一种在体外筛选药物的方法
【专利摘要】本发明提供了一种在体外筛选药物的方法，该方法包括如下步骤：（a）将急性分离的动物心脏置于传感器上并分别施用候选药物；（b）通过所述传感器测定心脏的动作电位的变化；（c）比较心脏的动作电位的变化，依据动作电位的变化选择候选药物；其中，所述传感器包括传感元件和参比电极，所述传感元件包括基板以及固定于该基板上的源电极和漏电极，且源电极和漏电极之间电连接有石墨烯膜，石墨烯膜与基板之间具有空腔。通过上述技术方案，本发明大幅度地提高了传感器中的石墨烯的电导率，并进而提高了体外筛选药物的效率。
【专利说明】一种在体外筛选药物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物仪器工程领域，具体地，涉及一种在体外筛选药物的方法。
【背景技术】
[0002]场效应晶体管是一种通过电场效应控制电流的电子元件，具有栅极(gate)，源极(source)和漏极(drain)三个端子，通过施加于栅极的电压所产生的电场来控制连接源极和漏极的沟道中流通的电流大小。传统场效应晶体管的沟道由重掺杂的硅构成。
[0003]随着纳米科技的发展，各种新型的低维纳米材料，例如硅纳米线(SiNW)，碳纳米管(CNT),石墨烯(graphene)等，以其独特的性质(表面效应,体积效应和量子尺寸效应等)引起了人们广泛的关注。和传统材料相比，纳米材料具有更小的尺寸，更高的比表面积，更加优良的电学性质，更好的生物相容性等。当传统场效应晶体管的沟道由纳米材料来替代，即构成了纳米材料场效应晶体管，例如硅纳米线场效应晶体管(SiNW-场效应晶体管)，碳纳米管场效应晶体管(CNT-场效应晶体管)，石墨烯场效应晶体管(Gra-场效应晶体管)等。
[0004]石墨烯是一种新兴的碳纳米材料，具有电导率高、机械强度大，电化学稳定等优异的物理化学性能，使其在高灵敏度检测领域具有独特的应用优势，引起了人们极大的关注。石墨烯是单层原子构成的平面二维晶体，每个原子都在表面上，外界环境的变化都将直接影响构成石墨烯的所有碳原子，使其对界面的响应极其灵敏，同时独特的结构使其具有出色的检测灵敏性。目前已开发的基于石墨烯的高灵敏一氧化氮(NO)气体检测芯片，具有单个NO分子的高探测灵敏度，表明石墨烯作为检测芯片敏感元件具有巨大的潜力。
[0005]每个原子都在表面上这一特性虽然赋予了石墨烯对外界环境的变化的高检测灵敏性，但常规传感器制作方法中需将石墨烯转移到起支撑作用的基底材料上，不可避免的造成基底材料对石墨烯的掺杂，降低了石墨烯中载流子的迁移率，严重影响了传感器的检测灵敏度。如果将传感器用于体外筛选药物，则会由于较低的检测灵敏度导致体外筛选药物的效率较低。
【发明内容】
[0006]为了进一步提高体外筛选药物的效率，本发明提供了一种在体外筛选药物的方法。
[0007]本发明的发明人发现将石墨烯脱离基底、制成成悬空状的石墨烯传感元件，能够使其避免与基底材料的紧密接触而被掺杂，能够进一步提高传感器的灵敏度，并进而能够提高体外筛选药物的效率，由此得到了本发明。
[0008]为了实现上述目的，本发明提供了一种在体外筛选药物的方法，该方法包括如下步骤:(a)将急性分离的动物心脏置于传感器上并分别施用候选药物；(b)通过所述传感器测定心脏的动作电位的变化；(C)比较心脏的动作电位的变化，依据动作电位的变化选择候选药物；其中，所述传感器包括传感元件和参比电极，所述传感元件包括基板以及固定于该基板上的源电极和漏电极，且源电极和漏电极之间电连接有石墨烯膜，石墨烯膜与基板之间具有空腔。
[0009]通过上述技术方案，本发明大幅度地提高了传感器中的石墨烯的电导率，并进而提高了体外筛选药物的效率。
[0010]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的【具体实施方式】一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0012]图1是在基板上附着石墨烯膜过程的示意图。
