转f3h基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
【专利摘要】本发明是一种生物技术领域的转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明从青蒿中克隆黄烷酮?3?羟化酶F3H基因，构建含F3H基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将F3H基因转入青蒿并再生出植株，PCR检测外源目的基因F3H的整合情况，HPLC?ELSD转基因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素含量显著提高，最高达到非转化对照植株的1.95倍，从而提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。
【专利说明】
转F3H基因提局青蒿中青蒿素含量的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种生物技术领域的提高青蒿素含量的方法，特别是一种转F3H基因 提高青蒿中青蒿素含量的方法。
【背景技术】
[0002] 青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。其地上部分所提取的 含有过氧桥的倍半萜内酯氧化物一一青蒿素，是目前应用最广泛，疗效最好的抗疟疾药物， 特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织 推荐的最有效的治疗疟疾的方法。随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素 及其衍生物还具有抗炎、抗肿瘤、抗癌以及免疫调节的功能。
[0003] 然而青蒿素在植物青蒿中的含量非常低，大规模商业化生产受到了限制，无法完 全满足全球的市场需求。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具可行 性。通过酵母工程生产青蒿素，前期投入成本大，且产量有限不能满足需求。现有技术表明 植物基因工程为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一个可行的方法。
[0004] 青蒿具有分泌型腺毛（glandular trichomes)和非分泌型腺毛 (nonglandulartrichomes)。在青蒿叶片的正面和背面、莖杆、花上都大量存在分泌型腺毛， 这里是大量次生代谢物的累积场所，青蒿素也被认为储存于此处。
[0005] 经过对现有技术文献检索发现，Jin-Ho Kang等在《Plant Physiology》(植物生理 学）2014年 164卷 1161-1174页发表了题为"The Flavonoid Biosynthetic Enzyme ChalconeIsomerase Modulates Terpenoid Production in Glandular Trichomes of Tomato"（ "查尔酮异构酶对番茄腺毛萜类物质生物合成的调控"）的论文，报道缺失花青素 (af)的栽培番前(Solanumlycopersicum)突变体的腺毛不能积累砲类化合物，黄酮类和砲 类路径的代谢协调有助于优化毛状体腺在动态环境中的作用。黄烷酮-3-羟化酶基因 (Flavanone-3_hydroxylase，F3H)是黄酮合成途径中和花青素合成有关的一个关键酶，因 此，克隆F3H基因并转化青蒿，对探究黄酮类途径和青蒿素途径的代谢协调及基因工程育种 具有重要意义。
[0006] 本发明致力于采用基因工程手段，获得青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青 蒿素提供一条新途径。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种转F3H基因提高青蒿中青蒿 素含量的方法。本发明涉及的基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、青蒿素提取及含量 测定用于本发明，建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用青蒿大规模生产青蒿 素奠定了基础。
[0008] 本发明提供一种转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括以下步骤：
[0009] (1)采用基因克隆方法获得F3H基因；
[0010] (2)把所述F3H基因连接于表达调控序列，构建含F3H基因的植物表达载体；
[0011] (3)将所述含F3H基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得含所述F3H基因植物 表达载体的根癌农杆菌菌株；
[0012] (4)利用所述含F3H基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检 测的整合外源目的基因 F3H的转基因青蒿植株。
[0013] 进一步地，所述F3H基因的DNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0014] 进一步地，所述F3H基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0015] 进一步地，在所述步骤（1)中，所述基因克隆方法包括以下步骤:提取青蒿基因组 总RNA，将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA，以所述第一链 cDNA为模板，以上游引物和下游引物为引物对，进行PCR扩增，其中所述上游引物的DNA序列 如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
[0016] 优选地，在所述步骤（1)中，所述基因克隆方法包括以下步骤:提取青蒿基因组总 RNA，将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA，根据SEQ ID NO. 1 所示的DNA序列，设计扩增出完整编码框的上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO. 2所示的DNA序列，所述下游引物为SEQ ID NO. 3所示的DNA序列，并在所述上游和下游引 物上分别引入限制性内切酶位点以便构建表达载体，以所述的第一链cDNA为模板，以所述 上游引物和所述下游引物为引物对，经PCR扩增后进行测序。
[0017] 进一步地，在所述步骤(2)中，所述构建含F3H基因的植物表达载体包括以下步骤： 先构建中间载体PJET-F3H，再用BamHI和XbaI酶切中间载体PJET-F3H和表达载体pHB-n-flag，回收F3H基因片段和pHB-n-flag载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR 检测和酶切验证。pHB-n-flag是对pHB201表达载体在35s启动子后插入flag改造获得并保 存的表达载体。
[0018] 进一步地，所述构建中间载体P JET-F3H包括以下具体步骤:通过高保真酶扩增F3H 基因前后分别引入BamHI和XbaI酶切位点的基因全长，通过连接酶连接到PJET载体上。
