专利名称：转dbr2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
技术领域：
本发明涉及的是ー种生物技术领域的提高青蒿素含量的方法，特别是ー种转DBR2
基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。
背景技术：
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的ー种含有过氧桥结构的倍半職内酯化合物,是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是ー种极具潜力的天然药物。目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，不同种植环境和种植品种中其平均含量在青蒿叶片干重的0.01-1 %，使得这种药物的大規模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的O. I %，在芽中最高也只有干重的O. 16%，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。经对现有技术文献检索发现，Waleerat Banyai等在《Plant Cell Tissueand Organ Culture))(植物细胞组织器官培养)，2010年103卷255-265页发表了题为“Overexpression of farnesyl pyrophosphate syntnase(FPS) gene atfectedartemisinin content and growth of Artemisia annua L.，，(“过量表达法ノ匕羞焦磷酸合酶基因能影响青蒿中青蒿素的含量及青蒿的生长”)的论文，报道通过过最表达法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase, FPS),使转基因青蒿中青蒿素的含量提高了2. 5-3. 6倍，但仍然只有I. 3%左右。不过，植物基因工程为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一条可行的方法。现有技术中青蒿醒Δ 11 (13)还原酶(artemisinic aldehyde Δ 11 (13) doublebond reductase, DBR2)是青蒿素合成途径中的ー个关键酶，是青蒿素代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段，用关键酶基因DBR2转化青蒿，将打破青蒿素生物合成的限速瓶颈，获得青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供一条新途径。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供ー种转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、青蒿素提取及含量測定用于本发明，建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用青蒿大規模生产青蒿素奠定坚实的基础。本发明是通过以下技术方案实现的
ー种转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下具体步骤(I)采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因DBR2 ；(2)把所述DBR2基因连结于表达调控序列，构建含DBR2基因的植物表达载体；
(3)将所述含DBR2基因的植物表达载体转化根瘤农杆菌，获得含所述DBR2基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；(4)利用所述含DBR2基因植物表达载体的根瘤农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的整合外源目的基因DBR2的转基因青蒿植株；(5)对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD測定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。优选的，在所述步骤(I)中，所述基因克隆方法包括以下步骤提取青蒿基因组 总RNA，将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA，根据SEQ IDNO. I所示的DNA序列，设计扩增出完整编码框的上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQID NO. 2所示的DNA序列，所述下游引物为SEQ ID NO. 3所示的DNA序列，并在所述上游和下游引物上分別引入限制性内切酶位点以便构建表达载体，以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。优选的，在所述步骤(2)中，所述构建含DBR2基因的植物表达载体包括以下步骤先构建中间载体PMDT18-DBR2，再用XmaI和SacI酶切中间载体pMDT18_DBR2和表达载体FSN,回收DBR2基因片段和FSN载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。进ー步优选的，所述构建中间载体pMDT18_DBR2包括以下具体步骤通过高保真酶扩增DBR2基因前后分别引入XmaI和SacI酶切位点的基因全长，通过连接酶连接到PMDT18载体上。优选的，在所述步骤⑷中，所述转化包括以下步骤外植体的预培养；农杆菌与外植体的共培养；抗性再生植株的筛选。进ー步优选的，所述预培养包括以下步骤青蒿种子用75%こ醇浸泡lmin，再用20% NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3_4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基中，25°C光照培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。进ー步优选的，所述共培养包括以下步骤将所述叶片外植体转到共培养培养基中，滴加含活化好的所述含DBR2基因植物双元表达载体的根瘤农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28°C暗培养3天，以滴加在不带有目的基因的根瘤农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。进ー步优选的，所述筛选包括以下步骤将所述共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基上于25°C光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将所述生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根，即可获得Kan抗性再生青蒿植株。优选的，在所述步骤(4)中，所述PCR检测包括以下步骤设计合成DBR2基因的引物；进行DNA扩增；紫外线下观察，若目的条带为阳性，则该株系即为所述转基因青蒿植株。优选的，在所述步骤(5)中，所述HPLC-ELSD測定包括以下条件所用色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相选用体积比为70 30的甲醇7K，柱温30°C，流速I. OmL/min,进样量20 μ L，蒸发光散射检测器漂移管温度40°C，放大系数为7，载气压力5bar。本发明的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，将关键酶基因DBR2导入青蒿植株中，获得了青蒿素含量显著提高的转基因青蒿株系，转DBR2基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到干重的22. 6mg/g，是非转化普通青蒿(8mg/g干重)的2. 83倍，该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。