[0013]图2是在形成本发明的传感元件的过程的示意图。
[0014]图3是附着了石墨烯膜的基板的示意图。
[0015]图4是用光刻胶掩蔽了的基板的不意图。
[0016]图5是曝光显影后的基板的示意图，显示了形成电极的区域。
[0017]图6是形成了电极的基板的示意图。
[0018]图7是去除了光刻胶的基板的示意图。
[0019]图8是设置了储液池并在储液池中注入了液体的示意图。
[0020]图9是在储液池中用氢氟酸进行了适当的蚀刻之后的基板的示意图。
[0021]图10是去除了储液池和储液池中的液体后，本发明的传感元件的示意图。
[0022]图11是带有储液池的本发明的传感元件的示意图。
[0023]图12是传感元件的扫描电镜照片。
[0024]图13是传感器的示意图。
[0025]图14是用氢氟酸进行蚀刻前后传感元件电导率G随参比电极电压Vgate的变化关系结果图。
[0026]图15是传感元件中的电流随着液体样本的pH值不同而改变的关系结果图。
[0027]图16是传感元件在测量细胞膜电位中的应用的示意图。
[0028]图17是传感元件与被测量细胞或心脏的生物膜形成紧密接触的示意图。
[0029]图18a是传感器在测量小鼠心脏动作电位中的应用的示例性照片。
[0030]图18b是小鼠心脏置于传感器表面的示例性照片。
[0031]图19是用氢氟酸进行蚀刻前后传感元件检测到的小鼠心脏动作电位变化的结果图。
[0032]图20是给予盐酸异丙肾上腺素后传感器测量到的小鼠心脏动作电位发放频率变化中的应用示例。
[0033]附图标记说明
[0034]I石墨烯膜2基板的面层3基板的基层
[0035]4光刻胶5形成源电极的区域
[0036]6形成漏电极的区域7源电极8漏电极
[0037]9形成储液池的侧壁10空腔
【具体实施方式】
[0038]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0039]本发明提供了一种在体外筛选药物的方法，该方法包括如下步骤:(a)将多个急性分离的动物心脏各自置于传感器上并分别施用候选药物；(b)通过所述传感器测定心脏的动作电位的变化；(C)比较心脏的动作电位的变化，依据动作电位的变化选择候选药物；其中，所述传感器包括传感元件和参比电极，所述传感元件包括基板以及固定于该基板上的源电极和漏电极，且源电极和漏电极之间电连接有石墨烯膜，石墨烯膜与基板之间具有空腔。
[0040]其中，所述传感元件可以作为场效应管化学生物传感器的元件。
[0041]优选情况下，所述传感元件通过包括如下步骤的方法制得:(1)在基板上附着石墨烯膜；(2)在附着了石墨烯膜的基板上形成电极，所述电极包括源电极和漏电极，且在源电极和石墨烯膜之间以及在漏电极和石墨烯膜之间形成电连接；(3)使石墨烯膜下的基板的表面变低，以使石墨烯膜下的基板的表面与石墨烯膜分离，形成空腔；且使源电极和漏电极固定在基板上。
[0042]其中，所述石墨烯膜可以为各种常规使用的石墨烯膜，例如为通过化学气相沉淀的方法得到的石墨烯膜，也可以为通过机械剥离的方法得到的石墨烯膜。
[0043]其中，在基板上附着石墨烯膜的操作可以通过将石墨烯膜在基板上按压的方式实现。
[0044]其中，优选情况下，参照文献(LiXS, Cai ffff, An JH, et al.Large-areasynthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils.Science, 2009, 324:1312 - 1314)的方法，在铜基底上通过化学气相沉淀的方法生长石墨烯；然后在生长有石墨烯的铜基底上涂覆一层光刻胶；再将将涂覆有光刻胶且生长有石墨烯的铜基底与铜刻蚀液(例如三氯化铁和盐酸的混合溶液)中刻蚀；刻蚀完全后，将剩下的附着有石墨烯的光刻胶贴附于基板上并按压；然后溶解除去光刻胶，保留石墨烯膜在基板上，即得到附着有石墨烯膜的基板。
[0045]其中，可以基于干涉效应在光学显微镜下对基板上的石墨烯膜进行定位并标记其边界，还可以利用拉曼光谱对其层数进行进一步鉴定。
