专利名称：：人卵巢癌肿瘤标志物he4酶联免疫诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程及疾病检测诊断试剂方法
技术领域：
，特别是HE4基因合成、载体构建、蛋白表达及纯化，HE4用于ELISA试剂盒及其制法。
背景技术：
：卵巢癌发病隐匿，预后差，是女性最致命的恶性肿瘤之一。如果能在早期诊断卵巢癌将大大提高治愈率，但是卵巢癌患者发现时往往已经到了晚期。目前诊断卵巢癌和监测其复发最为敏感的指标是检测血清CA125。晚期卵巢癌患者中有80。/。能检测到CA125的升高，而在早期仅有50~60%，并且CA125在某些良性疾病中也会上升，导致一些不必要的手术，大大限制了它的临床应用。于是，许多学者都致力于寻找更为有效的肿瘤标记物，以便早日确诊卵巢癌。人附睾分泌蛋白4(humanepididymisprotein4,HE4)最早在人的附睾上皮细胞中发现。1999年，Schummer等发现HE4的mRNA在卵巢癌组织中高表达，而在正常组织中低表达或不表达。2003年，Hellstrom等发现HE4在卵巢癌患者的血清中的含量也比正常人有明显增高。因而，HE4作为一个新的卵巢癌的肿瘤标志物，得到了人们更加深入的研究。Hellstrom等人证实，在特异性为100%的情况下，HE4检测卵巢癌的灵敏度为60%，而经典卵巢癌肿瘤标记物CA125的灵敏度仅为13%，而且HE4检测早期卵巢癌的敏感性也明显优于CA125。为进一步证实和扩展HE4在卵巢癌的早期检测和病程监控方面的应用前景，在美国已有近十项临床研究和临床试验正在进行。
发明内容本发明的目的是提供一种HE4基因合成方法、蛋白表达，合成简单，产品纯度高，另外还提供人卵巢癌肿瘤标记物HE4的ELISA试剂盒制备方法，为卵巢癌早期诊断、疗效观察及预后判断提供一种简便快捷、经济可靠的检测方法。本发明所采用的技术方案是HE4基因合成根据Genbank中公布的人HE4的基因序列并结合大肠杆菌偏爱密码子设计并合成八条PCR引物，通过重叠PCR方法获得HE4基因。所述HE4蛋白表达将合成获得的HE4基因克隆入pGEX-4Tl载体中，在大肠杆菌中表达并纯化出重组GST-HE4蛋白。经凝血酶切割并纯化得到HE4蛋白纯品。所述试剂盒的制法纯化HE4蛋白免疫新西兰兔，制备并纯化多克隆抗体，用纯化HE4蛋白免疫小鼠，通过细胞融合获得杂交瘤细胞株，以此杂交瘤细胞免疫小鼠，制备腹水，腹水中抗体经纯化后用辣根过氧化物酶标记，以多克隆抗体作为捕获抗体，以酶标记单克隆抗体作为检测抗体，建立检测人HE4双抗体夹心ELISA的试剂盒。目前国内尚无HE4检测试剂盒生产，本发明所研制的试剂盒可望替代进口同类产品，为国家节省大量外汇，可使我国卵巢癌的诊断检测技术达到世界先进水平。本试剂盒具有高度稳定性、敏感性及特异性，操作简单、快速，适合于卵巢癌的早期、快速诊断。较国外同类产品相比成本便宜，性价比高。图1是本试剂盒的制备工艺流程图。图2是经重叠PCR获得的HE4基因DNA片段及重组载体pGEX-4Tl-HE4的双酶切鉴定结果图。其中，1:HE4基因的PCR结果；2:MarkerDL2000;3:MarkerDL2000;4:pGEX-4Tl-HE4双酶切结果。图3是GST-HE4融合蛋白IPTG诱导表达的SDS-PAGE电泳(12%)，酶切后HE4蛋白的纯化结果及免疫印迹鉴定结果图。其中，1:pGEX-4Tl空载体诱导结果；2:pGEX-4Tl-HE4未诱导对照；3:pGEX-4Tl-HE4诱导结果；4:蛋白Marker;5:蛋白Marker;6:GST-HE4融合蛋白酶切去除GST后的纯化结果；7:蛋白Marker;8:酶切并纯化后HE4蛋白的免疫印迹结果。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。实施例l:HE4基因的构建、蛋白表达、纯化及鉴定1.HE4基因的扩增根据Genbank中所提供的人HE4mRNA序列(NM一006103)，去除N末端30个信号肽，根据大肠杆菌偏爱密码子，设计合成了8个引物，分别命名为P1P8，引物由大连宝生物公司合成。