专利名称：癌转移抑制剂及动物用癌转移抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌转移抑制剂及动物用癌转移抑制剂。
肿瘤是能自发的过剩增殖的细胞群。虽然可以区别导致动物死亡可能性的恶性肿瘤(或称为癌)和与它们不同的良性肿瘤，但也有许多例外，将两者严格区分开来是有困难的(“岩波生物学辞曲”第3版第4页)目前，治疗癌症的方法有三种，即外科疗法，药物疗法和放射线疗法。实际上广泛采用的是将上述疗法，或者进而是将上述疗法和激光疗法等结合起来的治疗方法。但是考虑到治疗时的痛苦及癌的转移，对于药物疗法的期待当然是十分迫切的，因此应当大量地研究和使用抗癌药。然而还没有任何一种抗癌药对各种的癌是有效的，同时因为单独使用不能充分发挥效果，以及付作用大，多数不能长期使用，因此一般采用多种药剂并用的疗法。因此十分期望研制出新的抗癌药，特别是抗癌效果好，方法简便并能长期使用的药剂。
另外，癌症具有能转移的特征。癌症患者死亡的原因几乎全是由于癌转移。所谓“控制了转移就控制了癌症”的说法其原因就在于此。但是，目前的抗癌药均是以抑制癌的原发部位和转移部位的癌细胞增殖的抗癌效果为目标的，在目前使用的抗癌药中还未见到具有抑制癌转移效果的报告。另外，据报道，作为具有抗肿瘤活性的多肽TNF-α能促进癌的转移。(PeterOrosz等“enhancementofExperimentalMetastasisbyTumorNecrosisFactor”，J.Exp.Med.,Vol.177,pp1391-98,1993.5,TheRockefellerUniversityPress)。综上所述，可认为抗癌效果和癌转移抑制效果是基于不同的作用机理。
以抑制癌转移为目标的药剂的开发还是极少的。虽然也报道了硫酸多糖类，N-重氮乙酰甘氨酸衍生物，神经氨(糖)酸甘酶(上述为岛滋著“癌的再发和转移”60-70页，1981年，自由民国社)纤维结合分解酶(FNS)，人的rTIMP(上述为和田武雄编“癌辞典”，82页，1990年，日本评论社)具有抑制作用，但尚未有实用化的报告，也没有它们本身具有抗癌作用的报告。
考虑到在控制癌症方面转移抑制剂的重要性，可以说极迫切地期待开发具有上述抑制作用的药剂。
本发明的技术内容是提供新颖的癌转移抑制剂以及新颖的动物用癌转移抑制剂。
本发明人提供了含有用下述氨基酸序列表示的多肽或其混合物的癌转移抑制剂，因而完成了本发明。
X-X’-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln-Trp-Leu-Asn-Arg-Arg-Ala-Asn-Ala-Leu-Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-Leu-Arg-Asp-ASn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-Gly-Leu-Tyr-Leu-Ile-Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-Val-Phe-Gln-Leu-Gln-Lys-Gly-Asp-Arg-Leu-Ser-Ala-Glu-Ile-Asn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-Phe-Ala-Glu-Ser-Gly-Gln-Val-Tyr-Phe-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu。
(X是氢原子或者是任意种类、数量的肽X′是1-39个氨基酸残基的肽)上述的氨基酸序列，即连接X′的从Ala到最后的Leu，和已知的在碱基序列的头部连接了鸟嘌呤的TNF-α的第4外切(エクソン)部分的氨基酸序列是相同的。因此，在本说明书的其它部分，将上述氨基酸序列用X-X′-(TNF的第4外切部分的氨基酸序列)表示。
上述多肽及其抗癌作用，是本申请人在日本特许出願昭61-169522号的内容，并公开于公开特许公报照62-282587号。