图I为本发明的青蒿植株中青蒿素的含量检测结果图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如SambiOOk等分子克隆实验室手册' (New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例步骤一，青蒿DBR2基因的克隆(I)青蒿基因组总RNA的提取取100-200mg青蒿幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有ImLTRlzol (TRlzol Reagents, GIBC0BRL, USA)的 I. 5mL Eppendorf 管中，充分振荡后，于室温下放置5min,加200 μ L氯仿，用カ振荡15sec,室温放置2_3min后，于4°C下12, OOOrmp离心15min ;将上清液(约600 μ L)吸入干净的I. 5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混勻，室温下放置IOmin后，于4°C下12，OOOrmp离心IOmin ;弃上清,加ImL 75%こ醇清洗，振荡后，于4で下7，500rmp离心5min ;室温干燥10_15min后溶于适量(30-40 μ L)RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。(2)青蒿DBR2基因的克隆将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述青蒿DBR2基因的编码序列(SEQ ID NO. I所示的DNA序列)，设计扩增出完整编码框的上游引物(SEQ ID NO. 2所示的DNA序列)和下游引物(SEQ ID NO. 3所示的DNA序列)，并在上游和下游引物上分別引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列測定由上海英骏生物技术服务有限公司测序完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的青高DBR2基因的编码序列(SEQ ID NO. I所不的DNA序列)一致。本实施例采用基因克隆方法从青蒿中获得序列正确的青蒿素生物合成关键酶基因DBR2，为通过转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量提供了ー个重要关键酶基因。步骤ニ，含DBR2基因的植物双元表达载体的构建(I)中间载体pMDT18-DBR2的构建
选用pMDT18载体(Takara，Dalian)为基本元件，构建中间载体pMDT18_DBR2。具体地，通过高保真酶扩增DBR2基因前后分别引入XmaI和SacI酶切位点的基因全长，通过连接酶连接到PMDT18载体上，由上海英骏生物技术服务有限公司测序确认基因的正确性。(2)含DBR2基因的植物表达载体的构建以所述的FSN (FSN表达载体为在pCAMBIA2300表达载体上改造获得并保存)为表达载体，将上述DBR2基因连入其对应的酶切位点位置。具体地，XmaI和SacI双酶切中间载体pMDT18-dbr2和表达载体FSN。回收DBR2基因片段和FSN载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。本实施例将青蒿素生物合成途径关键 酶基因DBR2可操作性地连接于表达调控序列，形成含DBR2基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高青蒿中
青蒿素的含量。步骤三，含DBR2基因双元植物表达载体根瘤农杆菌工程菌的获得将上述含DBR2基因的植物双元表达载体转入根瘤农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar I)，并进行PCR验证。步骤四，根瘤农杆菌介导DBR2基因转化青蒿(I)外植体的预培养青蒿种子用75%こ醇浸泡lmin，再用20% NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3_4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog, 1962)固体培养基中，25°C、16h/8h (light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。(2)农杆菌与外植体的共培养将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100ymol/L)中，滴加含活化好的所述含DBR2基因植物双元表达载体的根瘤农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28°C暗培养3天。以滴加在不带有目的基因的根瘤农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。(3)抗性再生植株的筛选将所述的共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA O. 5mg/L+NAA O. 05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于 25°C、16h/8h(light/dark)光照培养，甸两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。步骤五，转基因青蒿植株的PCR检测根据目的基因所在表达盒p35s-dbr2_nos序列p35s和dbr2分别设计正向引物和反向引物对目的基因进行检測。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出458bp的特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板吋，没有扩增出任何片段。本实施例将所述的植物表达载体转化根瘤农杆菌，获得用于转化青蒿的含DBR2基因植物表达载体的根瘤农杆菌菌株，利用所构建的根瘤农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。步骤六，利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量(l)HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制HPLC :采用 water alliance 2695 系统，色谱柱为 C-18 反相娃胶柱(SymmetryShield TM C18, 5 μ m, 250X4. 6mm, Waters),流动相为甲醇水，甲醇水的体积比为70 30，柱温30°C，流速I. OmL/min,进样量10 μ L，灵敏度(AUFS =1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。ELSD :采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40°C，放大系数(gain)为7,载气压力5bar ；精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2. Omg用ImL甲醇完全溶解,得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于_20°C备用。 本实施例中流动相为甲醇水，比例为70% 30%时，青蒿素的保留时间为5. lmin，峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。(2)标准曲线的制作将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2 μ L，4 μ L，6 μ L，8 μ L，10 μ L记录图谱及色谱參数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，μ g)进行回归分析。通过研究，本实施例中青蒿素在4-20 μ g范围内呈现良好的Iog-Iog线性关系。青蒿素对照品的Iog-Iog线性回归方程为 Y = 5. 404e+0000X+l. 858e+0000, R2 = O. 999184。(3)样品的制备和青蒿素含量的测定青蒿素的提取过程基于Van Nieuwerburgh et al. (2006)中报道的方法取少量新鮮的青蒿叶片(l_2g鲜重)，于50ml试管中将其浸没在IOml氯仿中摇荡I分钟，将浸出液倒入新的试管中使氯仿挥发完全，取3ml无水こ醇充分溶解提取物，经O. 22 μ m过滤滤头过滤后用于HPLC检测。同吋，氯仿提取后的叶片收集放入60°C烘箱进行烘干，称重(计算青蒿叶片的干重)；采用HPLC-ELSD測定青蒿素含量，样品进样体积为20 μ L，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。在实施例中转DBR2基因显著提高青蒿中青蒿素含量。转DBR2基因青高中青蒿素的含量最高可达到干重的22. 6mg/g(如图I所示)，是非转化普通青蒿(8mg/g干重)的