P1P8核苷酸序列组成Pl:tggttgtgctactttttgttctttacctaatgataaagaaggttcttgtcP2:ctaattgaggaaaattaatattaacttgaggacaagaaccttctttatcaP3:tctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttP4:ttgagaatcaacttgacattgatcacgacataaacctaattgaggaaaatP5:ctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtttctgattctgaatgtgctgatP6:caaccattacgacaacatttcatttgaccaggacattgagaatcaacttgP7:cgggatccgaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtaP8:ccgctcgagttattaaaaattaggagtaacacaagaaactttaccacaaccattacgacaa在P7和P8引物的5'端分别引入BamHI和XhoI酶切位点，重叠PCR方法全人工合成HE4基因。第一轮反应将P1和P2配对，生成产物P12，第二轮PCR以P12作为模板，P3和P4作为引物生成产物P34，第三轮PCR以P34作为模板，P5和P6作为引物生成产物P56，第四轮PCR以P56作为模板，P7和P8作为引物生成HE4基因。PCR反应按常规方法进行，琼脂糖凝胶电泳观察结果。结果应用重叠PCR拼接方法，成功获得了HE4基因，片段长度与预期一致。HE4基因核苷酸序列1gaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtt61tctgattctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttttgt121ctttacctaatgataaagaaggttcttgtcctcaagttaatattaattttcctcaatta181gtttatgtcgtgatca^tgtcaagttgattctcaatgtcctggtcaaatgaaatgttgt241cgtaatggttgtggtaaagtttcttgtgttactcctaatttt2822.pGEX-4Tl-HE4表达载体的构建载体pGEX-4Tl以及经琼脂糖凝胶纯化后的HE4基因片段，用BamHI和Xhol双酶切处理，酶切产物经琼脂糖凝胶纯化后连接，得到重组质粒pGEX-4Tl-HE4，重组质粒经双酶切鉴定，同时由大连宝生物公司测序。将重组质粒pGEX-4Tl-HE4转化大肠杆菌，得到pGEX-4Tl-HE4的重组克隆菌落。结果，成功获得了重组质粒pGEX-4Tl-HE4，酶切鉴定结果如图2所示。重组质粒的测序结果经计算机分析，表明重组的HE4片段与设计序列完全一致。3.GST-HE4融合蛋白的表达pGEX-4Tl-HE4的重组克隆菌落在含100pg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养，A綱达到0.5左右时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0.5mmol/L，诱导时间为3h，诱导温度为37'C，收集菌体后取少量样品经12%SDS-PAGE电泳观察。结果，pGEX-4Tl-HE4的重组克隆菌诱导表达产物经12%SDS-PAGE电泳确定，表达的融合蛋白分子量约为37kD(图3)。将该融合蛋白命名为GST-HE4。4.GST-HE4融合蛋白表达形式的分析诱导后的细菌4n，8000rpm离心10min，收集菌体，PBS洗涤一次，8000rpm离心10min，湿菌用PBS重悬，置于冰浴中，超声破菌，12000rpm离心20min，上清和沉淀分别进行12%SDS-PAGE电泳。结果，12%SDS-PAGE电泳结果显示，GST-HE4融合蛋白为胞浆可溶性表达。5.GST-HE4融合蛋白的纯化和定量收集诱导后的细菌，PBS洗涤一次，湿菌沉淀用PBS重悬，置于冰浴中，超声破碎，12000rpm离心20min，上清为待纯化的蛋白样品。将GST-SepharoseTM填料装于纯化柱中，将纯化柱与Akta纯化仪连接，用PBS缓冲液(按照说明书提供的方法配制)平衡5个柱体积，待纯化的蛋白样品以1.5ml/min速度上样，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用蛋白洗脱缓冲液洗脱，收集蛋白峰，洗脱液在PBS中4'C透析过夜，取小样12%SDS-PAGE电泳分析纯化效果。透析后的纯化蛋白用Bradford法测定蛋白浓度。结果，GST-HE4融合蛋白经GST亲和纯化后，SDS-PAGE电泳显示，在分子量37kD左右有单一条带，与预期值相符，凝胶薄层扫描显示蛋白纯度达90%以上，Bradford法测定蛋白浓度为2mg/ml。