本发明的癌转移抑制剂及动物用癌转移抑制剂含有一种用上述氨基酸序列表示的多肽或含有它们的2种以上的混合物。进而，根据制备的剂型需要，适当地配合赋形剂，崩解剂，矫味矫臭剂等，可制备成如锭剂，散剂，注射剂等各种剂型。只要不防碍其癌转移抑制活性，本发明的制剂并不限定使用特定的助剂及特定的剂型。
为了证实本发明的癌转移抑制剂及动物用癌转移抑制剂的癌转移抑制效果，向小鼠体内静脉注射癌细胞，用肉眼数出其肺部的癌结节数。在此情况下，虽然由于癌原发部位的不同而有所不同，但一般说来，在作为癌转移方式的血液转移，淋巴转移，破坏性转移及接触性转移中，血液转移和淋巴转移最多。在通过淋巴转移的情况下，癌细胞经淋巴管，最终进入血液。同时，由于向肺转移最易被观察(前述的“癌的再发和转移”第6页及小林博著“肿瘤学”第40页，1984，南山堂)，因此可以认为观察通过血液向肺部转移是最合适的。
本发明癌转移抑制剂及动物用癌转移抑制剂的投药量，投药间隔，应在医生和兽医的严格指导下，根据投药对象的年龄，症状，体重，投药效果来分别决定，但对于成人(60kg)，每日大致的投药标准为口服投药1×107单位，静脉投药为1×106单位，皮下投药为5×105单位。可一日一次或分数次投药。还有，对于牛马等大动物，每公斤体重的投药量为上述投量的1/60，对于猪，犬，猫等中小动物，每公斤体重投上述量的2倍，对于鸡等鸟类每公斤体重的投药标准为中小动物的2倍。
上述单位是制造商旭化成株式会社用以表示TNF-α的浓度的指标。以各种肽对于L-929细胞[ProceedingofnationalacademyscienceofusA72,3666-3670页]的细胞毒性为基准，可用下述方法求出。
对L929细胞的细胞毒性将L929细胞，在加有5%小牛胎儿血清的Eagles mininum essential培养基(以下称为MEM培养基)中培养，将100μl上述培养基中含8×104个细胞的试样放于96穴平皿中培养，培养条件为37℃，4-6小时，5%CO2，100%水，并使用常规的培养细胞的方法。然后加入放线菌素于培养基中，使其最终浓度为1μg/ml，此时培养液的量为150μl。(放线菌素因可提高细胞敏感性所以是经常使用的药剂，其本身对L929细胞无毒性)。立即加入用50μlMEM培养基适当稀释的受试体，(此时适当调整稀释率以便能求出ED50值)，将最终液量为200μl的L929细胞于上述条件下培养18小时。为测定细胞坏死活性，首先除去培养基，再加含0.2%的结晶紫的2%甲醇溶液固定染色，因为结晶紫能使有核细胞染色，由于细胞坏死的结果，由皿的底面游离出的细胞不能被染色，因此可以直接测定细胞坏死活性。用于OD590nm处的吸收测定染色度，和对照组的染色度比较就可测定细胞坏死活性，活性的定义如下。
求出能使L929细胞生存50%的受试体的稀释率(N)，使用兔子TNS作对照，用2.4×104单位/mg/ml的TNFα决定此兔TNS的活性n(单位/ml)，求出兔TNS ED50的稀释率(C)。
受试体活性(单位/ml)用N/c×n计算。
在上述氨基酸序列中，X-X′是Met-Val-Arg-Ser-Ser-Thr-Arg-Thr-Pro-Ser-Arg-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val的多肽(以下称为TNF-AM1)，其对鼠的LD50值为9.5×107单位/kg(BALB/c系统)2.7×107单位/kg(C3H/He系统)5.8×107单位(C57BL/6系统)；X-X′是Met-Val-Arg-Ser-Cys-Thr-Arg-Thr-Pro-Ser-Arg-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val的多肽，(以下称为TNF-AM2)，其对鼠的LD50值为2.7×107单位/kg(C3H/He系统)2.7×107单位/kg(C57BL/6系统)均是TNF-α的值，与
