物油、乙醇等醇类等)、悬浮剂或乳浊剂。这种注射剂的无菌化可以通过过滤器进行过滤杀菌、配合杀菌剂等来进行。注射剂可以制备成使用时调制的形态。即，可以通过冷冻干燥法等制成无菌的固体组合物，在使用前溶解于无菌的注射用蒸馏水或其它溶剂中再使用。另外，本发明还提供用于制造治疗和/或诊断肿瘤的药物(药剂)的前述本发明的抗hDlk-Ι抗体和/或抗体-药剂复合体的应用。而且，本发明还提供治疗和/或诊断肿瘤用的前述本发明的抗hDlk-Ι抗体和/或抗体-药剂复合体。此外，本发明还提供肿瘤的治疗和/或诊断方法，其特征在于其使用前述本发明的抗hDlk-1抗体和/或抗体-药剂复合体(即给予患者)，而且还提供前述本发明的抗hDlk-Ι抗体和/或抗体-药剂复合体在用于治疗和/或诊断肿瘤中的应用。5.肿瘤的检测方法本发明的肿瘤检测方法的特征在于，使前述本发明的抗hDlk-Ι抗体与从生物体采集的试样(以下称生物体试样)反应，检测反应的抗体的信号的方法。如前所述，由于确认了 hDlk-Ι在各种肿瘤细胞中特异性表达，hDlk-Ι，尤其是游离hDlk-1 (hDlk-1的细胞外区域部分)可以作为各种肿瘤靶标来使用。其中，优选作为人大肠癌、人乳腺癌和人肝癌的靶标来使用。因此，可以通过使本发明的抗hDlk-Ι抗体与生物体试样反应，检测反应的抗体的信号来检测肿瘤。获得的抗体的信号成为生物体试样中的抗原量(即hDlk-Ι量或游离hDlk-Ι量)的指标。使用本发明的抗体的肿瘤的检测，首先，使作为试样的从被验者中提取的生物体试样，例如作为检查对象的组织 片或血液等与本发明的抗体通过抗原抗体反应结合。然后，通过基于结合的抗体量的测定结果，通过测定生物体试样中的目的抗原量而进行。该测定可以按照公知的免疫学测定法进行，例如，可以使用免疫沉淀法、免疫凝集法、标记免疫测定法、免疫比池法、western blot法、流式细胞术法等。标记免疫测定法中,抗体的信号除了以用标记抗体直接检测的标记量表示之外，还可以以已知浓度或已知抗体效价的抗体作为标准液相对地表示。S卩，可以通过测定计测定标准液和试样，以标准液的值作为基准，相对地表示生物体试样中的抗体信号。作为标记免疫测定法，例如可以例举ELISA法、EI法、RIA法、萤光免疫测定法(FIA)、化学发光免疫测定法(Luminescence immunoassay)等。其中尤其是，ELISA法由于简便和高灵敏度而优选。本发明中，可以将通过上述检测方法获得的检测结果作为指标来评价或诊断肿瘤的状态。例如，检测结果超过预定的基准值时判断为肿瘤阳性，在预定的基准值以下时判断为肿瘤阴性，为阳性时，判断为有发生任意一种肿瘤的可能性，可以评价肿瘤的状态。这里，所谓肿瘤的状态是指是否患有肿瘤或其进行程度，可以例举肿瘤发症的有无、进行度、恶性程度、转移的有无和复发的有无等。在上述评价时，作为肿瘤的状态，可以选择I个，也可以组合选择多个。肿瘤的有无的评价，可以基于所获得的检测结果，通过以预定的基准值作为界限，判断是否患有肿瘤来进行。肿瘤的恶性程度是表示癌进行到何种程度的指标，也可以基于检测结果，对病期(Stage)分类再进行评价，或分类为早期癌或晚期癌再进行评价。例如，还可以将检测结果作为指标，评价为早期癌或晚期癌。肿瘤的转移，可以通过以检测结果作为指标，根据在从原发瘤的位置离开的部位是否出现新生物来评价。复发，可以根据在间歇期或缓解后检测结果是否再次超过预定的基准值来评价。6.肿瘤的检测用或诊断用试剂盒本发明的抗hDlk-Ι抗体可以以肿瘤的检测用或诊断用试剂盒的形态提供。本发明的试剂盒含有抗体，此外还可以含有标记物质、或抗体或固定该标记物的固定化试剂等。所谓抗体的标记物质是指用酶、放射性同位素、萤光化合物和化学发光化合物等标记的物质。本发明的试剂盒除了上述构成要素之外，还可以含有用于实施本发明的检测的其它试齐U，例如标记物为酶标记物时，可以含有酶底物(显色性底物等)、酶底物溶解液、酶反应停止液、或试样用稀释液等。而且，还可以含有各种缓冲液、无菌水、各种细胞培养容器、各种反应容器(Eppendorf管等)、封闭剂(牛血清白蛋白(BSA)、脱脂乳、山羊血清等血清成分)、清洗剂、表面活性剂、各种板、叠氮化钠等防腐剂和实验操作手册(说明书)等。本发明的试剂盒可有效用于进行上述本发明的检测方法，其有用性极高。以下，通过例举实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限于此。〔实施例1〕<材料和方法>1.