[0019] 进一步地，在所述步骤(4)中，所述转化包括以下步骤:外植体的预培养;农杆菌与 外植体的共培养;抗性再生植株的筛选;其中，
[0020] 所述预培养包括以下步骤：青蒿种子用75%乙醇浸泡lmin，再用20%NaC10浸泡 20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基中， 25°C光照培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转 化；
[0021]所述共培养包括以下步骤:将所述叶片外植体转到共培养培养基中，滴加含活化 好的所述含F3H基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液 充分接触，28°C暗培养3天，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬 液的叶片外植体为对照；
[0022] 所述筛选包括以下步骤:将所述共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选基上于 25°C光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代培养后即可获得潮霉素(Hyg)抗性丛 生芽，将所述生长良好的Hyg抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根，即可获得Hyg 抗性再生青蒿植株。
[0023] 进一步地，在所述步骤(4)中，所述PCR检测包括以下步骤:根据目的基因所在表达 盒p35s-F3H-nos序列p35s和F3H分别设计正向引物和反向引物;进行DNA扩增；紫外线下观 察，若目的条带为阳性，则该株系即为所述转基因青蒿植株;所述正向引物的DNA序列如SEQ ID NO.4所示，所述反向引物的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
[0024]进一步地，还包括步骤(5)对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行高效液相色谱法 及蒸发光散射检测器测定(HPLC-ELSD)测定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。 [0025]优先地，在所述步骤(5)中，所述HPLC-ELSD测定包括以下条件:所用色谱柱为C-18 反相硅胶柱，流动相选用体积比为70:30的甲醇和水，柱温30 °C，流速1.0 mL/min，进样量20μ L，蒸发光散射检测器漂移管温度40°C，放大系数为7，载气压力5bar。
[0026] 本发明的转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，将黄烷 酮-3-羟化酶F3H基因导入青蒿植株中，获得了青蒿素高含量显著提高的转基因青蒿株系， 转F3H基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到干重的15.6mg/g，是非转化普通青蒿(8mg/g)的 1.95倍，该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。
【附图说明】
[0027] 图1是携带有转F3H基因的青蒿与非转化普通青蒿的青蒿素含量检测结果图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图和实施例对本发明的技术内容做进一步的说明。以下实施例将有助 于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商 所建议的条件。
[0029]本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄;根 癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3): 38-43》文献 中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公 司购得，菌株编号为Gambar 1。
[0030] 实施例
[0031]步骤一，青蒿F3H基因的克隆 [0032] (1)青蒿基因组总RNA的提取
[0033] 青蒿基因组总RNA的提取使用TIANGEN公司的RNA试剂盒。取50-100mg青蒿幼嫩叶 片在液氮中迅速研磨成粉末，加入550yL裂解液RL(已加入巯基乙醇），涡旋剧烈震荡混匀。 9800rpm离心5min，吸取450yL转移至过滤柱CS上，CS放在收集管中，12000rpm离心5分钟，小 心吸取收集管中的上清400yL至RNase-free的离心管中，缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙 醇，混匀，转入吸附柱CR3中，12000rpm离心Imin，弃废液，将CR3放回收集管中。向CR3中加入 350yL去蛋白液RWl，12000rpm离心Imin，弃废液，将CR3放回收集管中。向CR3中央加入80yL 的DNasel工作液（IOyLDNasel储存液+70yLRDD溶液，轻柔混匀），室温静置15分钟。向CR3中 加入350yL去蛋白液RWl，12000rpm离心Imin，弃废液，将CR3放回收集管中。向CR3中加入500 yL漂洗液RW(加入乙醇），室温静置2分钟，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将CR3 放回收集管中，重复一次。12000rpm离心5min。将CR3置于室温放置5min，将CR3放入新的 RNase-free中，向吸附膜的中间部位悬空滴加70yLRNase-free dd H20,室温静置2min， 12000rpm离心2min，得到RNA溶液。取IOyL放于RNase-free小管中，用于跑胶和测浓度;剩余 的60以1^放于RNase-f ree离心管中-80 °C保存。
[0034] (2)青蒿F3H基因的克隆
[0035]将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所 述青蒿F3H基因的编码序列（SEQ ID NO. 1所示的DNA序列），设计扩增出完整编码框的上游 引物（SEQ ID NO.2所示的DNA序列）和下游引物（SEQ ID NO.3所示的DNA序列），并在所述上 游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点（这可视选用的载体而定），以便构建表达载 体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海桑尼生物科技 有限公司测序完成。测序结果表明，所克隆的序列（SEQ ID NO. 1所示的DNA序列）与GenBank 中所报道的青蒿F3H基因的编码序列在337位，732位有2个无义点突变，但它们在氨基酸序 列上完全一致。
[0036]本实例采用基因克隆方法从青蒿中获得序列正确的青蒿黄烷酮-3-羟化酶F3H基 因，为通过转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量提供了一个重要基因。
[0037]步骤二，含F3H基因的植物双元载体的构建 [0038] (1)中间载体PJET-F3H的构建