1.0×107单位/kg(BALB/c系统)7.8×106单位/kg(C3H/He系统)1.5×107单位/kg(C57BL/6系统)相比都大得多，因此如上述所说明的，本发明的多肽对于正常细胞的毒性，比TNF-α低得多，本发明的癌转移抑制剂及动物用癌转移抑制剂在临床上是极为有用的。
以下述的实施例，实验例来详细地说明本发明。
实施例1(注射剂)将1×106单位的TNF-AM1，或TNF-AM2或它们的混合物溶于生理食盐水中，配制成静脉注射液。
实施例2(缓释剂)将3×106单位的TNF-AM1，或TNF-AM2或它们的混合物分散并封入核糖体中，制成缓释剂。
实施例3(片剂)TNF-AM21g6%HPC乳糖178g硬脂酸滑石粉8g马铃薯淀粉14g将上述物质混合，压片制成2.5mgTNF-AM2的0.5g的片剂400片。
实施例4(内服液剂)TNF-AM22.5g
纯水100ml实施例5(软膏剂)TNF-AM20.5g精制羊毛脂80g黄色凡士林适量1000g实验例1从尾静脉向小鼠(C57BL/6，雄性，平均8周龄，平均体重25g)体内注入鼠B16黑色肿瘤细胞(5×104个)，并于2，4，6，10天后投试验药物，注入黑色肿瘤细胞14天后切开取出肺，用肉眼观察肺部的癌结节数，实验条件及结果列于表1。
被试验的药物是TNF-α(4.9×107单位/mg)和TNF-AM2(9×107单位/mg)，均未观察到鼠的死亡例。
表1投药量平均癌结投药组小鼠数(单位/次/只)节数/只A)无624.7±10.4B)TNF-α 5 14.7×10489.8±27.1C) 4 4.9×10472.5±69.6D)TNF-AM2 6 30.0×10414.0±5.7E) 6 9.0×10412.5±6.9上述表1的结果可用
图1表示，图1清楚地表明依TNF-α用量促进了癌转移，可是本发明的TNF-AM2与不投药的组比较，抑制了1/2的癌转移。另外，图中A-E就是表中的投药组。
实验例2为了证实本发明的癌转移抑制剂的预防效果，在注入癌细胞之前投药并观察之。
向每组8只鼠(BALB/c，平均8周龄，平均体重25g)体内以1×103单位/只，投本发明的TNF-AM2，对于F组，同时经尾静脉注入鼠固型癌Meth A肉肿瘤细胞，对于G组，3小时之后注入上述肿瘤细胞(均为1×106个/只)，注入21天后切开并取出肺，用肉眼观察肺部的癌结节数，结果是F组平均为83.5±51.4个癌结节，而G组减少至1/8即10.1±10.7个癌结节。这说明，预先投本发明的癌转移抑制剂是很重要的，也就是说，在原发部位的癌治疗之后服用本发明的癌转移抑制剂，有可能抑制癌的再发。
本发明提供了新颖的癌转移抑制剂以及动物用癌转移抑制剂。
本发明的癌转移抑制剂及动物用癌转移抑制剂，具有抗癌效果，并且对于抑制癌的再发是极有效的。同时对于正常细胞的毒性低，可长期使用，作为癌转移抑制剂及动物用癌转移抑制剂其价值是很高的。
图1表示癌转移抑制效果。
符号说明A未投药组，B、C投与TNF-α组，D，E投与TNF-AM2组。
权利要求
1.含有用下述氨基酸序列表示的多肽或其混合物的癌转移抑制剂。X-X′-(TNF-α的第4外切部分的氨基酸序列)X是1个氢原子或任意种类、数量的肽，X′是氨基酸残基数为1-39个的肽。但X-X′为Met-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-时除外。
2.含用权利要求1记载的氨基酸序列表示的多肽或其混合物的动物用癌转移抑制剂。
全文摘要
本发明提供了癌转移抑制剂及动物用癌转移抑制剂，其特征是它含有下述氨基酸序列表示的多肽或其混合物。X-X′—(TNF—α的第4外切部分的氨基酸序列—X是氢原子或任意种类、数量的肽，X′是氨基酸残基数为1—39个的肽，但X-X′为Met—Val—Arg—Ser—Ser—Ser—Arg—Thr—Pro—Ser—Asp—Lys—Pro—Val—Ala—His—Val—Val—时除外。
文档编号A61K35/64GK1101572SQ9311500
公开日1995年4月19日 申请日期1993年10月15日 优先权日1991年12月2日
发明者杣源一郎, 水野传一 申请人:杣源一郎, 水野传一