卵巢癌癌组织3d培养方法及其在药效评价中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物学领域，特别是设及一种卵巢癌癌组织3D培养方法及其在药效 评价中的应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是严重危害人民身体健康的主要疾病之一，肿瘤的发生机理多样而复杂，但 目前常规的化疗药物几乎都是针对增殖能力旺盛细胞的细胞毒药物，对人体内正常的高增 殖细胞也产生毒副作用。因此，许多药物研发机构均致力于开发高效、低毒和高特异性的祀 向性抗肿瘤药物，传统单一的抗肿瘤药物筛选方法也已不足W应付抗肿瘤药物药效学发展 的需求。
[0003] 伴随着对肿瘤发病机理认识的不断深入和肿瘤祀向性药物的开发，精确化医疗逐 渐成为未来肿瘤医学研究与应用的趋势，而精确化治疗的关键在于肿瘤基因和生物分子标 志物的诊断、微环境对肿瘤进展和疗效的影响W及基于前者条件下的抗癌药物种类和剂量 的个体化选择。
[0004] 目前抗肿瘤药物筛选评价的体外方法主要是肿瘤细胞的2D培养系统，体内筛选 评价方法主要使用的是动物模型。
[0005] 2D培养时，肿瘤细胞在形态、分化、扩增、对刺激的代谢反应W及基因蛋白质表达 等方面均与其在体内的状态存在着很大的不同，许多在肿瘤组织中存在的基因突变，在肿 瘤细胞系中并不存在。2D培养也缺乏肿瘤细胞生存的微环境，而肿瘤细胞生长的微环境对 其生物性状和信号传导途径均有巨大的影响，即使是原代肿瘤细胞的2D培养也不能真实 再现运种相互影响，无法提供与活体肿瘤组织更接近的类器官和新鲜肿瘤组织3D培养所 能提供的强大信息。此外，微环境中的基质成分、血管系统、各类生长因子、免疫刺激因子和 免疫细胞等对细胞的生物性状和抗肿瘤药物的敏感性和耐受性也有很大的影响。而目前使 用的动物评价体系，由于与人类存在着较大的种属差异，也不能完全反映药物在人体内的 代谢过程、药效作用和毒副作用。因此，许多在临床前评价中具有潜力的药物，在临床试验 时却失败了，证明了目前使用的体内外评价体系并不能很好地预测药物在人体内的有效性 和安全隐患。建立能更好地模拟人肿瘤组织的3D培养方法是抗肿瘤药物发展的迫切需求。
[0006] 不同肿瘤患者对不同化疗药物的敏感性存在着差异，即使是同一种抗肿瘤药物， 在不同的肿瘤患者个体身上也表现出不同的治疗效果和预后。出现运种情况的主要原因与 复杂的肿瘤异质性及肿瘤细胞和微环境的相互作用有关，因此，提供有针对性的精确化诊 疗已成为肿瘤治疗的发展方向。但目前辅助精确化诊疗实施的主要方法是基因测序和生物 分子的标记；临床上虽已开展了个体化的药物评价实验，但使用的方法主要是从患者肿瘤 组织分离的肿瘤细胞的2D培养和人肿瘤组织在裸鼠体内的评价体系（PDX)，不仅存在着上 述问题，而且耗时、费力，影响对患者采取及时有针对性的治疗措施。
【发明内容】
[0007] 本发明主要解决的技术问题是提供一种卵巢癌癌组织3D培养方法及其在药效评 价中的应用，有望解决目前常规的抗肿瘤药物的评价方法中存在着种属差异对评价结果的 影响、不能准确反应药效、评价时间太长等问题。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种卵巢癌癌组织3D 培养方法，包括步骤为：（〇向孔板中滴加Matrigel胶，室溫或C〇2培养箱内静置使所述 Matrigel胶凝固； (2) 将浸于第一培养液中的肿瘤组织块移至凝固后的所述Matrigel胶上，再向所述肿 瘤组织块上滴加Matrigel胶，室溫或C〇2培养箱内静置使所述Matrigel胶凝固； (3) 向步骤（1)的孔板中加入第二培养液进行培养，再取出培养后的所述肿瘤组织块并 固定，其中所述第二培养液包括的组分有高糖DMEM培养液、F12培养液、表皮细胞生长因子 EGF、成纤维细胞生长因子FGF和10X成。
[0009] 在本发明一个较佳实施例中，步骤（1)和步骤（2)中所述Matrigel胶是用DMEM稀 释的，所述DMEM与所述Matrigel胶的体积比为1:1-1: 5。
[0010] 在本发明一个较佳实施例中，步骤（1)和步骤（2)中所述每次滴加稀释后的 Matrigel胶的量为 10-50yL。
