在这个程度上所述靶点的调节造成了感兴趣的表型，并且因此造成了疾病或表型 特征，所述靶点因此被鉴定为所述疾病或所述表型特征的生物标记物。
[0372] 定义
[0373] 在本发明的范围内，术语"纳米颗粒"指直径小于1微米的颗粒。在特定的实施方 式中，所述纳米颗粒的平均直径为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、 300nm，或至多 300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、1011111。在特定的实施方式 中，所述纳米颗粒的平均直径在l〇nm至500nm之间，优选在20nm至200nm之间，仍然优选 在50nm至150nm之间。
[0374] 在本申请的范围内，术语"纳米乳剂"指具有至少两相（通常为油相和水相）的组 合物，其中，分散相的平均大小小于1微米，优选为l〇nm至500nm并且特别为20nm至200nm， 并且最优选为 50nm至 200nm(参见文章C.Solans,P.Izquierdo,J.Nolla,N.Azemarand M.J.Garcia-Celma,CurrOpinColloidIn,2005,10,102-110)〇
[0375] 在本申请的含义中，表述"分散相"指包括可选的油/阳离子表面活性剂/增溶脂 质/两亲性脂质/助表面活性剂/可选的式（I)的表面活性剂/可能的膜融合脂质/候选 分子/荧光团/唯一DNA标签的微滴。分散相通常不含水相。
[0376] 术语"微滴"涵盖严格意义上的液态油的微滴，以及来自其中的分散相是固态的水 包油型乳剂的固态颗粒。在后一种情况中，还经常被称作固态乳剂。
[0377] 术语"脂质"在该讨论的范围内指所有脂肪，或包含在动物来源的脂肪或植物油中 含脂肪酸的物质。这些是主要由碳、氢和氧组成并且密度低于水的疏水性或两亲性分子。月旨 质在室温（25°C)下可以为固态（如蜡状物）或液态（如油）。
[0378] 术语"磷脂"针对具有磷酸基团的脂质，尤其为甘油磷脂。最经常地，磷脂包含由 脂肪酸链形成的亲水性末端。磷脂特别是磷脂酰胆碱、磷酯酰乙醇胺、磷酯酰肌醇、磷酯酰 丝氨酸和鞘磷脂。
[0379] 术语"卵磷脂"指磷酯酰胆碱，即由胆碱、磷酸脂、甘油和两种脂肪酸形成的脂质。 更广泛地覆盖从植物或动物来源的活的有机体提取的磷脂，迄今为止，它们大部分由磷酯 酰胆碱组成。这些卵磷脂通常形成携带不同脂肪酸的卵磷脂的混合物。
[0380] 术语"脂肪酸"指具有至少4个碳原子的碳链的脂肪族羧酸。天然脂肪酸具有4至 28个碳原子（通常为偶数）的碳链。脂肪酸指长度为14至22个碳的长链脂肪酸，并且如 果有多于22个碳，则指极长链脂肪酸。
[0381] 术语"表面活性剂"指具有两亲性结构的化合物，该两亲性结构给予它们对于油/ 水和水/油类型的界面的特别的亲和性，给予它们降低这些界面的自由能并且使分散系统 稳定的能力。
[0382] 术语"助表面活性剂"指除了表面活性剂之外的用于进一步降低界面的能量的表 面活性剂。
[0383] 术语"烃链"指由碳和氢原子组成的饱和或不饱和（双键或三键）的链。优选的 烃链是烷基或烯基。
[0384] 术语"亚烷基"意于指直链或支链的、饱和二价基团，优选直链烃脂族二价基团。
[0385] 下面将利用所附附图和下面的实施例，更加详细地描述本发明。
【附图说明】
[0386] 图1示出了例示以纳米乳剂形式的制剂微滴的核/冠结构的示意图，该纳米乳剂 包括如在本发明中限定的连续的水相和至少一种分散相，并且包括可以调节干扰RNA内源 性机制的核苷酸序列、示踪物和唯一DNA标签。1代表连续的水相，2代表微滴的（部分）冠， 并且3代表微滴的（部分）核。在冠2中，例示了 ：两亲性脂质（例如中性磷脂，诸如卵磷 脂），阳离子表面活性剂（阳离子磷脂，例如D0TAP)，助表面活性剂其向后折叠的聚（环氧 乙烷）链被呈现在水相中，可以调节干扰RNA内源性机制的双链核苷酸序列（例如siRNA) 和唯一DNA标签。