6.GST-HE4融合蛋白的酶切与纯化按10U/mg的浓度向纯化的GST-HE4融合蛋白中加入凝血酶，22。C酶切16h，经GlutathioneSepharose4B琼脂糖凝胶柱纯化，收集流出液，流出液进一步纯化去除其中的凝血酶，得到高纯度的HE4蛋白，取小量样品用12%SDS-PAGE进行电泳分析。结果，酶切后得到高纯度的HE4蛋白，分子量10kD左右(图2)，Bradford法测定蛋白浓度为lmg/ml。7.酶切后HE4蛋白的免疫印迹鉴定参照《分子克隆》中所述方法进行。电转移条件为100V电泳lh，封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST，一抗为商品化的鼠抗人HE4的单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，通过ECL显色系统进行免疫印迹分析。结果，酶切后的HE4蛋白能与鼠抗人HE4的单克隆抗体发生免疫反应(图3)。实施例2:兔抗人HE4多克隆抗体的制备1.动物免疫取纯化后的HE4蛋白500^(约500吗)，与等量弗氏完全佐剂充分乳化，采用背部皮下多点免疫法免疫新西兰大耳白兔，以后隔两周免疫一次，蛋白免疫剂量为300吗，佐剂为弗氏不完全佐剂，全程共免疫4次，末次免疫后七天兔耳缘静脉采血。间接ELISA方法测定抗体效价后，颈动脉放血，收集血清，-20。C冻存。2.兔抗人HE4多克隆抗体的纯化及效价鉴定采用ProteinG亲和层析纯化兔血清，血清用结合缓冲液(20mM的磷酸钠)按一定比例稀释，上样后用结合缓冲液洗5~10个柱体积，之后用洗脱缓冲液(O.lM的甘氨酸pH2.53.0)洗脱，收集洗脱峰，迅速向每毫升收集的洗脱液中加入100pl的1M的Tris-HCl(pH9.0)，以使抗体处于中性环境。收集的洗脱液在PBS中4"透析过夜。经ProteinG纯化的兔抗人HE4多克隆抗体再采用偶联有HE4蛋白的溴化氰活化的琼脂糖(CNBr-activedsepharose4B)柱纯化，间接ELISA方法检测纯化前后抗体效价(包被抗原为纯化的HE4蛋白)，紫外分光光度计测定抗体浓度，抗体经0.22pm滤膜过滤除菌后，-70°(:保存。结果，间接ELISA检测显示，血清纯化前效价为l:128万，纯化后效价为h64万，表明获得了高效价的兔抗人HE4多克隆抗体，抗体浓度为lmg/ml。实施例3:鼠抗人HE4单克隆抗体的制备1.动物免疫取纯化的HE4蛋白300(al(约300吗)与等量弗氏完全佐剂充分乳化，背部皮下多点注射BALB/c小鼠，共免疫3只小鼠，每只小鼠免疫抗原剂量为100pg，两周后每只小鼠以50ng抗原剂量加等量弗氏不完全佐剂充分乳化后背部皮下多点注射，以后隔两周免疫一次，每只小鼠免疫剂量为50吗，不用佐剂，免疫途径为腹腔注射，从第二次免疫开始，每次免疫后的第七天尾静脉采集小鼠血，间接ELISA方法检测血清效价(包被抗原为纯化的HE4蛋白)，效价达到1:50000以上后准备融合，融合前3天，尾静脉注射加强免疫一次，抗原剂量50^g。2.杂交瘤细胞株的建立2.1细胞融合免疫小鼠经眼球放血后，无菌摘取小鼠的脾脏，分离脾细胞，经台盼兰染色计数，取约"108个脾细胞，约3xlO"个SP2/0骨髓瘤细胞，将两种细胞混合于50ml无菌离心管中，1200rpm离心5min，弃上清，轻弹管底，使沉淀细胞松散成均匀糊状。于37"C水浴中，一手轻轻转动离心管，另一手用滴管在1min内匀速缓慢滴入1ml50%PEG4000，然后依次在1min内匀速滴入1mlRPMI-1640无血清培养基，2min内匀速滴入2mlRPMI-1640无血清培养基，5min内匀速滴入10mlRPMI-1640无血清培养基。细胞悬液于800rpm离心8min，弃上清，用HAT选择培养重悬浮并混匀。将细胞悬液加入96孔细胞培养板中，100pl/孔，于37°C，含5%C02的细胞培养箱中培养。第10天换HT选择培养基，第14天换含20%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基。结果，细胞融合后第7天可见融合的细胞克隆，融合率达90%以上。2.2阳性克隆的筛选与克隆化细胞融合后23周，当杂交瘤细胞长至孔底面积1/5以上时，用纯化的HE4蛋白作为检测抗原，通过间接ELISA方法进行筛选，筛选出能与HE4蛋白反应的杂交瘤细胞(以与阴性血清A450的比值大于2.1判为阳性)，用有限稀释法连续亚克隆3次(第1次亚克隆用HT选择培养液，第2和第3次改用普通RPMI-1640完全培养基)，每次亚克隆后7-10天进行筛选，直至单克隆细胞阳性孔率为100%时，挑取单克隆进行扩大培养后液氮冻存。