专利名称：：食品中三种产芽孢菌的检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及食品中三种产芽孢菌的检测试剂盒及其检测方法。尤其涉及用于PCR-DHPLC快速高通量检测的试剂盒及其相应的检测方法。
背景技术：
：一直认为食品加工过程中热处理会破坏所有微生物群落，但实际研究发现，超高温处理食品中仍会有耐热性菌以及芽胞残留；尤其巴氏加热法处理的食品，只能杀死其中大部分细菌，仍存在大部分嗜热菌及耐热性菌以及芽胞等。同时，即使超高温处理，芽胞菌产生的毒素也不会被灭活，残存的芽胞菌及毒素是热加工食品中潜在的生物危险因子。适宜条件下，残存细菌重新繁殖并产生毒素。热加工处理食品中残存的未知芽胞杆菌污染及其产生毒素导致的食源性疾病经常发生，是潜在食品卫生和安全隐患。至少包括蜡样芽胞杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌等多种芽胞杆菌可能在热加工处理食品中存在。产毒素芽胞菌如蜡样芽胞杆菌产生的肠毒素，肉毒梭状芽胞杆菌产生的肉毒毒素等在超高温处理过程下，仍保持活性。热加工处理食品中产孢子菌及其毒素对食品卫生和安全的影响应该引起重视。肉毒梭菌所致食物中毒，是肉毒梭菌在食品中于厌氧状态下繁殖产生外毒素而引起的一种典型的毒素型中毒。此毒素毒性极强，人的最小致死量为0.1jig。最早报告本菌引起的食物中毒，是1895年在比利时因吃腌制火腿所引起的20多人中毒的事件，在火腿痩肉和死者内脏中都检出肉毒梭菌。引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品等。在美国以家制罐头发生中毒的较多，日本以鱼制品较多。在我国主要与堆放牛羊肉和发酵食品等有关，由香肠引起的肉毒中毒事件也有报告。蜡样芽胞杆菌食物中毒所涉及的食品种类繁多，包括奶类食品、禽畜肉类制品、蔬菜、汤汁、豆芽和米饭等。在我国引起中毒的食品大多与米饭或淀粉类制品有关，欧美国家多由甜点心、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起。蜡样芽胞杆菌食物中毒是由于该菌产生肠毒素所致。大量活菌的存在，不仅可使肠毒4素量增高，且可促进中毒发生。近年来，英国发生5起蜡样芽胞杆菌严重食物中毒事件。在我国部分地区，蜡样芽胞杆菌食物中毒占细菌性食物中毒的首位。由于产芽孢杆菌类培养条件较为特殊，国内外缺少检测、鉴定和定量产孢子菌类的快速和易用的检测技术和检测试剂盒。欧盟食品安全规范中除了蜡样芽孢杆菌和亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌及嗜温芽胞杆菌外，没有产芽孢杆菌类的检测标准方法。在我国，对产芽孢杆菌检测还多停留在检测效率低、目标单一的水平上，还主要依靠传统的增菌、分离、生化鉴定方法，一般说来鉴定一种产芽孢细菌需要1020天，这就影响了检测鉴定的周期，该现状显然不能满足目前食品安全迅速发展的需求。即便现在已经发展起来了PCR和实时PCR技术，但也仅可达到对己知的常规致病菌进行检测。而对于混合微生物样本、不常见的、苛刻的、发生变异的芽孢细菌则缺乏稳定而可靠的鉴定手段。因此，急需建立高效、快捷、简便的检测方法。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于灵敏快速检测食品中三种产芽孢菌，包括蜡样芽胞杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌、产气荚膜梭菌的mPCR-DHPLC检测试剂盒。本发明所述的试剂盒包括浓度为5U尔L的TaqDNA聚合酶和PCR反应液；其中的PCR反应液中含10mMTris'HCl、50mMKC1、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM及3种产芽孢菌的引物对各10pM，所述的引物对序列如下菌株上、下游引物序列(5'-3')肉毒梭菌5，.-TTTGTAACTATN!ACTAATN2AT-3，5，'-ATN3N4CCCCAAN5AN6TN7N8TTN9AA画3，产气荚膜梭菌5，.-GCGAATATGCTGAATCATCTA匪3'5，.-GCAGGAACATTAGTATATCTT-3'蜡样芽孢杆菌5，.-AACAGCGTTGAAACGAGTGG-3'5，.-ATTTGGTGGAAGAGGGATTAC-3'其中，Ni是A、T或C;N2是A或G;N3是C或T;Kt是A或T;Ns是A或T;Ne是G或A;N7是C或T;N8是C或T;N9是C或T;试剂盒保存条件-20°(:保存。本发明还提供了利用上述试剂盒检测上述这3种产芽孢菌的方法，包括如下步骤①取2ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的PCR反应液、0.2pLTaqDNA聚合酶及灭菌超纯水12.8pL，总体积25pL;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，60。