[0387] 图2例示了在UV下揭示的通过siRNA与制剂B10 (其浓度具体示于表8中）的复 合得到的电泳凝胶。比例尺和siRNA(对照）在左侧。
[0388] 图3给出了通过在软件包ImageJ上处理图2的在UV下揭示的电泳凝胶的电泳数 据所获得的siRNA(ng)的量的结果。
[0389] 图4例示了在ZetaSizerMalvern设备上获得的强度相对于游离siRNA(对比） 和根据本发明的以N/P比率复合的三种制剂的水动力学直径（nm)变化的曲线图；其中，根 据本发明的三种制剂的N/P比率分别为4/U8/1或16/1，N/P比率为"预混合"制剂中的 阳离子表面活性剂的正电荷的量（带电的氮，由此为N/P的N)与siRNA提供的负电荷的量 (siRNA的磷，由此为N/P的P)之比。
[0390] 图5代表了在UV下揭示的电泳凝胶，从左至右为：
[0391] 比例尺，
[0392] 游离的siRNA(对照）
[0393] 然后为通过siRNA与以下物质复合获得的迀移：
[0394]制剂B1 (对比例）（没有复合，siRNA是游离的），
[0395] 制剂B6,其制剂中的阳离子表面活性剂的正电荷的量与siRNA带来的负电荷的量 的比率为8/1 (定量复合），
[0396] 制剂B6,其制剂中的阳离子表面活性剂的正电荷的量与siRNA带来的负电荷的量 的比率为8/1 (定量复合），
[0397] 制剂B10,其制剂中的阳离子表面活性剂的正电荷的量与siRNA带来的负电荷的 量的比率为8/1 (定量复合），
[0398] 脂质体（对比例）（不完全复合）。
[0399] 图6例示了在复合（T0)之后不久，以及在复合之后15min、45min、lh30min、3h和 6h，在UV下揭示的siRNA/制剂B10复合物的电泳凝胶。比例尺和siRNA(对照）在左侧。[0400] 图7例示了通过使用以下物质转染细胞，以％表示的荧光强度FITC的降低：
[0401]脂质体RNAimax(商业试剂），
[0402]siRNA/制剂B1复合物，
[0403]siRNA/制剂B6复合物，制剂在复合之前已经在室温保持了 7个月，
[0404]siRNA/制剂B6复合物，制剂在复合之前已经在室温保持了 12个月，
[0405]siRNA/制剂B10复合物，制剂在复合之前已经在室温保持了 12个月，
[0406]siRNA/ 包括D0TAP(58 %wt)、D0PE(18 %wt)、胆固醇（2 %wt)和 DSPE-PEG3000(22%wt)的阳离子脂质体制剂的复合物（对比）。
[0407] 图8例示了对于siRNA/制剂B10复合物（siRNA被称为靶向编码GFP蛋白的mRNA 的siGFP)，以及对于阴性对照（细胞与和阴性对照siRNA复合的制剂B10孵育，阴性对照 siRNA即"惰性的"，对被细胞的转录组没有任何影响，被称为siAllStar)，实验过表达荧光 蛋白GFP(绿色荧光蛋白）的三种细胞系的荧光强度（FITC) :U20S、PC3和Hela。
[0408] 图9例示了揭示纳米颗粒A3/DNA标签/siRNA复合物的电泳凝胶。核酸利用试剂、 GelRed核酸凝胶染色剂（Interchim，Ref.BY1740)来揭示。
[0409] 图10例示了在对HeLa细胞进行了FACS分析并且与纳米颗粒A3/DNA标签/siGFP 复合物孵育了72h之后，GFP的荧光平均值的定量结果。
[0410] 图11例示了在对HeLa细胞进行了FACS分析并且与纳米颗粒A3/DNA标签/siGFP 复合物孵育了72h之后，被封装的DID荧光团的荧光平均值的定量结果。
