一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法
【专利摘要】本发明公开了一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将豆瓣绿无菌苗叶片块放入三角瓶中，倒入农杆菌菌液进行侵染，瓶口密封抽真空，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中暗培养得到愈伤组织；筛选阶段：将愈伤组织转接到筛选培养基中筛选得到幼芽；生根阶段：将获得的幼芽转接到生根培养基培养，得到抗性苗；阳性检测阶段：取抗性苗的叶片，进行阳性检测，建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系。本发明提供的农杆菌介导豆瓣绿的转化体系，愈伤组织形成频率、分化频率以及转化率都较高，可以满足观音莲育种需求，适合大规模工业生产和商业育种。
【专利说明】
一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法
技术领域
[0001] 本发明属于农杆菌介导植物转染体系技术领域，尤其涉及一种建立农杆菌介导豆 瓣绿高效转染体系的方法。
【背景技术】
[0002] 豆瓣绿(Peperomia tetraphyIla)是胡椒科草胡椒属多年生常绿草本植物。小型 盆栽，体态玲珑、斑斓雅洁、端庄大方。常用白色塑料盆、白瓷盆栽培，置于茶几、装饰柜、博 古架、办公桌上，十分美丽。或任枝条蔓延垂下，悬吊于室内窗前或浴室处，也极清新悦目。 功效应用:对甲醛，二甲苯，二手烟有一定的净化作用。原产于台湾、福建、广东、广西、贵州、 云南、四川及甘肃南部和西藏南部。生于潮湿的石上或枯树上，是世界应用最普遍的观叶植 物之一。
[0003] 农杆菌介导的植物基因转化系统目前广泛应用于植物基因工程研究。根癌农杆菌 中含Ti质粒，该质粒的部分DNA片段可整合到宿主细胞中，从而整合到植物的基因组中。目 前，还没有文献和专利报道过农杆菌成功介导豆瓣绿转基因。使用农杆菌介导豆瓣绿转化， 可以使豆瓣绿快速获得目的性状，而且可以突破豆瓣绿自身遗传屏障，获得难以通过传统 育种方式生产的新品种。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的不足，本发明提供一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方 法。本发明使用农杆菌介导豆瓣绿转化，打通豆瓣绿农杆菌介导高效转染体系。这是通过农 杆菌转染体系培育新型豆瓣绿最为重要的一步，建立豆瓣绿农杆菌介导高效转染体系意味 着能够突破豆瓣绿自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。
[0005] 本发明的技术方案如下：一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特 征在于，所述方法包括以下步骤：
[0006] 侵染和共培养阶段:将豆瓣绿无菌苗叶片块放入三角瓶中，倒入农杆菌菌液进行 侵染，瓶口密封抽真空，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中暗培养，共培 养目的是让菌液和无菌苗叶片充分接触，充分完成转基因过程；
[0007] 所述共培养培养基：5!1基础配方+了020.01~2.511^.1/1+熟40.01~2.011^·!/ 1+ IBA 0.01 ~2.0mg · L-工+鹿糖30~60g · L-工+葡萄糖 10~60g · L-工+琼脂8~16g · L-hAS 100 ~300ymol · L-SpH 5.2~5·8，120~125Γ灭菌20-30min;
[0008] 其中SH基础配方:硝酸钾2~5.Og · I/1，硫酸镁0.1~0.4g · I/1，磷酸二氢铵0.3~ 0.6g · L-S氯化钙150~300mg · L-S甘氨酸2~4mg · L-S肌醇100~200mg · L-S盐酸硫胺素 0.4~0.8mg · L-S盐酸吡咳素 0.5~l.Omg · L-S烟酸0.5~l.Omg · L-S乙二胺四乙酸铁纳 10~40mg · L-S六水氯化钴0· 1~0.2mg · L-S五水硫酸铜0.2~0.4mg · L-S硼酸5~IOmg · L-1，碘化钾1~2mg · L-S-水硫酸锰10~20mg · L-S二水钼酸钠 0.1~0.2mg · L-S七水硫酸 锌1~2mg · L-S以下步骤中的SH基础配方也采用该配方。
