专利名称：急性心肌梗塞早期快速检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及用于基层医院和各级医院的急诊室快速筛选诊断急性心肌梗塞AMI的检测工具，具体地指一种急性心肌梗塞早期快速检测试纸。
背景背景急性心肌梗塞AMI是内科常见的急危重症，其发病后1～6h是溶栓治疗和介入手术治疗的黄金时间，而快速诊断发病6h内的早期AMI是决定治疗的关键环节。
目前，AMI诊断仍主要依靠持续心绞痛症状、心电图心肌梗死演变经过和血清心肌酶学动态改变。然而，在我国约25％的AMI病人无症状，约30％的病例无典型心绞痛表现。采用心电图诊断AMI的准确性平均约60％，诊断非Q波心肌梗死缺乏特异性，对不稳定心绞痛和小范围AMI难以鉴别，具有确诊意义的病理性Q波常在发病6～8h以后才出现，因而AMI早期心电图确诊率很低。同时，常用的心梗标志物CK-MB、肌钙蛋白T和肌钙蛋白I对发病6h以内的AMI患者的诊断率也很低。因此，寻找新的AMI早期生化标志物意义重大。在AMI检测方法上，目前国内常用的方法为化学发光法，该方法需要特定的仪器，成本高、操作复杂、检测时间长，不适宜于AMI患者初次就诊的基层医院和急诊室进行快速筛选诊断。因此，医学科技工作者一直在试图寻找一种简便快速的检测工具，以期提高AMI的早期诊断率。
心肌脂肪酸结合蛋白H-FABP是存在于心肌细胞胞浆内的可溶性蛋白，它参与细胞内脂肪酸的转运。由于它是低分子细胞浆可溶性蛋白，当心肌细胞受损时可快速释放入血液中，因与其他组织产生的脂肪酸结合蛋白具有免疫学区别而成为AMI特异性标志物。国外有学者用夹心ELISA法测定人血清心肌脂肪酸结合蛋白，发现其在AMI患者发病后3h内可检出，6h左右达高峰，12-24h回复基线水平，与肌红蛋白和CK-MB比较，其检出发病在3h之内和3-6h的AMI的敏感性分别为72.3％和90.4％，均高于肌红蛋白和CK-MB，可以作为急性心肌梗塞早期诊断的特异性指标。目前国内的诊断学教材在急性心梗的早期诊断生化学指标中，已经将H-FABP作为诊断指标之一列出。
胶体金免疫层析技术是在酶联免疫结合试验的基础上发展起来的一种固相标记免疫测定新技术。它可应用于免疫学检测的所有方面，主要用于检测正常体液中不存在的抗原性物质以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质。目前在检测AMI血清生化标志物方面，该技术主要用于定性检测cTnI，但其在6h内的检出率较低，并存在一定的假阳性。
发明内容
针对目前基层医院和各级医院的急诊室缺乏快速筛选诊断早期AMI有效手段的局面，本实用新型的目的旨在填补这一空白，其设计思路是将可用于急性心肌梗塞极早期检测的生化标志物心肌脂肪酸结合蛋白与成熟的胶体金免疫层析快速诊断技术结合起来，从而得到一种新的急性心肌梗塞早期快速检测试纸，以适用于AMI的早期筛选诊断，从而顺应临床早期诊断AMI的迫切要求。
为实现上述目的，本实用新型所提出急性心肌梗塞早期快速检测试纸，具有一作为固相支架的基片，该基片的一面上依次首尾衔接地设置有加样垫、反应带、检测段和吸水垫。其中位于基片两端的加样垫和吸水垫由吸水纸构成。紧邻加样垫的反应带由吸附有含显色剂胶体金和心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体桥联物的玻璃纤维纸构成，该桥联物可与被测样品中的心肌脂肪酸结合蛋白抗原特异性结合。在反应带和吸水垫之间的检测段由包被有一条检测线和一条对照线的硝酸纤维素膜构成，检测线由可结合反应带中桥联物的物质线状点样在硝酸纤维素膜上形成，对照线由兔抗鼠多克隆抗体线状点样在硝酸纤维素膜上形成。
本实用新型的急性心肌梗塞早期快速检测试纸可采用如下制作方法获得1)标记抗体用胶体金颗粒标记心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体1形成反应带中的桥联物。
2)固定受体将桥联物固定到玻璃纤维纸上形成反应带；将可结合反应带桥联物的物质和兔抗鼠IgG分别线状点样到硝酸纤维素膜上形成包被有检测线和对照线的检测段。
3)制作试纸条在基片上依次首尾衔接地粘贴加样垫(吸水纸)、反应带(玻璃纤维膜)、检测段(硝酸纤维素膜)、吸水垫(吸水纸)，组装成复合大卡，复合大卡切成4.2mm宽度的试纸条，再装入试剂盒中即可。
检测早期急性心肌梗塞时，在该试纸条的加样垫处滴加液体样品，液流即向吸水垫处移动。当液体经过反应带时，吸附在其上的桥联物即被溶解，与样品中的H-FABP抗原发生反应而结合，并随液流一起前移至检测段处，被检测线中的物质捕获，出现红色的检测线。当液流前移至对照线时，对照线中的兔抗鼠IgG多克隆抗体可与复合物中的鼠单抗结合，从而出现红色的对照线。未结合的金标抗体继续前移至吸水垫处而被吸收。其结果判定以检测段出现2条肉眼可见的红色线为阳性结果。若检测线不显色，而质控线为红色则为阴性。若两条线均不显色则为试纸条失效。