[0046]根据本发明的方法，其中，优选情况下，步骤(I)中，基板包括基层和附着在基层上的面层，且将石墨烯膜附着在基板的面层上；基层为硅片，面层为二氧化硅层。在该优选情况下，基板可以直接通过将硅片进行氧化的方式制备，还易于进行基于干涉效应在光学显微镜下对基板上的石墨烯膜进行定位并标记其边界，并且面层可以直接通过二氧化硅蚀刻液(如氢氟酸)的蚀刻而形成空腔。
[0047]根据本发明的方法，其中，优选情况下，步骤(2)中，在基板上形成源电极的基板区域包括被石墨烯膜覆盖的区域和未被石墨烯膜覆盖的区域；在基板上形成源电极的基板区域包括被石墨烯膜覆盖的区域和未被石墨烯膜覆盖的区域；源电极和漏电极之间的距离为500-5000nm，优选为 750_4000nm，更优选为 1000_3000nm。
[0048]其中，优选情况下，在基板上形成电极的基板区域中，被石墨烯膜覆盖的区域和未被石墨烯膜覆盖的区域的面积比为0.3-1.7:1，优选为0.5-1.5:1，更优选为0.8-1.2:1。
[0049]其中，在基板上，被石墨烯膜覆盖的区域可以通过光学显微镜观察来确定其边界并定位。在石墨烯膜覆盖的区域的边界处可以选择包括被石墨烯膜覆盖的区域和未被石墨烯膜覆盖的区域作为在基板上形成源电极的基板区域。选定在基板上形成电极的基板区域后，可以通过常规的光蚀刻的方式暴露形成电极的基板区域而掩蔽不形成电极的基板区域，然后通过热蒸镀或离子束蒸镀来形成电极。还可以在形成电极后去除掩蔽物。其中，源电极和漏电极可以为场效应化学生物传感器领域中常规使用的电极，例如可以为通过热蒸镀或离子束蒸镀得到的金属电极，金属电极的材料可以为钼、金和铬中的至少一种，电极的厚度可以为0.03 μ m-0.15 μ m。源电极和漏电极与基板之间设置有用于固定的连接。例如通过热蒸镀或离子束蒸镀得到的金属电极，由于形成电极的区域包括了被石墨烯膜覆盖的区域和未被石墨烯膜覆盖的区域，一方面被石墨烯膜覆盖的区域形成了电极与石墨烯膜之间的电链接，另一方面未被石墨烯膜覆盖的区域形成了电极与基板之间用于固定的连接。
[0050]根据本发明的方法，其中，优选情况下，步骤(3)中，通过将二氧化硅蚀刻液与基板接触的方式使得石墨烯膜下的基板的表面变低，且二氧化硅蚀刻液与基板接触的条件使得源电极和漏电极下的面层不被全部腐蚀。其中，二氧化硅蚀刻液为浓度21-22重量％的氢氟酸。其中，可以使用耐二氧化硅蚀刻液的惰性材料(如聚二甲基硅氧烷，PDMS)在基板上形成储液池，以容纳二氧化硅蚀刻液。该储液池还可以用于容纳洗涤液，以中止二氧化硅蚀刻液的作用，或者洗涤残留的二氧化硅蚀刻液。
[0051]根据本发明的方法，其中，作为一种非常优选的实施方式，步骤(I)中，基板包括基层和附着在基层上的面层，且将石墨烯膜附着在基板的面层上；基层为硅片，面层为二氧化硅层，且厚度为275-300nm并且大于空腔的高度；步骤(2)中，在基板上形成源电极的基板区域包括被石墨烯膜覆盖的区域和未被石墨烯膜覆盖的区域；在基板上形成源电极的基板区域包括被石墨烯膜覆盖的区域和未被石墨烯膜覆盖的区域；源电极和漏电极之间的距离为500-5000nm，优选为750-4000nm，更优选为1000-3000nm ;通过蒸镀的方式，在待形成源电极的基板区域上形成电极；步骤(3)中，通过将二氧化硅蚀刻液与基板接触的方式使得石墨烯膜下的基板的表面变低，且二氧化硅蚀刻液与基板接触的条件使得源电极和漏电极下的面层不被全部腐蚀；二氧化硅蚀刻液为浓度21-22重量％的氢氟酸；通过控制氢氟酸与基板接触的时间，使得空腔的底面积为石墨烯膜的面积的70-99%，优选为75-95%，更优选为80-90%，并且使得源电极和漏电极下的面层不被全部腐蚀。通常情况下，可以用浓度21-22重量％的氢氟酸浸泡石墨烯膜1-10分钟，氢氟酸渗入石墨烯膜下并蚀刻二氧化硅形成空腔。石墨烯膜部分悬浮在基板上方。
