专利名称：一种用固定化酶生产果寡糖和高果糖浆的方法
技术领域：
本发明涉及果寡糖和高果糖浆的生产，具体地说是一种用固定化酶生产果寡糖和高果糖浆的方法。
背景技术：
菊粉是一种天然的果聚糖，广泛存在于多种植物的根、茎之中，如菊芋、菊苣、大丽 花、牛蒡等。它是由呋喃构形的D-果糖经β-2，1-糖苷键脱水聚合而成一类可溶性直链多 糖，且在果糖残基末端连有一个葡萄糖残基，完全水解后可以得到果糖和少量葡萄糖。菊粉 从植物中提取十分方便，也适合于酶水解反应，降解产生一系列产物(如果糖、寡聚果糖， 高果糖浆)都具有巨大的应用价值果糖是一种天然营养甜味剂，其甜度高(甜度为蔗糖的1. 8倍)、热值低，是优秀的 甜味剂和低热值食品原料，适宜于高血脂、高血压及肥胖病患者服用，特别适于糖尿病患者 服用，作为强化甜味剂，已越来越受到国内外的重视与欢迎。当前果糖的生产是利用异构酶 将葡萄糖异构化生产果糖，但这个过程的转化率低，产品中果糖的含量低(低于50%)，若 生产高含量果糖产品，须要将葡萄糖从产品中分离出去，生产技术要求高，生产成本高。果寡糖，又称为低聚果糖，分子组成为GFn (G为葡萄糖，F为果糖，η ^ 2)，是在蔗 糖分子上以β-1，2-糖苷键结合数个D-果糖而形成的一组低聚糖的总称，果寡糖具有优异 的生理功能，它可以改善肠道菌群环境，润肠通便，增强免疫力等，主要用于食品添加剂、保 健食品及饲料添加剂等领域。商品果寡糖主要是利用微生物发酵得到的果糖基转移酶 作用于蔗糖得到的。利用菊粉酶降解菊粉生产果寡糖和高果糖浆是经济可行的。菊粉是由一个葡萄糖 分子和许多个果糖分子缩合而成，完全水解后，果糖含量占80%以上，这比当前采用的异构 酶将葡萄糖异构化生产果糖的工艺简单，产品中果糖含量高，可直接生产超高果糖浆；工业 上利用菊粉酶生产低聚果糖的方法是由内切菊粉酶水解菊粉而成，产物以低聚果糖为主， 纯度高，原料便宜。但利用游离酶在降解反应完成后无法回收，造成果寡糖和高果糖浆的生 产成本高，产品价格高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用固定化菊粉酶降解菊粉生产果寡糖和高果糖浆的 方法，固定化介质价格低廉，固定化酶方法简单有效。采用这种技术生产果寡糖和高果糖 浆，可以回收并重复利用酶，降低生产成本。该方法采用固定化酶，适合间歇或连续等多种 反应方式及搅拌、填充床或流化床、膜生物反应器等各种反应器，适应于规模化生产。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种用固定化酶生产果寡糖和高果糖浆的方法，包括“氧化_固定化_还原”三步法固定化菊粉酶，并利用该固定化酶生产果寡糖和高果糖浆；具体为，
1)用过碘酸盐专一氧化菊粉酶分子中糖链的相邻羟基产生醛基，利用氧化产生的醛基与具有游离氨基的固定化载体进行偶联，利用硼氢化钠还原菊粉酶分子与固定化载体 间形成的希夫碱，得到稳定的固定化菊粉酶；所述专一氧化过程为采用过碘酸盐(如高碘酸钠)氧化菊粉酶分子中的糖链， 生成醛基基团，具体条件为，反应体系为ο. 01M-0. 2M的pH3. 0-6. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液， 体系中菊粉酶量为0. 5-5mg/ml，体系中过碘酸盐的用量为5_50mM，室温下避光氧化0. 5-2 小时之后，每Iml溶液加入0. 25-0. 