[0009] 所述侵染条件如下：真空度为0.2~1.0 Kpa，侵染时间为12~48h;侵染时间过短， 农杆菌与豆瓣绿组织接触时间短，侵染效果不好;侵染时间过长，造成被侵染细胞死亡以及 农杆菌抑制不住等问题；
[0010] 所述共培养条件如下：暗培养温度20~28°C，培养时间为3~7天。
[0011]筛选阶段:将共培养后的叶片转接到筛选培养基中筛选得到幼芽；
[0012] 筛选阶段:所述筛选培养基成分如下：SH基础配方+TDZO .01~2.5mg · L-kNAAO· 01 ~2.0mg · L-klBA 0.1~2.0mg · L-h蔗糖30~60g · L-h琼脂8~16g · L-h羧苄青霉素 250 ~75〇11^.1/1+潮霉素 20~20〇11^.1/1印!15.2~5.8。
[0013] 筛选阶段:共培养后的叶片转接到筛选培养基中进行第一次筛选，培养20~30天 后，更换筛选培养基，进行第二次筛选，培养25~30天得到幼芽；
[0014] 第一次筛选和第二次筛选培养条件如下：20~28 °C光照培养，每天光照10~16h， 光照强度1000~30001x。
[0015] 生根阶段:将获得的幼芽转接到生根培养基培养，得到抗性苗；
[0016] 所述生根培养基成分如下：SH基础配方+IBA 0.1~1.6mg · L-b蔗糖30~60g · L-1 +琼脂8~16g · L-IPH5.2~5.8。
[0017] 生根培养条件如下：22~28°C光照培养7~8周，光照强度为1000~30001x，光照时 间为12~14h/天。
[0018] 阳性检测阶段:取抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电 泳，得到农杆菌成功侵染豆瓣绿的阳性苗，建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系。
[0019] 本发明所述豆瓣绿无菌苗可以采用以下制备方法得到，当然也可以采用其他方法 制备：
[0020] 豆瓣绿幼芽培养阶段:将豆瓣绿幼芽消毒灭菌后半嵌接种于基础培养基中培养成 无菌苗；豆瓣绿幼芽消毒杀菌过程如下：使用无菌水冲洗5~12次，在75%乙醇中浸泡60~ 360s，再使用无菌水清洗5~12次，在0.1~0.5 %升汞中浸泡5~15min，再使用无菌水清洗 种子5~15次，放在滤纸上晾干。
[0021 ] 显瓣绿幼芽培养条件为：20~28°C光照培养，每天光照10~16h，光照强度1000~ 30001x，培养时间30~90天；
[0022] 所述基础培养基的成分如下：SH基础配方+琼脂8~16g · L-4蔗糖30~60g · L一S ρΗ5·2~5.8，120~125°(：高压灭菌2〇-3〇11^11。
[0023]为了得到数量较多的豆瓣绿无菌苗，需要进行无菌苗扩繁。
[0024]无菌苗扩繁阶段:将萌发长到5~12cm的无菌苗切成带有叶节的小段，不能伤害叶 节，把叶节接入到基础培养基中进行扩繁培养；
[0025] 无菌苗扩繁培养条件为：20~28°C光照培养30~90天，每天光照10~16h，光照强 度1000~30001x。
[0026]本发明所述农杆菌菌液制备:将农杆菌加入到添加有40~65mg/L卡那霉素和40~ 70mg/L利福平的YM培养基中，2000~4000r/min，4~8°C离心10~20min，弃上清，下层加入 重悬液使OD值达到0.4~0.8，最后向菌液中加入AS，终浓度为100~300μπιο1 · I/1，混匀备 用。
[0027]所述YM培养基成分如下：蛋白胨5-20g/L，酵母提取物5-10g/L，氯化钠5-20g/L，农 杆菌在YM培养基中培养条件如下:26~32°C培养12~24h，有无光照不影响效果。
[0028] 所述重悬液为SH基础配方+蔗糖30~60g · L-SPH5.2~5.8，120~125°(：灭菌20~ 30min〇
[0029] 农杆菌植物转化虽然比较常见，但一般都针对水稻等谷物植物；由于豆瓣绿的基 因屏障作用较强，农杆菌很难侵染到豆瓣绿基因中，因此其他植物的农杆菌转化方法对豆 瓣绿的借鉴意义很小。