本实用新型的优点在于使用该试纸检测简便、快速、单份测定，不需任何仪器设备，仅用肉眼即可观察结果，检测全过程仅需数分钟，敏感度与需数小时完成的ELISA法相仿。其原因在于ELISA法样品中的待检抗原需缓慢地扩散才能与吸附于固相表面的抗体反应，而在胶体金免疫层析试纸条中，待检液体层层渗滤时抗原抗体紧密接触形成免疫浓缩，从而提高了反应效率。并且该试纸具有单一试剂、一步操作、全部试剂可在室温长期保存的特点。为确诊发病6h内的早期心肌梗塞提供了快速、方便、价廉、实用的检测工具，可望在将来广泛应用于临床，尤其是基层医院、急诊室等，也可用于病人的自我监测，提高早期AMI诊断准确率，进而提高AMI的抢救成功率。
图1为一种急性心肌梗塞早期快速检测试纸的主视结构示意图；图2为图1的剖视结构示意图；图3为该试纸实际检测后，显示阳性结果、阴性结果和试剂失效的示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步的详细描述图中所示的急性心肌梗塞早期快速检测试纸，具有一作为固相支架的塑料基片7，塑料基片7的一面上依次首尾衔接地粘接有加样垫1、反应带2、检测段3和吸水垫6。加样垫1和吸水垫6由吸水纸构成。反应带2由吸附有含显色剂胶体金和心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体桥联物的玻璃纤维纸构成。检测段3由包被有一条检测线4和一条对照线5的硝酸纤维素膜构成，检测线4由可结合反应带2中桥联物的物质线状点样在硝酸纤维素膜上形成，对照线5由兔抗鼠多克隆抗体线状点样在硝酸纤维素膜上形成。检测线4的阳性阈值设定为被测样品中的心肌脂肪酸结合蛋白抗原浓度大于或者等于16.8ng/ml，这是因为通过临床试验发现H-FABP用于急性心肌梗塞早期筛选诊断时，其检测值以16.8ng/ml为最佳，当血液中的HFABP抗原浓度大于或等于16.8ng/ml时，检测结果为阳性，否则为阴性。
实施例1当上述反应带2是依次吸附有胶体金标记的心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体1、生物素标记的心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体2的玻璃纤维纸时，对应的检测段3上的检测线4则由链霉亲合素线状点样在硝酸纤维素膜上形成。其具体的制作方式如下1)标记抗体用胶体金颗粒标记H-FABP单克隆抗体1；用生物素标记H-FABP单克隆抗体2。
2)固定受体将胶体金标记的H-FABP单克隆抗体1和生物素标记的H-FABP单克隆抗体2分别固定到玻璃纤维纸上形成反应带2；将链霉亲合素和兔抗鼠IgG分别线状点样到硝酸纤维素膜上形成检测段3上的检测线4和对照线5。
3)制作试纸条在塑料基片7上依次粘贴加样垫1、反应带2、检测段3、吸水垫6。以上各部分首尾衔接，组装成复合大卡。复合大卡切成4.2mm宽度的试纸条，再组装成试剂盒。
进行检测时，在加样垫1处滴加全血或血浆或血清标本，液流即向吸水垫6处移动。当液流经过反应带2时，金标H-FABP单克隆抗体1和生物素标记H-FABP单克隆抗体2即被溶解，并与标本中的H-FABP抗原形成金标单克隆抗体1、HFABP抗原、生物素标记单克隆抗体2复合物，并随液流一起前移至检测段3上的检测线4处，带有金标记的复合物中的生物素被检测线4上的链霉亲合素捕获，出现红色的检测线。当液流继续前移至对照线5时，对照线5中的兔抗鼠IgG多克隆抗体可与复合物中的鼠单抗结合从而出现红色的对照线。未结合的金标抗体继续前移至吸水垫6处被吸收。
结果判定以检测段3出现2条肉眼可见的红色线为阳性结果；若检测线不显色，而对照线为红色则为阴性；若两条线均不显色则为试纸条失效。
实施例2当上述反应带2是吸附有胶体金标记的心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体1的玻璃纤维纸时，对应的检测段3上的检测线4由心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体2线状点样在硝酸纤维素膜上形成。其具体的制作方式如下1)标记抗体用胶体金颗粒标记H-FABP单克隆抗体1。
2)固定受体将金标H-FABP单克隆抗体1固定到玻璃纤维纸上形成反应带2；将H-FABP单克隆抗体2和兔抗鼠IgG分别线状点样到硝酸纤维素膜上形成检测段3上的检测线4和对照线5。