4ml乙二醇反应1_5分钟，反应结束后，溶液在0_4°C用 蒸馏水透析脱盐，得活化的菊粉酶；所述具有游离氨基的固定化载体的制备过程为将固定化载体与耦联剂反应，使 固定化介质表面具有游离氨基；反应在有机相或水相体系中进行，按耦联剂与反应体系的 重量体积比g/ml计，体系中耦联剂的用量为3-20% w/v，反应温度为20-110°C，反应时间 5-24小时，得活化的固定化载体；所述固定化载体为无机或有机的多孔或微孔材料，如分 子筛、氧化铝、玻璃珠、吸附树脂或离子交换树脂等；所述耦联剂为氨丙基三乙氧基硅烷、环 氧氯丙烷、戊二醛或聚乙烯亚胺；所述利用氧化产生的醛基与具有游离氨基的固定化载体进行偶联的过程为反应 体系为0. 01-0. 2M磷酸盐缓冲溶液，PH 7. 0-9. 0，将固定化载体浸没于磷酸盐缓冲溶液，活 化的菊粉酶的用量为2-10mg酶/g湿重固定化载体，反应温度0-25°C，反应时间2_24小时；利用硼氢化钠还原菊粉酶分子与固定化载体间形成的希夫碱的过程为按重量体 积比g/ml计，于上述反应后的体系中加入0. 1-0. 5% (W/V)硼氢化钠，室温反应30-60分 钟，还原希夫碱，得到稳定的固定化菊粉酶；所述菊粉酶是指外切菊粉酶、内切菊粉酶中的一种酶或两种酶的混合物。2)按菊粉与水或弱酸性溶液重量体积比g/ml计，将5-30% (w/v)菊粉溶于水或 ρΗ4· 5-6. 0的弱酸性溶液(如ρΗ4· 5-6. 0醋酸盐缓冲液)中，得菊粉溶液；3)按固定化菊粉酶与菊粉溶液重量体积比g/ml计，采用1-10% (w/v)固定化酶 在搅拌釜中进行的间歇或连续搅拌反应，或是将固定化酶装入填充床或流化床或膜生物反 应器中，将菊粉溶液泵入反应器进行的间歇或连续反应，使底物降解，生产果寡糖和高果糖 浆。本发明同游离酶降解菊粉生产果寡糖和高果糖浆方法相比较，具有如下优点1.采用本发明的固定化技术，酶活性收率高，固定化酶稳定性好，用该固定化酶生 产果寡糖和高果糖浆，可以回收并重复利用酶，降低生产成本。2.固定化菊粉酶可以重复使用，降低果寡糖和高果糖浆的生产成本。3.固定化菊粉酶反应过程较游离酶反应过程操作灵活，可选择多种反应方式及反 应器，有利于实现工业化生产。
图1为高碘酸钠加入量与酶活力保留的关系示意图。
具体实施例方式下面通过实例对本发明的技术进一步说明。
实施例1 菊粉酶的活化取外切菊粉酶溶解于0. 1M，pH4. 5醋酸盐缓冲液中，体系中菊粉酶量为2. 5mg/ ml，制成酶活性为3863U/ml的溶液，加入不同量的高碘酸钠(体系中过碘酸盐的用量为 0-50mM)，室温下避光氧化1小时之后，每Iml溶液加入0. 25ml乙二醇反应2分钟，反应结 束后溶液在4°C用蒸馏水透析过夜。如图1所示，高碘酸钠加入量与酶活力保留的关系为在 高碘酸钠用量在0-20mM范围时，酶活力保留较高(95%以上)，高碘酸钠用量在30_50mM范 围是酶活力损失较大(酶活力保留79-65% )，但该条件下酶分子中产生的醛基量多。实施例2 多孔氧化铝微球固定化外切菊粉酶 将预先脱水脱气的18目多孔氧化铝微球装入玻璃容器，加入30% (ν/ν)氨丙基三 乙氧基硅烷甲苯溶液至浸没多孔氧化铝微球，加热使甲苯回流12h。取已反应完毕的多孔氧 化铝微球，依次用甲苯、异丙醇、水洗涤，即为活化的多孔氧化铝微球。将已活化的多孔氧化 铝微球和活化外切菊粉酶加入到磷酸盐缓冲液中(0. 2M，pH7. 