[0030] 以豆瓣绿为模型的研究平台，建立豆瓣绿的组织培养体系以及转基因体系的重点 在于共培养、筛选和生根培养等过程。而共培养基、筛选培养基、以及生根培养基中加入的 激素种类及组合、激素添加量以及培养时间，都有不可预知、不可控的结果。根据研究，发现 在本发明提供的侵染条件下容易打破其基因屏障，农杆菌能够成功介导豆瓣绿，且本发明 采用的激素配方以及培养时间比较适合侵染后的豆瓣绿共培养、筛选等，愈伤组织形成频 率较高。
[0031] 本发明通过对共培养、筛选和抗性苗培养(生根培养)步骤的不断探索，摸索出最 佳培养条件，成功打通宽叶不死鸟农杆菌介导高效转染体系，愈伤组织形成频率达到90% 以上，愈伤组织分化频率达85%以上，转化效率达50%以上，可以满足豆瓣绿育种需求，适 合大规模工业生产和商业育种。
[0032] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:本发明提供的农杆菌介导豆瓣绿的 转化体系，愈伤组织形成频率、分化频率以及转化率都较高，可以满足观音莲育种需求，适 合大规模工业生产和商业育种。
【附图说明】
[0033] 图1为实施例1中豆瓣绿转化阳性苗PCR扩增后的凝胶电泳图；
[0034]图2为实施例2中豆瓣绿转化阳性苗PCR扩增后的凝胶电泳图；
[0035]中英文对照
[0036] SH:Protocol for Schenk and Hildebrandt，SH培养基；
[0037] NAA: a-萘乙酸
[0038] AS:乙酰丁香酮；
[0039] Hyg:潮霉素；
[0040] Carb:羧苄青霉素；
[0041 ] IBA:吲噪丁酸；
[0042] TDZ:噻苯隆；
【具体实施方式】
[0043]下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
[0044]实施例1:豆瓣绿的诱导愈伤及农杆菌介导高效转染
[0045]步骤1获得豆瓣绿无菌苗阶段:将豆瓣绿幼芽置于无菌水中冲洗6次，倒去无菌水， 加入75 %乙醇，摇晃60s，倒出乙醇，无菌水清洗6次，倒出无菌水，加入0.1 %升汞，浸泡 6min，倒出升汞并回收，无菌水清洗种子6次，把种子放在滤纸上吹干。将种子一半接触空 气，半嵌接种于基础培养基（SH基础配方+琼脂8g · L-4蔗糖30g · L-1，？耶.2，120°(：高压灭 菌20min)，20~22°C光照培养，每天光照10h，光照强度1000~15001x;
[0046] SH基础配方：硝酸钾2g · I/1，硫酸镁0.1 · I/1，磷酸二氢铵0.3g · I/1，氯化钙 150mg · L-S甘氨酸2mg · L-S肌醇IOOmg · L-S盐酸硫胺素0.4mg · L-S盐酸吡咳素0.5mg · L-S烟酸0.5mg · L-S乙二胺四乙酸铁纳IOmg · L-S六水氯化钴O.lmg · L-S五水硫酸铜 0.2mg · L-S 硼酸5mg · L-S碘化钾Img · L-S-水硫酸猛IOmg · L-S 二水钼酸钠0· Img · L-S 七水硫酸锌Img · Γ1;以下步骤也采用该配方。
[0047] 步骤2无菌苗扩繁阶段:30天后，将步骤1中萌发长到5cm左右的无菌苗叶片切成带 有叶节的小段，不能伤害叶节，把叶节接入到基础培养基中，20~22°C光照培养。
[0048] 步骤3农杆菌准备阶段:将导入植物双元载体PCAMBIA1300的农杆菌加入到添加有 40mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的抗生素的YM培养基中，摇床培养的转速100r/min，28°C 培养过夜，之后把菌液放入离心机，2000r/min，4 °C离心10min，倒掉上清液，加入重悬液使 OD值达到0.4;重悬液为SH基础配方+鹿糖30g · L-^ρΗδ. 2,120°C高温灭菌20min。最后向菌 液中加入IOOymol · IZ1AS,混匀备用；
[0049] YM培养基成分:蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
[0050] 步骤4侵染和共培养阶段:在基础培养基中培养30天后，将步骤2中获得的无菌苗 切成Imm2左右的叶片块，放入IOOmL三角瓶中约200块叶片块，向三角瓶中倒入适量步骤3获 得的菌液，套上封口膜并用橡筋勒紧，抽真空到0.2kPa，保持12h，倒去菌液，将叶片晾干，转 接到共培养培养基（SH基础配方+TDZ 0.04mg · L-i+NAAO .06mg · L-WlBAOJmg · L-1+蔗糖 30g · L-b葡萄糖IOg · L-b琼脂8g · L-hAS IOOymol · L-SpH 5.2，120°〇灭菌2〇111；[11)，20~ 22 °C暗培养。