结果，共获得3株能稳定分泌抗人HE4蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为Hl、B6禾卩F4。2.3单抗亚型的鉴定应用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(购自Hycultbiotechnology公司)鉴定单抗亚型，按操作说明将三株杂交瘤上清分别用PBS(pH7.4)适当稀释，至抗体浓度1-50pg/ml，加500^试剂盒中提供的稀释液至含一条k型试纸条的检测管中，再加500pl稀释好的待检样品至检测管中，将试纸条完全浸入并轻轻搅动，再向检测管中加入lml试剂盒中提供的RAM-kappa，使试纸条打印面朝下，室温振荡30min左右，观察结果。结果，三株杂交瘤上清的单抗亚型均鉴定为IgGl类，轻链亚型均为k链。3.腹水制备与纯化弗氏不完全佐剂致敏BALB/c小鼠，500pl/只。致敏一周后腹腔注射杂交瘤细胞悬液(选择H1杂交瘤细胞株，细胞数5xl06~lxl07)，710天后采集小鼠腹水，12000rpm,离心5min收集上清。二氧化硅吸附法对腹水进行预处理，采用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法进行纯化将预处理过的腹水与醋酸缓冲液(0.06mol/L,pH5.0)按体积比1:2混合，用1mol/L的HC1调pH至4.8;按每毫升混合液加11^辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，4°C静置2h，12000rpm离心30min，上清经125pm尼龙筛过滤后加入1/10体积的PBS，用1mol/L的NaOH调pH至7.2;在4匸下加入饱和硫酸铵，静置1h;12000rpm离心30min，弃上清，沉淀溶于适量PBS(含137mmol/LNaCl，2.6mol/LKCl，0.2mmol/LEDTA)中，用100倍以上体积的PBS，4"C透析过夜，最后12000rpm离心30min，收集上清，紫外分光光度计测定纯化后单克隆抗体含量，0.22pl滤膜过滤后于-70。C保存。结果，紫外分光光度计测定抗体浓度为15mg/ml。4.纯化后鼠抗人HE4单克隆抗体的间接ELISA鉴定以纯化的HE4蛋白作为检测抗原，将纯化后的小鼠腹水倍比稀释，以1:200稀释的正常小鼠血清作为阴性对照，应用间接ELISA方法检测，以与阴性血清的比值大于2.1判段为阳性，计算单抗效价。结果，纯化的小鼠腹水的效价达到1:256000。5.辣根过氧化物酶标记纯化的单克隆抗体用过碘酸盐氧化法获得酶标二抗溶解5mg辣根过氧化物酶于1.2ml超纯水中，加入新配制的0.1mol/L的过碘酸钠0.3ml,室温静置20min，将上述溶液在1mmol/L的醋酸钠中4。C透析24h，期间每4h更换透析液。用0.02mol/L的碳酸钠溶液制备单抗样品至10mg/ml，将0.5ml制备好的抗体溶液加入经透析的辣根过氧化物酶溶液中，室温静置2h，在混合液中加入100pl硼氢化钠(4mg/ml的水溶液)，4'C反应2h，向混合液中加入等体积的饱和硫酸铵，4°。反应30min后12000rpm离心15min，弃上清，沉淀溶于1ml的PBS中，在PBS中透析过夜，次日12000rpm离心15min后取上清加入等体积的甘油，分装后-70'C保存。取少量酶标二抗，用纯化的HE4作为包被抗原，间接ELISA方法检测。结果，经间接ELISA方法检测酶标单抗可在1:10000稀释下获得良好的检测效果。实施例4:人卵巢癌肿瘤标志物HE4双抗体夹心ELISA检测方法的建立1.检测方法在本实施例中，应用实施例2中获得的兔抗人HE4多克隆抗体为捕获抗体，以实施例3中获得的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人HE4单克隆抗体作为检测抗体，建立检测卵巢癌肿瘤标志物HE4的多抗和单抗双抗体夹心ELISA方法。2.酶标板包被用包被液(0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，pH9.6)将兔抗人HE4多克隆抗体稀释成10pg/ml，混匀，96孔酶标板中每孔加入100pl稀释好的多抗溶液，将酶标板密封于4t:过夜。