8 ；酶浓度2mg/ml，总酶量6mg 酶/克湿重活化的多孔氧化铝微球)，4°C反应24h，间歇搅拌，反应完成后，加入0. 1% (W/ V)硼氢化钠，室温反应40分钟，还原希夫碱，得到稳定的固定化菊粉酶。酶活收率30%。实施例3 分子筛固定化外切菊粉酶取3A、4A、5A分子筛，同实施例2方法活化，将已活化的分子筛和活化外切菊粉 酶加入到磷酸盐缓冲液中(ο. 2M，pH7. 8 ；酶浓度2mg/ml，总酶量4mg酶/克湿重活化的分子 筛)，4°C反应24h，间歇搅拌，反应完成后，加入0. 1% (W/V)硼氢化钠，室温反应40分钟，还 原希夫碱，得到稳定的固定化菊粉酶。酶活收率20-30%。实施例4 多孔玻璃珠固定化内切菊粉酶取多孔玻璃珠同实施例3方法固定化内切菊粉酶，酶活收率20%。实施例5 异丁烯酸酯交联树脂固定化菊粉酶缩水甘油-异丁烯酸酯交联树脂，内表面经聚乙烯亚胺处理带有游离氨基 (ZH-HA,香港 GeneRad Biotech laboratory Ltd 提供)，取 0. 5 克 ZH-HA 载体，加入到 IOml 0. lmol/L磷酸二氢钾溶液中(pH 7. 8)，维持该pH值，静置1小时，过滤，抽干；将该载体加 入到已活化的外切菊粉酶溶液中(2575单位酶溶于20mM/ml pH 7. 8磷酸盐缓冲液中)，室 温，于低速摇床反应5小时；反应结束后用加入0.2% (W/V)硼氢化钠，室温反应20分钟， 得到稳定的固定化菊粉酶。酶活收率23%。实施例6 离子交换树脂固定化外切菊粉酶取离子交换树脂D392，依次用乙醇，水，IN氢氧化钠，5%氯化钠，IN盐酸，IN氢氧 化钠，水清洗；脱气；将树脂悬浮于PH7. 8,0. 2M磷酸盐缓冲液中，加入已活化外切菊粉酶 4V反应24h，间歇搅拌，酶用量为5mg/ml树脂。实施例7 固定化菊粉酶降解菊粉反应1在玻璃反应器中，将5_30g菊粉溶于IOOml的水或弱酸性溶液(pH4. 5-6. 0的醋 酸盐缓冲液)中，加入4ml实施例5所述的固定化菊粉酶，60°C搅拌反应2h，90%以上的菊 粉被水解成单糖；反应液过滤回收固定化酶，用水清洗后重新投入反应器进行上述反应，50 批操作之后，固定化酶仍保持了原有的催化活力。实施例8 固定化菊粉酶降解菊粉反应2在不锈钢反应器中，将300g菊粉溶于2000ml的水溶液中；将80ml实施例5所述的固定化菊粉酶装入玻璃柱中，制成固定化酶柱；将菊粉溶液泵入固定化酶柱进行反应，反应流出液回到不锈钢反应器中，如此循环反应，反应温度60°C，反应时间6h;反应完成后， 放掉反应液，用水清洗固定化酶柱，重新开始上述反应；共进行14批反应，固定化酶活性仍 保留80%以上。
权利要求
一种用固定化酶生产果寡糖和高果糖浆的方法，其特征在于包括“氧化-固定化-还原”三步法固定化菊粉酶，并利用该固定化酶生产果寡糖和高果糖浆；具体为，1)用过碘酸盐专一氧化菊粉酶分子中糖链的相邻羟基产生醛基，利用氧化产生的醛基与具有游离氨基的固定化载体进行偶联，利用硼氢化钠还原菊粉酶分子与固定化载体间形成的希夫碱，得到稳定的固定化菊粉酶；2)按菊粉与水或弱酸性溶液重量体积比g/ml计，将5-30％(w/v)菊粉溶于水或pH4.5-6.0的弱酸性溶液中，得菊粉溶液；3)按固定化菊粉酶与菊粉溶液重量体积比g/ml计，采用1-10％(w/v)固定化酶在搅拌釜中进行的间歇或连续搅拌反应，或是将固定化酶装入填充床或流化床或膜生物反应器中，将菊粉溶液泵入反应器进行的间歇或连续反应，使底物降解，生产果寡糖和高果糖浆。