[0051] 步骤5筛选阶段:在共培养基中暗培养7天后，将步骤4中获得的叶片转接到筛选培 养基（SH基础配方+TDZ 0.04mg · L-i+NAAO.Oemg · L-hlBA 0.3mg · L-h蔗糖30g · L-h琼脂 8g · L-k羧苄青霉素250mg · L-k潮霉素30mg · L-1，？!15.2)，20~22°(：光照培养，每天光照 l〇h，光照强度1000~15001x，筛选20天后，更换筛选培养基，进行二次筛选；
[0052]步骤6生根阶段:二次筛选培养20天后，将步骤5中获得的幼芽转接到生根培养基 (3!1基础配方+18六0.211^.1/1+蔗糖3(^.1/1+琼脂88.1/1，？!15.2)，
[0053] 培养条件如下：20~22 °C光照培养7周，光照强度为1000~15001X，光照时间为 IOh/天。
[0054] 步骤7阳性检测阶段:在生根培养基培养约7周后，将步骤6获得的抗性苗取叶片， 提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，确定是否存在阳性条带，确定阳性苗。
[0055] PCR扩增条件： 步骤序号 温度 时间 1 95 ? 3min
[0056] rK 95 C1 60~360s 4SS C 60~360s 4c 72 0C Imin
[0057] 5 72°C 15-4 Smin 6 4 °C I Omin
[0058] 其中 2c-3c_4c 循环 30 次。
[0059] 电泳条件：电压IOOv，电流100mA
[0060] 本发明检测的抗性植株对于潮霉素具有一定的抗性，证明导入的潮霉素抗性基因 已经表达。
[0061 ] 参考图1，9号，26号，43号泳道为DL2000marker;50号泳道为阳性对照；51号泳道为 阴性对照；1号，2号，4号，5号，6号，8号，11号，15号，17号，22号，23号，24号，27号，28号，31 号，33号，37号，38号，39号，41号，42号，45号，48号，49号泳道为阳性，共计24个泳道获得与 阳性对照相同的电泳条带，证明为阳性植株。
[0062] 实施例1中，愈伤组织形成率91.3%，长绿苗的频率为85.6%，生根率99.1 %，转化 率52.2%，如表1、表2和表3所示。
[0063]表 1
[0069]实施例2:豆瓣绿的诱导愈伤及农杆菌介导高效转染
[0070]步骤1获得豆瓣绿无菌苗阶段:将豆瓣绿幼芽置于无菌水中冲洗10次，倒去无菌 水，加入75%乙醇，摇晃300s，倒出乙醇，无菌水清洗10次，倒出无菌水，加入0.5%升汞，浸 泡15min，倒出升汞并回收，无菌水清洗种子10次，把种子放在滤纸上吹干。将种子一半接触 空气，半嵌接种于基础培养基（SH基础配方+琼脂15g · I/1+蔗糖50g · 1/1，？!15.6，125°(：高压 灭菌30min)，26~28°C光照培养，每天光照15h，光照强度2000~25001x;
[0071] SH基础配方：硝酸钾4.0g · I/1，硫酸镁0.3g · I/1，磷酸二氢铵0.5g · I/1，氯化钙 250mg · L-、甘氨酸4mg · L-、肌醇180mg · L-、盐酸硫胺素 0.75mg · L-、盐酸吡咳素 l.Omg · L-1，烟酸l.Omg · L-S乙二胺四乙酸铁纳35mg · L-S六水氯化钴0.2mg · L-S五水硫酸铜 0.4mg · L-S硼酸IOmg · L-S碘化钾2mg · L-S-水硫酸猛 18mg · L-S二水钼酸钠 0.2mg · L 一、七水硫酸锌2mg · I/1;以下步骤也采用该配方。
[0072] 步骤2无菌苗扩繁阶段:30天后，将步骤1中萌发长到IOcm左右的无菌苗叶片切成 带有叶节的小段，不能伤害叶节，把叶节接入到基础培养基中，26~28°C光照培养。
[0073] 步骤3农杆菌准备阶段:将导入植物双元载体PCAMBIA1300的农杆菌加入到添加有 60mg/L卡那霉素和65mg/L利福平的抗生素的YM培养基中，摇床培养的转速200r/min，28°C 培养过夜，之后把菌液放入离心机，4000r/min，4 °C离心15min，倒掉上清液，加入重悬液使 OD值达到0.75;重悬液为SH基础配方+鹿糖50g · L-1，pH5.6，125°C高温灭菌30min。最后向菌 液中加入250ymol · L-1AS,混匀备用；