C退火60s，72。C延伸60s，35个循环；终止延伸72°C，7min;PCR产物4。C保存；②将PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下检测器荧光检测器，光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s;色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3pm;柱温50°C;流动相(体积比):O.Omin，55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B，3.5min，50.2%缓冲溶液A，49.8%缓冲溶液B，6.2min，41.8%缓冲溶液A，58.2%缓冲溶液B，8.4min，38.2%缓冲溶液A，61.8%缓冲溶液B，10.4min，36.3%缓冲溶液A，63.7%缓冲溶液B，12.4min，35.0%缓冲溶液A，65.0%缓冲溶液B，其中，缓冲溶液A为50mlTEAA和250iil乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50mlTEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；流速0.9mL/min;上样量PCR产物5juL。检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告未检出相对应的致病菌；检测样品出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品结果为可疑阳性；检测样品出现典型的PCR产物吸收峰，但吸收峰值小于3mV时，建议样本重做。重做结果峰吸收值仍小于3mV则为阴性，否则为可疑阳性。本发明采用mPCR-DHPLC技术，针对食品中三种产芽孢菌建立灵敏便捷的检测方法，并建立应用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测食品中的肉毒梭菌、产气荚膜梭菌和蜡样芽孢杆菌，并且检侧耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。本发明附图1幅，图1是使用实施例1所建立的试剂盒及检测方法检测蜡样芽胞杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌及产气荚膜梭菌的检测DHPLC谱上述附图中，横坐标均为保留时间(单位分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位毫伏mV)。具体实施例方式下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一歩的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源为细菌基因组DNA小量纯化试剂盒(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)、Taq酶及PCR缓冲液等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯)购自Transgenomic公司；乙腈(色谱纯)购自Fisher公司；普通PCR仪PE24000(PerkinElmer公司，美国)；变性高效液相色谱仪NAV画99國4500(Transgenomic公司，美国)；高速离心机centrifuge5804(Eppendorf公司，德国)。本专利研究所用标准菌株均购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)。各菌株使用菌种保存管-8(TC保存，活化培养等均按照相关的国家标准(GB)、检验检疫行业标准(SN)或国际权威标准方法进行。如表l所示表l、试验菌种及其编号序号菌株名称拉丁名1蜡样芽孢杆菌2产气荚膜梭菌73肉毒梭菌4福氏志贺氏菌5金黄色葡萄球菌6小肠结肠炎耶尔森氏菌7致病性嗜水气单胞菌8溶血性链球菌9类志贺邻单胞菌10奇异变形杆菌11单核细胞增生李斯特氏菌12鼠伤寒沙门氏菌13乙型副伤寒沙门氏菌14大肠杆菌0157:H715阪崎肠杆菌16大肠埃希氏菌17弗劳地柠檬酸杆菌实施例1、食品中三种产芽孢菌的检测试剂盒及其检测方法的建立(1)引物的设计、合成与试剂盒的组装本实施例确定用于检测的引物序列及扩增片段长度如表2所示:表2菌株上、下游引物序列(5'-3')扩增产物肉毒梭菌5，-TTTGTAACTATNiACTAATN2AT-3'5，-ATN3N4CCCCAAN5AN6TN7N8TTN9AA-3，264bp产气荚膜梭菌5，國GCGAATATGCTGAATCATCTA-3'5，-GCAGGAACATTAGTATATCTT-3'196bp蜡样芽孢杆菌5，画AACAGCGTTGAAACGAGTGG-3'5，-ATTTGGTGGAAGAGGGATTAC-3'444bp其中，N,是A、T或C;N2是A或G;N3是C或T;Ht是A或T;Ns是A或T;N6是G或A;N7是C或T;Ns是C或T;Ng是C或T;在此基础上设计用于mPCR-DHPLC检测的试剂盒。