细胞株HEK-293-hDlk 细胞、7E2_C_hDlk 细胞和 Huh-7-hDlk 细胞使用按 WO 2005/052156中所述而制作的细胞株。另外，人神经母细胞瘤SK-N-Fl细胞从美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection, ATCC ;目录号 N0.CRL2142)获得。SW480-hDlk细胞是通过在人大肠癌来源的细胞株SW480 (获得来源:东京大学分子细胞生物学研究所功能形成)中导入含有全长hDlk-Ι基因的表达载体pcDNA-hdlk-Flag(参照W02005/052156)，进行抗生素G418 (遗传霉素(geneticin)，GIBCO BRL)选择后，建立稳定表达hDlk-Ι的细胞株而获得。2.抗hDlk-Ι多克隆抗体的制作在构建hDlk-Ι的细胞外区域(FA-1)表达载体时，设计并合成以下引物。正向(F)引物:5’-cgcgtccgcaaccagaagccc-3’ (序列号 3)反向(R)引物:5’ -ctcgaggtgctccggctgctgcaccggc-3’(序列号 4)此时，在R引物上添加XhoI限制性酶切序列。使用这些引物，以hDlk-Ι的cDNA作为模板，按以下的反应液组成和反应条件进行PCR反应。《反应液组成》
模板 DNA:1pL
IOxPCR 缓冲液: SuL 2.5mM dNTP:A\\L
Taq DNA聚合酶: 0.5.uLF引物(ΙΟμΜ ):1pLR引物(ΙΟμΜ ):1pL
灭菌水:_37.5uL
合计:50μ1_,反应条件以“热变性/解离:95°C (60秒)一退火:55°C (60秒)一合成、伸长:72°C (60秒)”为I个循环，共计35个循环。将获得的hDlk-Ι的细胞外区域(人FAl)的cDNA克隆于pCRII载体(Invitrogen)中(pCRI1-hFAl)。用测序仪确认克隆的人FAl的cDNA。从pCRI1-hFAl 中切出含有人 FAl cDNA 的 EcoRI/XhoI 片段，插入到 pcDNA4/Myc-His 载体(Invitrogen)的 EcoRI/XhoI 位点(pcDNA4_hFAl)。在该表达载体中在 C 末端侧添加Myc标签和His标签序列，人FAl作为与Myc标签和His标记的融合蛋白质表达。以融合蛋白质作为抗原，通过常规方法，对兔进行免疫，制作抗hDlk-Ι多克隆抗体。3.hDlk-Ι基因的EGF样基序缺失突变体的制作为了用于抗hDlk-Ι单克隆抗体的表位分析，如下制作hDlk-1基因的EGF样基序
缺失突变体。首先，制作用于通过PCR法扩增该区域的引物。制作的各引物序列示于下表I。此时，在F引物上添加NotI限制性酶切序列，在R引物中添加XbaI限制性酶切序列。但是，在用于扩增EGF (4-6)和EGF (5_6)的区域的R引物上不添加XbaI限制性酶切序列。而且，表I中的构建体栏中，例如“EGF (1-4)”的记载是指存在于hDlk-Ι的FA-1区域中的6个EGF样基序(EGF-1 EGF-6)中由EGF-1到EGF-4的连续区域。表I
权利要求
1.一种在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1的抗体。
2.根据权利要求1所述的抗体,其中,抗肿瘤活性为肿瘤血管生成抑制活性。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中，抗体为单克隆抗体。
4.根据权利要求1 3中任意一项所述的抗体，其中，肿瘤为选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。
5.根据权利要求1 4中任意一项所述的抗体，其中，抗体是基因重组抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中，基因重组抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
7.一种抗人Dlk-1的单克隆抗体，其由保藏号为FERMBP-10707的杂交瘤产生。
8.一种抗人Dlk -1的单克隆抗体，其由保藏号为FERM BP-10900的杂交瘤产生。
9.根据权利要求1 8中任意一项所述的抗体，其与保藏号为FERMBP-10707或FERMBP-10900的杂交瘤所产生的单克隆抗体结合的部位结合。