[0074] YM培养基成分:蛋白胨15g/L，酵母提取物I Og/L，氯化钠20g/L;
[0075] 步骤4侵染和共培养阶段:在基础培养基中培养70天后，将步骤2中获得的无菌苗 切成5mm2左右的叶片块，放入IOOmL三角瓶中约400块叶片块，向三角瓶中倒入适量步骤3获 得的菌液，套上封口膜并用橡筋勒紧，抽真空到0.8kPa，保持45h，倒去菌液，将叶片晾干，转 接到共培养培养基（SH基础配方+TDZ 2.2mg.L-kNAA 1.75mg.L-WlBA 1.8mg.L-W蔗糖 50g · L-b葡萄糖55g · L-b琼脂 15g · L-hAS 250ymol · L-SpH 5.68，125°C灭菌30min)，26 ~28 °C暗培养。
[0076] 步骤5筛选阶段:在共培养基中暗培养7天后，将步骤4中获得的愈伤组织转接到筛 选培养基（SH基础配方+TDZ 2.2mg · L-hNAA 1.75mg · L-WlBA 1.8mg · L-W蔗糖50g · L-工+ 琼脂15g · L-b羧苄青霉素700mg · L-b潮霉素175mg · L-^!15.6),26~28°C光照培养，每天 光照15h，光照强度2000~25001x。筛选30天后，更换筛选培养基，进行二次筛选；
[0077] 步骤6生根阶段:二次筛选培养30天后，将步骤5中获得的幼芽转接到生根培养基 (SH基础配方+IBA 1.4mg · L-h鹿糖50g · L-4琼脂 15g · L-ΙρΗδ.θ)，
[0078] 培养条件如下：26~28 °C光照培养8周，光照强度为2000~25001 χ，光照时间为 15h/天。
[0079] 步骤7阳性检测阶段:在生根培养基培养约8周后，将步骤6获得的抗性苗取叶片， 提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，确定是否存在阳性条带，确定阳性苗。
[0080] PCR扩增条件： 步骤序号 温度 时间 1 95 Γ 3 rain 2c 95 C 60~360s
[0081] 3c 55 C 60~360s 4c "I C I mm 5 72 C 15~15min 6 4 0C IOmin
[0082] 其中 2c-3c_4c 循环 30 次。
[0083] 电泳条件：电压IOOv，电流100mA
[0084] 本发明检测的抗性植株对于潮霉素具有一定的抗性，证明导入的潮霉素抗性基因 已经表达。
[0085] 参考图2,9号，26号，43号泳道为01^200011^11?^;50号泳道为阳性对照 ；51号泳道为 阴性对照；1号，2号，3号，6号，8号，10号，11号，16号，17号，18号，20号，21号，23号，27号，28 号，30号，31号，36号，37号，40号，42号，46号，47号，49号泳道为阳性，共计24个泳道获得与 阳性对照相同的电泳条带，证明为阳性植株。
[0086] 实施例2中，愈伤组织形成率90.7%，长绿苗的频率为83.9%，生根率98.4%，转化 率50.8%，如表4、表5和表6所示。
[0087]表 4
[0094] 筛选之后分化所得的阳性苗经过如上验证，证实了本发明中通过农杆菌遗传介导 的方法能将外源基因引入豆瓣绿基因组。因此，采用此方法进行豆瓣绿的诱导愈伤及农杆 菌介导的高效转染，可以使豆瓣绿快速获得目的性状，而且可以突破豆瓣绿自身遗传屏障， 获得难以通过传统育种方式生产的新品种。
[0095] 实施例3
[0096]分别改变侵染条件、共培养条件，具体结果如表7、8、9和10所不。
[0097]表 7
[0101] 说明：表中的转化率是指共培养后，叶片就进行GUS染色，得到的转化率。（采用组 织化学法检测，以5-溴-4-氯-3-Π 引噪-β-匍萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用 含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了 gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件 下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。）