[0039] 选用PJET载体(大连Takara公司）为基本元件，构建中间载体PJET-F3H。具体地，通 过高保真酶扩增F3H基因前后分别引入BamHI和Xba I酶切位点的基因全长，通过连接酶连接 到PJET载体上，由上海桑尼生物科技有限公司测序确认基因的正确性。
[0040] (2)含F3H基因的植物表达载体的构建
[0041] 以pHB-n-flag为表达载体，将上述F3H基因连入其对应的酶切位点位置。具体地， BamHI和XbaI双酶切中间载体PJET-F3H和表达载体pHB-n-f lag。回收F3H基因片段和pHB-n-f lag载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。
[0042] 本实施例将青蒿黄酮生物合成途径关键酶基因 F3H可操作性地连接于表达调控序 列，形成含F3H基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略提高青蒿中青蒿 素的含量。
[0043]步骤三，含F3H基因双元植物表达载体根癌农杆菌的获得
[0044]将上述含F3H基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(如EHA105,为市场有公开 出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1 )，并进行PCR验 证。
[0045]步骤四，根癌农杆菌介导F3H基因转化青蒿 [0046] (1)外植体的预培养
[0047] 青蒿种子用75%乙醇浸泡lmin，再用20%NaC10浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用 无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基 中，25°C、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取 无菌苗叶片外植体用于转化。
[0048] (2)农杆菌与外植体的共培养
[0049]将所述叶片外植体，转到添加乙酰丁香酮(AS)的共培养培养基（l/2MS+AS100y mol/L)中，滴加含活化好的所述含F3H基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS 悬液，使外植体与菌液充分接触，28°C暗培养3天。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌 的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
[0050] (3)抗性再生植株的筛选
[00511将所述共培养3天的青蒿外植体转入到添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、 卡那霉素（1^11)、羧苄青霉素（(^)的发芽筛选基（13+6-840.511^/1+财八0.0511^/1+1^11 50mg/L+cb 500mg/L)上于25°C、1611/811(1丨8111:/(^110光照培养，每两周继代培养一次，经过 2-3次继代培养后即可获得Hyg抗性丛生芽，将所述生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培 养基（I/2MS+cb 125mg/L)上培养至生根，即可获得Hyg抗性再生青蒿植株。
[0052]步骤五，转基因青蒿植株的PCR检测
[0053] 根据目的基因所在表达盒p35s-F3H-n〇s序列p35s和F3H分别设计正向引物(如SEQ ID N0.4所不的DNA序列）和反向引物（如SEQ ID N0.3所不的DNA序列）对目的基因进彳丁检 测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组 DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
[0054]本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含F3H基 因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检 测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供 了直接素材。
[0055] 步骤六，利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量
[0056] (l)HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制
[0057] HPLC:采用 water alliance 2695 系统，色谱柱为C-18 反相硅胶柱（Symmetry Shiled TM C18，5μπι，250 X 4.6mm，Waters)，流动相为甲醇和水，甲醇:水的体积比为70:30， 柱温30°C，流速1.0 mL/min，进样量IOyL，灵敏度(AUFS= 1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算 不低于2000。
[0058] ELSD:采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40°C，放大 系数(gain)为7,载气压力5bar;
[0059] 精密称取青蒿素标准品（Sigma公司）2.0mg用ImL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿 素标准品溶液，保存于-20 °C备用。
[0060] 本实施例中流动相为甲醇和水，体积比为70% :30%，青蒿素的保留时间为 5. Imin，峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。
[0061 ] (2)标准曲线的制作
[0062] 将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2yL，4yL，6yL，8yL，IOyL记录图谱 及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，yg)进行回归分析。通过研究，本实施例中 青高素在4-20yg范围内呈现良好的log-log线性关系。青高素对照品的log-log线性回归方 程为Y = 5 · 404e+0000X+l · 858e+0000，R2 = 0 · 999184。
[0063] (3)样品的制备和青蒿素含量的测定
[0064]取新鲜的青蒿叶片于55°C烘箱烘干后磨碎，取0.1 g样品于2mL EP管中加入ImL甲 醇超声30min，12000rpm离心10min后吸取上清于新的EP管；沉淀加入ImL甲醇继续超声 30min，12000rpm离心10min后吸取上清，将两次上清混勾后抽滤ImL于新的EP管。
[0065]采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20yL，根据峰面积代入线性回归 方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株 中青蒿素的含量。