10.根据权利要求1 9中任意一项所述的抗体，其与序列号2所示的人Dlk-1的氨基酸序列中的第26位 第85位的氨基酸构成的区域、或第131位 第244位的氨基酸所构成的区域中的至少一部分结合。
11.一种来源于权利要求1 10中任意一项所述的抗体的抗体片段。
12.—种产生权利要求1 10中任意一项所述的抗体的杂交瘤。
13.一种保藏号为FERM BP-10707的、产生抗人Dlk-1的单克隆抗体的杂交瘤。
14.一种保藏号为FERM BP-10900的、产生抗人Dlk-1的单克隆抗体的杂交瘤。
15.一种抗体-药剂复合体，其含有权利要求1 10中任意一项所述的抗体和具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物。
16.一种抗体片段-药剂复合体，其含有权利要求11所述的抗体片段和具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物。
17.根据权利要求15或16所述的复合体，其中，抗肿瘤活性为肿瘤血管生成抑制活性。
18.根据权利要求15 17中任意一项所述的复合体，其中，肿瘤为选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。
19.一种药物组合物，其含有选自于由权利要求1 10中任意一项所述的抗体、权利要求11所述的抗体片段和权利要求15 18中任意一项所述的复合体构成的组中的至少I种。
20.根据权利要求19所述的组合物，其用于肿瘤的治疗。
21.根据权利要求20所述的组合物，所述肿瘤的治疗为抑制肿瘤血管生成。
22.根据权利要求20或21所述的组合物，其没有体重减少的副作用。
23.根据权利要求19所述的组合物，其用于肿瘤的诊断。
24.根据权利要求19 23中任意一项所述的组合物，其中，肿瘤选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。
25.一种肿瘤治疗剂，其含有选自于由权利要求1 10中任意一项所述的抗体、权利要求11所述的抗体片段和权利要求15 18中任意一项所述的复合体构成的组中的至少I种。
26.根据权利要求25所述的治疗剂，其没有体重减少的副作用。
27.根据权利要求25或26所述的治疗剂，其中，肿瘤为选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。
28.一种肿瘤血管生成抑制剂，其含有选自于由权利要求1 10中任意一项所述的抗体、权利要求11所述的抗体片段和权利要求15 18中任意一项所述的复合体构成的组中的至少I种。
29.根据权利要求28所述的抑制剂，其没有体重减少的副作用。
30.根据权利要求28或29所述的抑制剂，其中，肿瘤为选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。
31.一种肿瘤诊断剂,其含有选自于由权利要求1 10中任意一项所述的抗体、权利要求11所述的抗体片段和权利要求15 18中任意一项所述的复合体构成的组中的至少I种。
32.根据权利要求31所述的诊断剂，其中，肿瘤为选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少I种。
33.一种肿瘤的治疗用、诊断用或检测用试剂盒，其含有选自于由权利要求1 10中任意一项所述的抗体、权利要求11所述的抗体片段和权利要求15 18中任意一项所述的复合体构成的组中的至少I种。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中，肿瘤为选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组 中的至少I种。
全文摘要
本发明提供与hDlk-1特异性反应且在体内具有抗肿瘤活性的抗体(抗hDlk-1抗体)、该抗体的片段、产生该抗体的杂交瘤、该抗体或抗体片段与药剂的复合体、含有该抗体等的药物组合物、肿瘤治疗剂、肿瘤血管生成抑制剂、肿瘤诊断剂、肿瘤的检测方法以及肿瘤的检测用和/或诊断用试剂盒等。
文档编号G01N33/577GK103073641SQ201210243678
公开日2013年5月1日 申请日期2007年11月12日 优先权日2006年11月10日
发明者中村康司, 田岛理惠 申请人:株式会社立富泰克