2.83 倍。本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，采用转化DBR2基因的代谢工程策略获得了青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供了ー种理想方法。
权利要求
1.ー种转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，包括如下具体步骤 (1)采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因DBR2； (2)把所述DBR2基因连结于表达调控序列，构建含DBR2基因的植物表达载体； (3)将所述含DBR2基因的植物表达载体转化根瘤农杆菌，获得含所述DBR2基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株； (4)利用所述含DBR2基因植物表达载体的根瘤农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的整合外源目的基因DBR2的转基因青蒿植株； (5)对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD測定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。
2.根据权利要求I所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步骤(I)中，所述基因克隆方法包括以下步骤提取青蒿基因组总RNA，将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA，根据SEQ ID NO. I所示的DNA序列，设计扩增出完整编码框的上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO. 2所示的DNA序列，所述下游引物为SEQ ID NO. 3所示的DNA序列，并在所述上游和下游引物上分別引入限制性内切酶位点以便构建表达载体，以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。
3.根据权利要求I所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步骤(2)中，所述构建含DBR2基因的植物表达载体包括以下步骤先构建中间载体PMDT18-DBR2,再用XmaI和SacI酶切中间载体pMDT18_DBR2和表达载体FSN，回收DBR2基因片段和FSN载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。
4.根据权利要求3所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述构建中间载体PMDT18-DBR2包括以下具体步骤通过高保真酶扩增DBR2基因前后分别弓I入XmaI和SacI酶切位点的基因全长，通过连接酶连接到pMDT18载体上。
5.根据权利要求I所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步骤(4)中，所述转化包括以下步骤外植体的预培养；农杆菌与外植体的共培养；抗性再生植株的筛选。
6.根据权利要求5所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述预培养包括以下步骤青蒿种子用75%こ醇浸泡Imin,再用20% NaClO浸泡20min,无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基中，25°C光照培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
7.根据权利要求5所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述共培养包括以下步骤将所述叶片外植体转到共培养培养基中，滴加含活化好的所述含DBR2基因植物双元表达载体的根瘤农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28°C暗培养3天，以滴加在不带有目的基因的根瘤农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
8.根据权利要求5所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述筛选包括以下步骤将所述共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基上于25°C光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将所述生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根，即可获得Kan抗性再生青蒿植株。
9.根据权利要求I所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步骤(4)中，所述PCR检测包括以下步骤设计合成DBR2基因的引物；进行DNA扩增；紫外线下观察，若目的条带为阳性，则该株系即为所述转基因青蒿植株。
10.根据权利要求I所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步骤(5)中，所述HPLC-ELSD測定包括以下条件所用色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相选用体积比为70 30的甲醇7K，柱温30°C，流速I. OmL/min,进样量20 μ L，蒸发光散射检测器漂移管温度40°C，放大系数为7，载气压力5bar。
全文摘要
本发明是一种生物技术领域的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明从青蒿中克隆青蒿醛Δ11(13)还原酶DBR2的基因，构建含DBR2基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将DBR2基因转入青蒿并再生出植株，PCR检测外源目的基因DBR2的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定(HPLC-ELSD)转基因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的2.83倍，从而提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。
文档编号C12N15/84GK102676578SQ20121001422
公开日2012年9月19日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者吴韶龑, 唐克轩, 沈乾, 王涛, 陆续, 陈韵斐 申请人:上海交通大学