该试剂盒中包括浓度为5U/VL的TaqDNA聚合酶和PCR反应液；其中的PCR反应液中含10mMTris.HCl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP禾卩dTTP)各2.5mM及表2中3种产芽孢菌的引物对各10pM。(2)使用该试剂盒检测食品样品中三种产芽孢菌的mPCR-DHPLC方法包括如下步骤①待检样品的制备采用试剂盒提取法制备待测样品DNA基因组-检测样品加入产芽孢菌肉汤培养基分别在有氧和厌氧条件下，于37"C恒温培养48士3h。使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-2(TC保存。②PCR扩增取2ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的PCR反应液、0.2jliLTaqDNA聚合酶及灭菌超纯水12.8pL，总体积25pL;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，6(TC退火60s，72。C延伸60s，35个循环；终止延伸72°C，7min;PCR产物4。C保存；③将PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下检测器荧光检测器，光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s;色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3柱温50°C;流动相(体积比):0.0min，55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B，3.5min，50.2%缓冲溶液A，49.8%缓冲溶液B，6.2min，41.8%缓冲溶液A，58.2%缓冲溶液B，8.4min，38.2%缓冲溶液A，61.8%缓冲溶液B，10.4min，36.3%缓冲溶液A，63.7%缓冲溶液B，12.4min，35.0%缓冲溶液A，65.0%缓冲溶液B，其中，缓冲溶液A为50mlTEAA和250pl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50mlTEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；流速0.9mL/min;上样量PCR产物5pL。采用本实施例所建立的试剂盒及检测方法检测mPCR-DHPLC检测肉毒梭菌、产气荚膜梭菌和蜡样芽孢杆菌结果如附图1所示。约5.2min出现PCR产物样品吸收峰，为产气荚膜梭菌；约5.8min出现PCR产物样品吸收峰，为肉毒梭菌；约6.7min出现PCR产物样品吸收峰，为蜡样芽孢杆菌。实施例2、特异性试验表1中所有参考菌株按照实施例1所建立的方法提取基因组DNA，然后以这些基因组DNA为模板，mPCR-DHPLC，确定是否存在假阳性和假阴性。结果表明，实施例1所建立的检测试剂盒及的PCR-DHPLC检测方法，检测食品中三种产芽孢菌有很高的特异性，没有假阳性和假阴性结果。为了证实检测的样品阳性吸收峰分别为蜡样芽胞杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌和产气荚膜梭菌特异基因的片段，将DHPLC的阳性吸收峰产物回收后分别进行了克隆和测序，测序结果与三种产芽孢菌的DNA序列比对，证明了DHPLC阳性吸收峰为三种产芽孢菌的特异基因片段。实施例3、在实际样品检测中的应用(1)留存阳性样品检测结果采用实施例1所建立的食品中三种产芽孢菌的mPCR-DHPLC检测试剂盒及其检测方法，对留存阳性样品进行检测。取2株从实际检测样品中分离留存的肉毒梭菌阳性菌株，采用实施例1所建立的检测试剂盒及检测方法进行检测试验。结果该2株肉毒梭菌分离株均经DHPLC检测到了阳性扩增吸收峰，且出峰时间和峰型重现性较好，以沙门氏菌为阴性对照的检测结果则为阴性。取3株从实际检测样品中分离出的所留存的产气荚膜梭菌分离菌株，采用实施例1所建立的检测试剂盒及检测方法进行检测试验。结果该3株产气荚膜梭菌分离株均经DHPLC检测到了扩增吸收峰，且出峰时间和峰型重现性较好，以沙门氏菌为阴性对照的检测结果则为阴性。取5株从实际检测样品中分离出的所留存的蜡样芽孢杆菌分离菌株，采用实施例1所建立的检测试剂盒及检测方法进行检测试验。结果该5株蜡样芽孢杆菌分离株均经DHPLC检测到了扩增吸收峰，且出峰时间和峰型重现性较好，以沙门氏菌为阴性对照的检测结果则为阴性。