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述弱酸性溶液为pH4.5-6. 0醋酸盐缓 冲液；所述过碘酸盐为高碘酸钠；步骤1)中所述固定化载体为无机或有机的多孔或微孔材 料。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述固定化载体为分子筛、氧 化铝、玻璃珠、吸附树脂或离子交换树脂。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述菊粉酶是指外切菊粉酶、内切菊粉酶 中的一种酶或两种酶的混合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述专一氧化过程为，采用过 碘酸盐氧化菊粉酶分子中的糖链，生成醛基基团，具体条件为，反应体系为0. 01M-0. 2M的 PH3. 0-6. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液，体系中菊粉酶量为0. 5-5mg/ml，体系中过碘酸盐的用量 为5-50mM，室温下避光氧化0. 5-2小时之后，每Iml溶液加入0. 25-0. 4ml乙二醇反应1_5 分钟，反应结束后，溶液在0-4°C用蒸馏水透析脱盐，得活化的菊粉酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述具有游离氨基的固定化载 体的制备过程为，将固定化载体与耦联剂反应，使固定化介质表面具有游离氨基；反应在有 机相或水相体系中进行，按耦联剂与反应体系的重量体积比g/ml计，体系中耦联剂的用量 为3-20% w/v，反应温度为20-110°C，反应时间5_24小时，得活化的固定化载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述耦联剂为氨丙基三乙氧基硅烷、环氧 氯丙烷、戊二醛或聚乙烯亚胺。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述利用氧化产生的醛基与具 有游离氨基的固定化载体进行偶联的过程为，反应体系为0. 01-0. 2M磷酸盐缓冲溶液，pH 7. 0-9. 0，将固定化载体浸没于磷酸盐缓冲溶液，活化的菊粉酶的用量为2-10mg酶/g湿重 固定化载体，反应温度0-25°C，反应时间2-24小时；利用硼氢化钠还原菊粉酶分子与固定化载体间形成的希夫碱的过程为，按重量体积比 g/ml计，于上述反应后的体系中加入0. 1-0. 5% (W/V)硼氢化钠，室温反应30-60分钟，还 原希夫碱，得到稳定的固定化菊粉酶。
全文摘要
本发明提供一种用固定化酶生产果寡糖和高果糖浆的方法，包括“氧化-固定化-还原”三步法固定化菊粉酶，并利用该固定化酶生产果寡糖和高果糖浆，采用这种固定化技术，酶活性收率高，固定化酶稳定性好，用该固定化酶生产果寡糖和高果糖浆，可以回收并重复利用酶，降低生产成本。
文档编号C12P19/14GK101845470SQ20091001087
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月25日 优先权日2009年3月25日
发明者曹海龙, 李曙光, 杜昱光, 白雪芳, 袁中一, 赵静玫, 陈伟, 陈受衍 申请人:中国科学院大连化学物理研究所