[0411] 图12例示了对应于HeLa细胞的GFP表达的FITC信号的FACS分析。这些细胞的 分选根据它们的GFP表达标准来完成，并且允许鉴定两种群体：强表达GFP的群体，和弱表 达GFP的群体。
[0412] 图13例示了在对预先分选的HeLa细胞进行提取并且进行PCR扩增之后的DNA标 签的电泳凝胶。
【具体实施方式】
[0413] 实施例
[0414]实施例1:含有DNA标答和siRNA的荧光纳米颗粒的设计和制备
[0415] 1. 1.包括连续的水相和至小一种分散相的纳米乳剂形式的制剂的制备和组成
[0416] 所使用的水相是缓冲溶液PBSIX。
[0417] 化合物的供应商如下：
[0418]LipoidS75-3：Lipoid
[0419]LipoidS75：Lipoid
[0420] Lipoid S100-3 :Lipoid
[0421]DOTAP：AvantiPolar
[0422]DOPE：AvantiPolar
[0423]MyrjS40：Croda
[0424] Suppocire NB ：Gattefosse
[0425]豆油：Croda
[0426] 制剂微滴的水动力学直径以及它们的G电位使用Malvern的ZetaSizer型设备 通过光的准弹性散射来测量。微滴的水动力学直径在PBS0.IX溶液中测量，（电位在NaCl 0. 15mM水溶液中测量。
[0427] 制成16种不同的制剂，其组成示于表1至表5中。
[0428]
[0429] 表 1
[0430]
[0431] 表2
[0432]
[0433] 表3
[0434] L/1N丄UDUD丄乙UD A * *1 * 厶/寸丄JA；
[0435] 表4
[0436]
[0437]表 5
[0438] 在表1至表5中：
[0439] %wt对应于质量百分比。
[0440] %mol.对应于摩尔百分比。
[0441]ND(未确定的）指没有进行实验。
[0442] 百分比"/微滴"代表相对于（类脂/DOTAP/MyrjS40/可选的DOPE/Suppocire NB/豆油）的集合的百分比。
[0443] 百分比"/冠"代表相对于（类脂/DOTAP/MyrjS40/可选的DOPE)的集合的百分 比。
[0444] 百分比"/冠，不含PEG"代表相对于（类脂/D0TAP/可选的DOPE)的集合的百分 比。
[0445] 百分比"/核"代表相对于（SuppocireNB/豆油）的集合的百分比。
[0446] 类脂S75-3包括65%~75%的磷酯酰胆碱。磷脂的脂肪链多数是饱和的（平均 组成：12%~16%的C16:0,80%~85%的C18:0,〈5%的C18:l，〈2%的C18:2)。
[0447] 类脂S75包括65%~75%的磷酯酰胆碱。磷脂的脂肪链多数是不饱和的（平均 组成：17%~20%的C16:0,2%~5%的C18:0,8%~12%的C18:l，58%~65%的C18:2， 4%~6%的C18:3) 〇
[0448] 类脂S100-3包括>94%的磷酯酰胆碱。磷脂的脂肪链多数是饱和的（平均组成： 12%~16%的C16:0,85%~88%的C18:0,〈2%的C18:l，〈1%的C18:2)。
[0449] 制剂Al、Bl、B4和C1是对比例，因为它们不包括任何阳离子助表面活性剂。
[0450] 它们的G电位是负的。
[0451] 根据所预期的，siRNA的复合不出现在微滴的表面处。
[0452] 制剂B9是对比例，因为它没有包括任何两亲性脂质。乳剂不能被制备。
[0453] 下面的制备方法如下：
[0454] ⑴油相的制备：