3.酶标板封闭用含有3%鱼明胶和5%蔗糖的PBS作为封闭液。将包被过夜的酶标板拍干，每孔加入200pl封闭液，37'C封闭lh，用洗板液(TBST)洗板3次后将酶标板拍干。酶标板干燥后密封入装有干燥剂的金属箔袋内，4"C保存。4.被检血清的处理被检血清用样品稀释液(含1%BSA和0.05%吐温-20的PBS)做适当比例的稀释。100^1/孔，37"C反应lh后用洗板液洗板3次后将酶标板拍干。5.酶标二抗的处理酶标二抗保存于含50%甘油的PBS中，用pH7.2的PBS做1:10000稀释后使用，现用现配。100pl/L，37'C反应30min后用洗板液洗板3次后将酶标板拍干。6.显色和终止用TMB显色系统进行显色。显色液配制A液(0.05mol/L的柠檬酸，0.1mol/L的磷酸氢二钠)6ml+B液(含2mg/mlTMB的无水乙醇中)0.3ml+C液(0.75%H202)20^1，现用现配，50(!l/孔，37"C避光反应15min，之后加入2M的硫酸，50pl/孔。7.检测结果本实验结果以ELISA实验的A45o值表示。8.对照阴性对照孔的检测样品为不加血清的样品稀释液，纯化好的HE4蛋白作为阳性标准品。实施例5:人卵巢癌肿瘤标志物HE4双抗体夹心ELISA试剂盒的组成1.ELISA板已包被好纯化的兔抗人HE4多克隆抗体并已进行了封闭。2.待检样品稀释液含l。/。BSA和0.05。/c)吐温-20的PBS。3.酶标二抗:辣根过氧化物酶标记的鼠抗人HE4单克隆抗体，保存于含50%甘油的PBS。4.酶标二抗稀释液pH7.2的PBS5.10x洗板液0.2mol/L的Tris-HCl，1.5mol/L的NaCl，0.5%的吐温漏206.显色液A液为0.05mol/L的柠檬酸和0.1mol/L的磷酸氢二钠，B液为含2mg/mlTMB的无水乙醇，C液为0.75%H202。7.终止液2M的硫酸。8.阳性标准品纯化的HE4蛋白。实施例6:人卵巢癌肿瘤标志物HE4双抗体夹心ELISA试剂盒的实验性能1.试剂盒的检测区间取包被好兔抗人HE4多克隆抗体并已进行了封闭的酶标板，每个样品做三复孔，加入用样品稀释液梯度稀释的HE4蛋白标准品，100pl/L，37"C反应1h，洗板液洗板3次，将酶标板拍干，加入l:10000稀释的酶标二抗，100^1/孔，37"C反应30min，洗板液洗板3次，将酶标板拍干，加入显色液50|il/L37°C避光反应15min，之后加入2M的硫酸，50pl/孔。酶标仪检测A45Q，以不同浓度的HE4标准品蛋白为横坐标，以相应的A^值为纵坐标，绘制标准曲线。结果，本试剂盒具有良好线性关系的检测区间为15pM~900pM，如果被检血清的HE4浓度高于次测量范围，则应使用样品稀释液稀释样品后再检测。2.试剂盒的精密度采用4份人血清标本进行测试，每份标本复孔检测，在20天内每天不同时间内进行2次检测。本检测试剂盒精密度的总CV值〈10n/。，此项研究的数据结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3.试剂盒的检测限检测限代表区别于零浓度的可检测到的HE4抗原的最低浓度。采用不含HE4蛋白的样品稀释液和4份来源于健康人的血清，后者用样品稀释液稀释至5pM，在两个独立日内进行4次检测，每次重复24次检测。结果，本试剂盒的检测限〈5pM。4.试剂盒的回收率将己知浓度的HE4蛋白加入到正常人血清标本中，对标本进行稀释，测定HE4的浓度。％回收率=测得的HE4浓度(pM)/(内源性HE4浓度(pM)+加入的HE4浓度(pM))*100%。计算本试剂盒的回收率为(100±15)%，此项研究的数据结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>5.试剂盒的应用实例使用本试剂盒共检测了65例女性血清中HE4的含量，其中健康者20例,术前经确诊为卵巢癌患者45例。在本研究中，95。/。的健康女性个体的HE4检测值位于或低于150pM，而卵巢癌患者血清中，HE4含量显著升高，95.6%达到300pM以上，本检测结果与临床资料有很高程度的一致性，与国内外相关文献的报道相符。