[0102] 由表7可知:本发明提供的侵染条件和共培养条件容易打破豆瓣绿基因屏障，农杆 菌成功介导豆瓣绿转化体系，且转化率较高。
[0103] 其中，虽然共培养8~10天转化率稍高一些，但是后期农杆菌抑制不住，在筛选的 时候全部死亡。共培养3~7天后，上筛选农杆菌能抑制住，在筛选的时候农杆菌污染比较 少。
[0104] 表8
[0106] 说明：表中的转化率是指共培养后
，叶片就进行GUS染色，得到的转化率。（采用组 织化学法检测，以5-溴_4_氯-3-Π 引噪-β-匍萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用 含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了 gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件 下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。）
[0107] 表8可以看出在合适的真空度下(0.2~I.OKpa)，转化率比较好。
[0108] 表9
[0111] 说明：表中的转化率是指共培养后，叶片就进行GUS染色，得到的转化率。（采用组 织化学法检测，以5-溴-4-氯-3-Π 引噪-β-匍萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用 含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了 gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件 下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。）
[0112] 表9可以看出在合适的侵染时间范围内（12h~48h)，转化率比较好。
[0113]时间过长，则会造成侵染过度，使得植物细胞死亡。
[0114]表 1〇
[0117] 说明：表中的转化率是指共培养后，叶片就进行GUS染色，得到的转化率。（采用组 织化学法检测，以5-溴_4_氯-3-Π 引噪-β-匍萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用 含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了 gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件 下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。）
[0118] 表10可以看出，缺少某一种激素培养时，转化率都偏低。
【主权项】
1. 一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下 步骤： 侵染和共培养阶段:将豆瓣绿无菌苗叶片块放入三角瓶中，倒入农杆菌菌液进行侵染， 瓶口密封抽真空，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中暗培养； 筛选阶段:将共培养后的叶片转接到筛选培养基中筛选得到幼芽； 生根阶段:将获得的幼芽转接到生根培养基培养，得到抗性苗； 阳性检测阶段:取抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得 到农杆菌成功侵染豆瓣绿的阳性苗，建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系。2. 如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述 共培养培养基：SH 基础配方+TDZ0.01 ~2.5mg · L-i+NAAO.Ol ~2.0mg · L-i+IBA 0.01 ~ 2.0mg · L-k鹿糖30~60g · L-k葡萄糖 10~60g · L-h琼脂8~16g · L-hAS 100~300ymol · L-SpH 5.2~5.8，120~125。。