[0066]本实施例中转F3H基因显著提高青蒿中青蒿素含量。如图1所示，转F3H基因青蒿中 青蒿素的含量最高可达到干重的15.6mg/g，是非转化普通青蒿(8mg/g干重）的1.95倍。图中 CK表示非转化普通青蒿;F3H-1到F3H-8分别表示不同的转基因株系。
[0067]本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，采用转化F3H基因的 代谢工程策略获得了青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法。 [0068]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无 需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术 人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的 技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 采用基因克隆方法获得F3H基因； (2) 把所述F3H基因连接于表达调控序列，构建含F3H基因的植物表达载体； (3) 将所述含F3H基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得含所述F3H基因植物表达 载体的根癌农杆菌菌株； (4) 利用所述含F3H基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的 整合外源目的基因 F3H的转基因青蒿植株。2. 如权利要求1所述的转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述F3H 基因的DNA序列如SEQ ID N0.1所示。3. 如权利要求1所述的转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述F3H 基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。4. 如权利要求1所述的转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，在所述 步骤(1)中，所述基因克隆方法包括以下步骤:提取青蒿基因组总RNA，将所获的青蒿基因组 总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA，以所述第一链cDNA为模板，以上游引物和下 游引物为引物对，进行PCR扩增，其中所述上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述下 游引物的DNA序列如SEQIDN0.3所示。5. 如权利要求1所述的转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，在所述 步骤(1)中，所述基因克隆方法包括以下步骤:提取青蒿基因组总RNA，将所获的青蒿基因组 总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA，根据SEQ ID NO. 1所示的DNA序列，设计扩增 出完整编码框的上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO.2所示的DNA序列，所述 下游引物为SEQ ID NO.3所示的DNA序列，并在所述上游和下游引物上分别引入限制性内切 酶位点以便构建表达载体，以所述的第一链cDNA为模板，以所述上游引物和所述下游引物 为引物对，经PCR扩增后进行测序。6. 如权利要求1所述的转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，在所述 步骤(2)中，所述构建含F3H基因的植物表达载体包括以下步骤:先构建中间载体PJET-F3H， 再用BamHI和Xbal酶切中间载体PJET-F3H和表达载体pHB-n-flag，回收F3H基因片段和pHB-n-f lag载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。7. 如权利要求6所述的转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述构 建中间载体PJET-F3H包括以下具体步骤:通过高保真酶扩增F3H基因前后分别引入BamHI和 Xbal酶切位点的基因全长，通过连接酶连接到PJET载体上。8. 如权利要求1所述的转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，在所述 步骤(4)中，所述转化包括以下步骤:外植体的预培养;农杆菌与外植体的共培养;抗性再生 植株的筛选;其中， 所述预培养包括以下步骤:青蒿种子用75%乙醇浸泡1111；[11，再用20%似(：10浸泡2〇1]1；[11， 无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基中，25°C光 照培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化； 所述共培养包括以下步骤:将所述叶片外植体转到共培养培养基中，滴加含活化好的 所述含F3H基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分 接触，28°C暗培养3天，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的 叶片外植体为对照； 所述筛选包括以下步骤:将所述共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选基上于25°C 光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代培养后即可获得Hyg抗性丛生芽，将所述生 长良好的Hyg抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根，即可获得Hyg抗性再生青蒿植 株。9. 如权利要求1所述的转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，在所述 步骤(4)中，所述PCR检测包括以下步骤:根据目的基因所在表达盒p35s-F3H-n 〇s序列p35s 和F3H分别设计正向引物和反向引物;进行DNA扩增；紫外线下观察，若目的条带为阳性，则 该株系即为所述转基因青蒿植株； 所述正向引物的DNA序列如SEQIDN0.4所示，所述反向引物的DNA序列如SEQIDN0.3 所示。10. 如权利要求1所述的转F3H基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，还包括 步骤(5)对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量提高的 转基因青蒿植株。
【文档编号】A01H5/00GK105861544SQ201610221838
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】赵静雅, 王路尧, 张颖, 付雪晴, 张婷婷, 张利达, 钱虹妹, 唐克轩
【申请人】上海交通大学