3)制作试纸条在塑料基片7上依次粘贴加样垫1、反应带2、检测段3、吸水垫6。以上各部分首尾衔接，组装成复合大卡。复合大卡切成4.2mm宽度的试纸条，再组装成试剂盒。
进行检测时，在加样垫1处滴加全血或血浆或血清标本，液流即向吸水垫6处移动。当液流经过反应带2时，金标H-FABP单克隆抗体1即被溶解，并与标本中的H-FABP抗原形成金标单克隆抗体1、HFABP抗原复合物，并随液流一起前移至检测段3上的检测线4处，带有金标记的复合物中的H-FABP抗原被检测线4上的H-FABP单克隆抗体2捕获，出现红色的检测线。当液流继续前移至对照线5时，对照线5中的兔抗鼠IgG多克隆抗体可与复合物中的鼠单抗结合从而出现红色的对照线。未结合的金标抗体继续前移至吸水垫6处而被吸收。
结果判定以检测段3出现2条肉眼可见的红色线为阳性结果；若检测线不显色，而对照线为红色则为阴性；若两条线均不显色则为试纸条失效。
当检测结果为阳性时，支持急性心肌梗塞的诊断，但确切诊断需结合临床。其阳性结果可帮助医生高度警惕急性心肌梗塞的发生和发展，通过严密检测和及时处理来挽救病人生命。
从华中科技大学同济医学院附属同济医院对本急性心肌梗塞早期快速检测试纸进行的初步实验观察显示，该试纸对于早期AMI检测的敏感性和特异性较高。其检测结果如下早期急性心肌梗塞病人18例，阳性16例，其余2例阴性为极早期(2小时左右)；稳定性心绞痛病人22例，弱阳性1例，余者均为阴性；不稳定性心绞痛病人16例，弱阳性2例，余者均为阴性；非心源性胸痛病人15例，阳性2例(1例为皮肌炎病人，1例为外伤病人)。
权利要求1.一种急性心肌梗塞早期快速检测试纸，包括作为固相支架的基片(7)，其特征在于基片(7)的一面上依次首尾衔接地设置有加样垫(1)、反应带(2)、检测段(3)和吸水垫(6)，其中位于基片两端的加样垫(1)和吸水垫(6)由吸水纸构成；紧邻加样垫(1)的反应带(2)由吸附有含显色剂胶体金和心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体桥联物的玻璃纤维纸构成，该桥联物可与被测样品中的心肌脂肪酸结合蛋白抗原特异性结合；在反应带(2)和吸水垫(6)之间的检测段(3)由包被有一条检测线(4)和一条对照线(5)的硝酸纤维素膜构成，检测线(4)由可结合反应带(2)中桥联物的物质线状点样在硝酸纤维素膜上形成，对照线(5)由兔抗鼠多克隆抗体线状点样在硝酸纤维素膜上形成。
2.根据权利要求1所述的急性心肌梗塞早期快速检测试纸，其特征在于所说的反应带(2)是依次吸附有胶体金标记的心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体1、生物素标记的心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体2的玻璃纤维纸，所说的检测段(3)上的检测线(4)是由链霉亲合素线状点样在硝酸纤维素膜上形成的。
3.根据权利要求1所述的急性心肌梗塞早期快速检测试纸，其特征在于所说的反应带(2)是吸附有胶体金标记的心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体1的玻璃纤维纸，所说的检测段(3)上的检测线(4)是由心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体2线状点样在硝酸纤维素膜上形成的。
4.根据权利要求1或2或3所述的急性心肌梗塞早期快速检测试纸，其特征在于所说的检测段(3)上的检测线(4)的阳性阈值设定为被测样品中的心肌脂肪酸结合蛋白抗原浓度大于或者等于16.8ng/ml。
专利摘要一种急性心肌梗塞早期快速诊断试纸，具有一基片，基片上依次首尾衔接设置有加样垫、反应带、检测段和吸水垫。其加样垫和吸水垫由吸水纸构成。反应带由吸附有含显色剂胶体金和心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体桥联物的玻璃纤维纸构成，该桥联物可与被测样品中的心肌脂肪酸结合蛋白抗原特异性结合。检测段由包被有检测线和对照线的硝酸纤维素膜构成，检测线由可结合反应带中桥联物的物质线状点样在硝酸纤维素膜上形成，对照线由兔抗鼠多克隆抗体线状点样在硝酸纤维素膜上形成。该试纸通过定性快速检测急性心肌梗塞早期患者血液中的HFABP抗原，对其进行筛选诊断，具有敏感性高、特异性强、操作简便、反应快速、经济适用等特点。特别适于基层医院急诊室。
文档编号G01N33/558GK2676202SQ20032012545
公开日2005年2月2日 申请日期2003年12月18日 优先权日2003年12月18日
发明者陈莉莉, 郭小梅, 马业新 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院