SEQUENCELISTING<110>大连美亿德生物科技有限公司<120>人卵巢癌肿瘤标志物HE4酶联免疫诊断试剂盒<130>AnovelmultiplemarkerbioassayutilizingHE4andCA125forthepredictionofovariancancerinpatientswithapelvicmass<160>10<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成HE4引物PI<400>1tggttgtgctac臓gttctttacctaatgataaagaaggttcttgtc50<210>2<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成HE4引物P2<400>2ctaattgaggaaaattaatattaacttgaggacaagaaccttctttatca50<210>3<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成HE4引物P3<400>3tctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctacttt<210>4<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成HE4引物P4<400>4ttgagaatcaacttgacattgatcacgacataaacctaattgaggaaaat<210>5<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成HE4引物P5<400>5ctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtttctgattctgaatgtgctgat<210>6<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成HE4引物P6<400>6caaccattacgacaacatttcatttgaccaggacattgagaatcaacttg<210>7<211>54<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成HE4引物P7<400>7cgggatccgaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgta54<210>8<211>61<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成HE4引物P8<400>8ccgctcgagttattaaaaattaggagtaacacaagaaactttaccacaaccattacgaca60361<210>9<211>282<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成引物后，采用重叠PCR法拼接的HE4基因序列<400>9gaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtt60tctgattctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttttgt120tctttacctaatgataaagaaggttcttgtcctcaagttaatattaattttcctcaatta180ggtttatgtcgtgatcaatgtcaagttgattctcaatgtcctggtcaaatgaaatgttgt240cgtaatggttgtggtaaagtttcttgtgttactcctaatttt282<210>10<211>94<212>PRT<213>human<300><301>Hellstrom，I.，Raycraft,J.，Hayden-Ledbetter，M.，Ledbetter,J.A.,Schummer,M,McIntosh,M.，Drescher，C.,Urban，N.andHellstrom,K.E.<302>TheHE4(WFDC2)proteinisabiomarkerforovariancarcinoma<303>CancerRes.63(13),3695-3700(2003)<304>63<305>13<306>3695-3700<307>2003-07-01<308>AA052683<309>2005-04-14<313>(31)..