灭菌2〇-3〇11^11; 其中SH基础配方：硝酸钾2~5.0g · I/1，硫酸镁0.1~0.4g · I/1，磷酸二氢铵0.3~ 0.6g · L-S氯化|丐150~300mg · L-S甘氨酸2~4mg · L-S肌醇100~200mg · L-S盐酸硫胺素 0.4~0.8mg · L-S盐酸吡咳素 0.5~l.Omg · L-S烟酸0.5~l.Omg · L-S乙二胺四乙酸铁纳 10~40mg · L-、六水氯化钴0· 1~0.2mg · L-、五水硫酸铜0.2~0.4mg · L-S硼酸5~10mg · L一、碘化钾1~2mg · L-S-水硫酸锰10~20mg · L-S二水钼酸钠 0.1~0.2mg · L-S七水硫酸 锌 1 ~2mg · L-、3. 如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述 侵染条件如下:真空度为0.2~l.OKpa，侵染时间为12~48h;所述共培养条件如下：暗培养 温度20~28 °C，培养时间为3~7天。4. 如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，筛选 阶段:所述筛选培养基成分如下：SH基础配方+TDZ 0.01~2.5mg · I^+NAAO.Ol~2.0mg · L -klBAO.l~2.0mg · L-h蔗糖30~60g · L-h琼脂8~16g · L-h羧苄青霉素250~750mg · L-1 +潮霉素20~20〇1^.1/1，口!15.2~5.8。5. 如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，筛选 阶段:共培养后的叶片转接到筛选培养基中进行第一次筛选，培养20~30天后，更换筛选培 养基，进行第二次筛选，培养25~30天得到幼芽； 第一次筛选和第二次筛选培养条件如下：20~28°C光照培养，每天光照10~16h，光照 强度 1000 ~30001x。6. 如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，生根 阶段中所述生根培养基成分如下：SH基础配方+IBA0.1~1.6mg · I/1-蔗糖30~60g · I/b琼 月旨8~16g · L-SPH5.2~5.8; 生根培养条件如下：22~28°C光照培养7~8周，光照强度为1000~30001x，光照时间为 12 ~14h/天。7. 如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述 豆瓣绿无菌苗制备方法如下： 豆瓣绿幼芽培养阶段:将豆瓣绿幼芽消毒灭菌后半嵌接种于基础培养基中培养成无菌 苗； 所述豆瓣绿幼芽消毒杀菌过程如下:使用无菌水冲洗5~12次，在75%乙醇中浸泡60~ 360s，再使用无菌水清洗5~12次，在0.1~0.5 %升汞中浸泡5~15min，再使用无菌水清洗 种子5~15次，放在滤纸上晾干。8. 如权利要求7所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述 基础培养基的成分如下：SH基础配方+琼脂8~16g · L-4蔗糖30~60g · 120 ~125Γ 灭菌 20-30min。 显瓣绿幼芽培养条件为：20~28 °C光照培养，每天光照10~16h，光照强度1000~ 30001x，培养时间30~90天。9. 如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，农杆 菌菌液制备:将农杆菌加入到添加有40~65mg/L卡那霉素和40~70mg/L利福平的YM培养基 中，2000~4000r/min，4~8°C离心10~20min，弃上清，下层加入重悬液使OD值达到0.4~ 0.8,最后向菌液中加入AS，终浓度为100~300μηιο1 · I/1，混勾备用。10. 如权利要求9所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所 述ΥΜ培养基成分如下：蛋白胨5-20g/L，酵母提取物5-10g/L，氯化钠5-20g/L，农杆菌在ΥΜ培 养基中培养条件如下:26~32°C培养12~24h; 所述重悬液为SH基础配方+鹿糖30~60g · L-SPH5.2~5.8，120~125°〇灭菌20~ 30min〇
【文档编号】A01H4/00GK105861543SQ201610495149
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】颜笑洒, 段康, 蒋欣雨, 张业胜, 董扬
【申请人】云南纳博生物科技有限公司