[0011] 在本发明一个较佳实施例中，步骤（2)中所述肿瘤组织块的大小为0.5-1mm3,所 述肿瘤组织块先用缓冲液洗涂后再浸于DMEM培养液中，所述肿瘤组织块的制作过程在碎 冰上进行。
[0012] 在本发明一个较佳实施例中，步骤（3)中所述第二培养液是将所述高糖DMEM培养 液、所述F12培养液、所述10XNz按体积比为34:11:5进行混合，形成混合液，所述混合液 再与所述表皮细胞生长因子EGF、所述成纤维细胞生长因子FGF按照体积比为500:1:1进行 混合得到所述第二培养液。
[0013] 在本发明一个较佳实施例中，步骤（3)中所述培养时间分别为24h、48h和72h， 终止培养后将所述肿瘤组织块从所述第二培养液里取出，固定于质量百分比为10%的中性 福尔马林固定液或质量百分比为4%的多聚甲醒固定液中。
[0014] 在本发明一个较佳实施例中，步骤（3)中还包括对固定的所述肿瘤组织块进行石 蜡包埋、切片、肥染色和Ki67免疫组化染色，观察卵巢癌组织结构和细胞形态的变化。
[0015] 在本发明一个较佳实施例中，步骤（3)中还包括向所述第二培养液中加入化疗药 物，继续培养24h、48h和72h，然后将所述肿瘤组织块从所述第二培养液里取出，固定于 质量百分比为10%的中性福尔马林固定液或质量百分比为4%的多聚甲醒固定液中，再对 固定的所述肿瘤组织块进行石蜡包埋、切片、染色，观察肿瘤组织组织结构和细胞形态的变 化，计数细胞核崎变数，计算核崎变率，分析核崎变率作为抗肿瘤药物药效评价方法和指标 的可行性。
[0016] 在本发明一个较佳实施例中，所述染色为肥染色或Ki67免疫组化染色。
[0017] 本发明的有益效果是：本发明所建立的人卵巢癌组织的3D培养方法，能更快、更 准确地评价抗肿瘤药物的药效结果，能弥补2D细胞培养和动物实验评价技术的薄弱环节， 有望促进我国创新性抗癌药物的研发和精确化治疗的进程。
【附图说明】
[0018] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据运些附图获得其它 的附图，其中： 图1是本发明中卵巢癌组织在培养0天(A)U天（B)、2天（C)、3天（D) 时的组织结构和细胞形状，图中所示是肥染色结果，放大倍数为400X; 图2是本发明中卵巢癌组织在培养时同时加入多西他赛胶束，继续培养1 天（A)、2天（B)、3天（C)时的组织结构和细胞形状的变化，图中所示是肥染色结果，放 大倍数为400X; 图3是本发明中卵巢癌组织在培养0天(A)U天（B)、2天（C)、3天（D) 时的组织结构和细胞形状，图中所示是Ki67免疫组化染色结果，放大倍数为400X; 图4是本发明中卵巢癌组织在培养时同时加入多西他赛胶束，继续培养1 天(A)、2天（B)、3天（C)时的组织结构和细胞形状的变化，图中所示是Ki67染色结果， 放大倍数为400X; 图5是本发明中卵巢癌组织在培养时同时加入多西他赛胶束，然后培养0 天、1天、2天、3天时细胞核发生崎变的比率(百分比)，图中所示是对Ki67染色的计数 统计结果。
【具体实施方式】
[0019] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范 围。 I；0020] 实施例一； 提供一种卵巢癌癌组织3D培养方法，包括步骤为： (1) 肿瘤组织块的制作 取肿瘤组织，采用眼科手术器械将其剪切成0. 5-1mm3的组织块，用憐酸盐缓冲液 (1XPBS)洗涂后浸于DMEM培养液中置冰上备用； (2) 肿瘤组织块培养 取6孔板、24孔板或96孔板，沿底边局部滴加10-50yL稀释后（与DMEM的稀释比例 为1:1-1:5)的Matrigel胶，室溫或C〇2培养箱中放置10-30min,小屯、将组织块移至此凝 固的Matrigel上，再在组织块上滴加10-50yL稀释后(与DMEM的稀释比例为1:1-1:5)的 Matrigel胶，置C〇2培养箱中静置20-30min。 阳02U 取出孔板，小屯、加入0. 4血培养液至24孔板、0. 1血至96孔板或2. 5血至6孔 板进行培养，所述培养液的成份如下表所示，表中是100mL培养液中所含的各种成份