(124)<400>10GluLysThrGlyValCysProGluLeuGinAlaAspGinAsnCysThr151015GinGluCysValSerAspSerGluCysAlaAspAsnLeuLysCysCys202530SerAlaGlyCysAlaThrPheCysSerLeuProAsnAspLysGluGly354045SerCysProGinValAsnlieAsnPheProGinLeuGlyLeuCysArg505560AspGinCysGinValAspSerGinCysProGlyGinMetLysCysCys65707580ArgAsnGlyCysGlyLysValSerCysValThrProAsnPhe8590权利要求1、一组HE4基因合成引物，其特征是根据GenBank中人HE4基因序列并结合大肠杆菌偏爱密码子设计并合成PCR引物，PCR引物核苷酸序列组成P1tggttgtgctactttttgttctttacctaatgataaagaaggttcttgtcP2ctaattgaggaaaattaatattaacttgaggacaagaaccttctttatcaP3tctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttP4ttgagaatcaacttgacattgatcacgacataaacctaattgaggaaaatP5ctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtttctgattctgaatgtgctgatP6caaccattacgacaacatttcatttgaccaggacattgagaatcaacttgP7cgggatccgaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtaP8ccgctcgagttattaaaaattaggagtaacacaagaaactttaccacaaccattacgacaa。2、人工合成的HE4基因，其特征是根据权利要求1设计的引物，通过重叠PCR方法获得HE4基因，基因序列如下1gaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtt61tctgattctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttttgt121tctttacctaatgataaagaaggttcttgtcctcaagttaatattaattttcctcaatta181ggtttatgtcgtgatcaatgtcaag11ga11ctcaatgtcctggtcaaatgaaatg11gt241cgtaatggttgtggtaaagtttcttgtgttactcctaatttt282。3、HE4蛋白表达，其特征是根据权利要求2所述基因，将合成获得的HE4基因通过BamHI和XhoI酶切位点克隆入pGEX-4Tl载体中，在大肠杆菌中表达并纯化出重组GST-HE4蛋白。经凝血酶切割并纯化得到HE4蛋白纯品，其氨基酸序列组成EKTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPNDKEGSCPQVNINFP()LGLCRDQCQVDSQCPGQMKCCRNGCGKVSCVTPNF。4、HE4ELISA检测试剂盒，其制备方法是用含权利要求3所述的蛋白质HE4免疫动物获得多克隆抗体和单克隆抗体，以此多克隆抗体作为捕获抗体，以单克隆抗体作为检测抗体，装配成双抗体夹心ELISA方法检测试剂盒。5、权利要求4所述的试剂盒，其特征是它可用于人卵巢癌的辅助诊断。特别是对卵巢癌患者的早期辅助诊断。全文摘要本发明公开了一种人卵巢癌肿瘤标志物HE4酶联免疫诊断试剂盒，其制备方法及用途。通过合成的HE4基因引物，采用重叠PCR方法全人工合成HE4基因；将该基因构建到pGEX-4T1表达载体中并进行蛋白表达；表达的HE4融合蛋白经酶切纯化后得到HE4纯品，并以此免疫动物，获得多克隆抗体及单克隆抗体；用兔抗人HE4多克隆抗体包被ELISA板并进行封闭，以此兔多克隆抗体为捕获抗体，以辣根过氧化物酶标记的鼠抗人HE4单克隆抗体为检测抗体，装配成检测HE4的双抗体夹心ELISA试剂盒。本试剂盒特点在于检测灵敏度高、特异性强，适于卵巢癌的早期诊断，为卵巢癌病人疗效观察及预后判断提供一种简便快捷、经济可靠的检测方法。文档编号C12N15/11GK101525614SQ200910011148公开日2009年9月9日申请日期2009年4月13日优先权日2009年4月13日发明者吴芬芳,李庆伟,王克威,王华颖,陈立勇申请人:大连美亿德生物科技有限公司