(2)实际检验样品应用自2008年1月至2008年10月的10个月期间，采用实施例1所建立的食品中三种产芽孢菌的mPCR-DHPLC检测试剂盒及其检测方法，同时采用国家标准GB/T4789.13-2003食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验，GB/T4789.12-2003食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验，GB/T4789.14-2003食品卫生微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验进行验证比较，同时检测实际样品，验证本发明试剂盒和检测方法的实用性和可靠性。共检测6大类1657种样品，重点检测了罐头等热加工食品、米饭等粮食及肉制品。结果表明，用本发明的试剂盒和检测方法筛选检出16份阳性样本，其巾检出产气荚膜梭菌1份，3份样品检出肉毒梭菌，12份样品检出蜡样芽孢杆菌。阳性样品检测图谱如附图3-5所示。采用GB/T4789.13-2003、GB/T4789.12-2003、GB/T4789.14-2003方法进行验证，均证实本发明试剂盒和检测方法检出为阳性，与经典的培养生化鉴定方法具有很好的符合性和结果重现性，如表3所示。表3检测方法GB/T4789.13-2003GB/T4789.12-2003GB/T4789.14-2003mPCR-DHPLC样品数量(份)1657165716571657阳性结果(株)131216阳性率(％)0.060.180.720.97假阳性率(％)0000权利要求1、食品中三种产芽孢菌的检测试剂盒，其特征在于包括浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶和PCR反应液；其中的PCR反应液中含10mMTris·HCl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM及3种产芽孢菌的引物对各10μM，所述的引物对序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables>其中，N1是A、T或C；N2是A或G；N3是C或T；N4是A或T；N5是A或T；N6是G或A；N7是C或T；N8是C或T；N9是C或T；试剂盒保存条件-20℃保存。2、食品中三种产芽孢菌的检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤①取2ul待测样品DNA溶液，加入10uH式剂盒中的PCR反应液、0.2TaqDNA聚合酶及灭菌超纯水12.8pL，总体积25pL;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，6(TC退火60s，72"C延伸60s，35个循环；终止延伸72°C，7min;PCR产物4T保存；②将PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下检测器荧光检测器，光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s;色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3jim;柱温50°C;流动相(体积比)O.Omin，55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B，,3.5min，50.2%缓冲溶液A,49.8%缓冲溶液B，6.2min，41.8%缓冲溶液A，58.2%缓冲溶液B，8.4min，38.2%缓冲溶液A，61.8%缓冲溶液B，10.4min，36.3%缓冲溶液A，63.7%缓冲溶液B，12.4min，35.0%缓冲溶液A，65.0%缓冲溶液B，其中，缓冲溶液A为50mlTEAA和250W乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50mlTEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至IOOOml所得溶液；流速0.9mL/min;上样量PCR产物5pL。全文摘要一种用于灵敏快速检测食品中三种产芽孢菌的检测试剂盒及其检测方法。所述的试剂盒中，包括浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶和PCR反应液；其中的PCR反应液中含10mMTris·HCl、50mMKCl、25mMMgCl<sub>2</sub>、dNTP各2.5mM及3种产芽孢菌的引物对各10μM。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测食品中的肉毒梭菌、产气荚膜梭菌和蜡样芽孢杆菌，并且检侧耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。文档编号C12Q1/68GK101591704SQ200910010800公开日2009年12月2日申请日期2009年3月20日优先权日2009年3月20日发明者郑秋月申请人:郑秋月