[0455] 豆油、suppocire NC、两亲性脂质、D0TAP、可选的DOPE进行称重，然后与二氯甲烧 混合，之后被加热至60°C，以获得同质的粘性溶液。二氯甲烷可以促进溶解。然后在真空中 蒸发溶剂。
[0456] (ii)水相的制备：
[0457] 在蒸发乙醇的阶段中，制备水相。在5ml的Eppendorf中，混合助表面活性剂、甘 油和PBS(NaCl154mM，pH7.4)的水溶液，然后在75°C的水浴中溶解。
[0458] (iii)混合两相：
[0459] 油相为大约40°C(为粘性形式），并且水相为大约70°C(接近时就离开水浴）。将 水相倾注到油相中。
[0460](iv)乳化：
[0461] 含有两相的烧瓶被附接到超声波仪AV505? (Sonics，牛顿（Newton),USA)的超 声密闭罩中。该程序由以下步骤组成：在40分钟的时间段中，以100W的功率，产生超声波 循环（每30秒活动10秒）。
[0462](V)纯化：
[0463] 然后，由此产生的微滴通过透析（截留阈值：12kDa，针对NaCl154mM，过夜）进行 纯化，以去除没有整合至LNP的脂质组分。最终，制剂在纤维素膜上通过过滤进行消毒。
[0464] ?制剂的微滴大小和G电位
[0465] 制剂组成的影响
[0466] 表1至表5的结果示出助表面活性剂（MyrjS40)的比例降低导致微滴直径增加。
[0467] 时间依赖的变化
[0468] 在40°C下测量制剂的微滴大小（表6)和G电位（表7)的时间依赖的变化（加 速的稳定性）。制剂在两次测量之间被保持在40°C。
[0469]
[0470] 表6 :通过光的准弹性散射测量的微滴大小和多分散性指数（PDI)相对于时间的 时间依赖的变化
[0471]
[0472] 表7 :制剂的G电位相对于时间的时间依赖的变化。
[0473] 观察到，根据本发明的制剂的微滴大小和G电位在40°C保持300天不发生变化。
[0474] 这些结果示出了根据本发明的制剂经过一段时间仍然是稳定的。
[0475]1. 2.与siRNA复合
[0476] 下面的普通程序如下：
[0477] 复合由上面制备的制剂和siRNA溶液（整体在缓冲液中）的简单混合而成。缓 冲液的选择依赖于所预期的应用：对于体外研究，使用用于转染步骤的优化的培养基 OptiMEM。对于复合研究，使用5mM的缓冲液H印es。
[0478]使用0? 5yg的siRNA(GFP-22siRNA罗丹明（目录号1022176) (Qiagen)或 siGFP(Sigma))(25yg/mL，20yL)。
[0479] 混合物在室温（大约25°C)下以600rpm搅拌30分钟。
[0480] 通过两种工具观察复合：
[0481] 允许观察siRNA迀移的琼脂糖凝胶电泳。如果有良好的复合，则包括复合的siRNA 的微滴将比游离的siRNA重，并且可孔中观察到。如果复合不太显著，则游离的siRNA迀移 至另一位置。
[0482] 在DLS中，通过观察复合对水动力学直径的影响，复合效率越高，水动力学直径的 分布轮廓越朝单一模式分布。
[0483] 优化具有siRNA的定量复合产量所需的制剂的量。
[0484] 在实践中，由siRNA带来的负电荷与制剂的正电荷（即阳离子表面活性剂D0TAP 的正电荷）平衡。
[0485] 典型地，如图2和图3中所示，当制剂的唯一的阳离子表面活性剂是D0TAP(其仅 包括单一的正电荷）时，在"预混合"制剂中的阳离子表面活性剂的正电荷的量与siRNA带 来的负电荷的量之比大于8/1时，获得定量的复合产量。
[0486] 图2例示了siRNA与具有表8中指定的浓度制剂B10复合（通过混合siRNA溶液 和5mM在H印es缓冲液中的制剂）之后产生的，在UV下揭示的电泳凝胶。在沉淀在1. 5% 的琼脂糖凝胶上之后，将2yL带电荷的缓冲液添加至测试中。在100V下电泳1小时30分 钟之后，将凝胶浸入到GelRed3X中。最后，使用UV进行显影。
[0487]
[0488]表 8
[0489] 图3给出了通过在软件包ImageJ上处理来自同一实验的电泳数据获得的结果。
[0490] 图2和图3显示对于大于8/1的"预混合"制剂的阳离子表面活性剂的正电荷的 量与siRNA提供的负电荷的量的比率，培养基中不再存在任何游离的siRNA，并且siRNA已 经被完全复合了。
[0491] 图4例示了在ZetaSizerMalvern设备上获得的强度相对于根据游离siRNA(对 比）和根据本发明的三种制剂的水动力学直径（nm)的变化曲线；其中，根据本发明的三种 制剂通过以"预混合"制剂中的阳离子表面活性剂的正电荷的量与siRNA带来的负电荷的 量的比率为4/U8/1或16/1进行复合获得。
[0492] 游离的siRNA(对比）的直径较大。
[0493] 对于"预混合"制剂中的阳离子表面活性剂的正电荷的量与siRNA带来的负电荷 的量的比率为4/1，观察到两个群体：大约100nm的siRNA/微滴复合物，和更大尺寸的群体 代表游离形式的siRNA(箭头）。
[0494] 对于"预混合"制剂中的阳离子表面活性剂的正电荷的量与siRNA带来的负电荷 的量的比率为8/1和16/1，仅观察到一个代表siRNA/微滴复合物的群体。
[0495] 这些结果还示出：允许siRNA在微滴上的定量复合（100% )。
[0496] 使用不同的制剂进行复合步骤。
[0497] 作为对比，使用不含阳离子表面活性剂的制剂（如上所述的制剂B1)进行复合测 试。如预期的那样，没有发生siRNA的复合，并且siRNA维持为游离的形式。
[0498] 图5例示了使用UV揭示的电泳凝胶，从左至右为：
[0499] 比例尺，
[0500] 游离的siRNA(对照）
[0501] 然后为通过siRNA与以下物质复合获得的迀移：
[0502]制剂B1 (对比例）（没有复合，siRNA是游离的），
[0503] 制剂B6(在6个月之前配制的预混合物），其"预混合"制剂中的阳离子表面活性 剂的正电荷的量与siRNA带来的负电荷的量的比率为8/1 (定量复合），
[0504] 制剂B6(在12个月之前配制的预混合物），其"预混合"制剂中的阳离子表面活性 剂的正电荷的量与siRNA带来的负电荷的量的比率为8/1，该制剂在复合（定量复合）之前 已经在室温保持了 7个月，
[0505] 制剂B10,其"预混合"制剂中的阳离子表面活性剂的正电荷的量与siRNA带来的 负电荷的量的比率为8/1 (定量复合），
[0506]脂质体（对比例）（不完全复合）。
[0507] 当使用制剂B6或B10时，siRNA的复合是定量的。在其与siRNA复合之前，制剂 在室温下的储存对复合产量没有影响，该复合产量仍然是定量的，这示出了所使用的制剂 的稳定性。
[0508] 不管所使用的制剂是否包括DOPE，产量都是定量的。
[0509] 使用商业转染试剂1^口(^6(^3111；[116 1?熟；[1]^1，发现高于60%的811?熟处于游离形 式。这暗示在本发明中使用的纳米乳剂的制剂提供了比Lipofectamine更好的复合产量。
[0510] 最后，得到上面制备的siRNA/制剂B10的siRNA分选（sorting-out)动力学，以 观察复合的时间依赖的变化，并且例示于图6中。在复合后长达3小时，没有发现处于游离 形式的siRNA。在6小时时，siRNA开始被分选出来。因此，复合物至少稳定3个小时。
[0511]1. 3.体外转染
[0512] 对过表达绿色荧光蛋白（GFP)的不同细胞系，进行在实施例1. 1.中限定的并且根 据实施例1. 2.与特异性抑制GFP的信使RNA序列的siRNA(GFP