[0052]其中，所述基板可以为传感仪器领域中的常规使用的各种电性绝缘材料的基板，例如具有热氧化S12层的硅基板、二氧化硅基板、氮化硅基板、碳化硅基板、硅酸盐玻璃基板、云母基板及有机高分子基板中的至少一种。其中，基板的大小、厚度和形状也可以为常规的选择。例如，基板可以长4-7cm,宽3-6cm,厚0.1-0.3cm的方片形基板。
[0053]其中，所述石墨烯膜可以为各种常规使用的石墨烯膜，例如为通过化学气相沉淀的方法得到的石墨烯膜，也可以为通过机械剥离的方法得到的石墨烯膜。
[0054]根据本发明的方法，其中，空腔的高度可以为100-280nm，优选为120_260nm，更优选为140-240nm。其中，本发明中，空腔的高度是指石墨烯膜与基板之间的距离。
[0055]根据本发明的方法，其中，空腔的底面积可以为石墨烯膜的面积的70-99%，优选为75-95%，更优选为80-90%。其中，空腔的底面积是指空腔在与石墨烯膜表面平行的平面上的投影面积。
[0056]其中，源电极和漏电极之间的距离可以为500-5000nm，优选为750_4000nm，更优选为1000-3000nm。其中，源电极和漏电极之间的距离是指相邻的源电极和漏电极之间最接近的两点之间的距离。其中，源电极和漏电极可以为场效应化学生物传感器领域中常规使用的电极，例如可以为通过热蒸镀或离子束蒸镀得到的金属电极，金属电极的材料可以为钼、金和铬中的至少一种，电极的厚度可以为30nm-150nm。源电极和漏电极与基板之间设置有用于固定的连接。
[0057]根据本发明的方法，其中，急性分离的动物心脏可以具有窦房结，可以在体外维持搏动。例如，可以参照文献(Dhein S，Mohr Fff, Delmar M.Practical Methods inCard1vascular Research.Springer:New York, 2005, 424一445.)中的方法急性分离动物心脏。所述动物可以为常规的实验动物，如两栖动物、鸟类或哺乳动物；包括但不限于蟾蜍、鸡、小鼠、大鼠、犬、兔和猴。
[0058]根据本发明的方法，其中，源电极和漏电极之间的电压可以为10_70mV，优选为30-60mV。
[0059]根据本发明的方法，其中，可以使用参考药物进行校准。如果动作电位的峰值和/或频率在施用候选药物前后的变化大，则指示候选药物具有较强的药效；如果动作电位的峰值和/或频率在施用候选药物前后的变化小，则指示候选药物有较弱的药效。依据动作电位的变化选择候选药物可以参照本领域常规的方法进行，例如文献(C ο h e ηY,Lindenbaum A, Midol-Monnet P,Porquet D, Wepierre J.Beta—adrenoceptor blockingdrugs and isoprenaline: central effects on card1vascular parameters.Br JPharmacol, 1979，65:389 - 394)中提到的方法。
[0060]以下将通过实施例对本发明进行详细描述。下面通过实施例对本发明进行进一步说明。以下实施例中，扫描电子显微镜购自日本日立公司型号S-4800。电学性质的测试仪为购自美国AXON公司型号Axopatch200B电学测试系统。所用试剂均为商购的分析纯试剂。
[0061]制备实施例1
[0062]参考图1-11，本实施例用来说明根据本发明的方法中制备传感元件的步骤，即制备悬浮石墨烯场效应器件的步骤。
[0063](I)参考图 1，按照文献(Li X S，Cai W W，An J H, et al.Large-areasynthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils.Science, 2009, 324:1312 - 1314)中的方法通过化学气相沉淀的方法在铜基底(大小为4cmX8cm,厚度为100 μ m)上生长石墨稀。在有石墨稀的铜片上旋涂一层300nm厚的光刻胶(PMMA950K，购自德国ALLRESIST公司)，120°C下烘烤使溶剂完全挥发；将旋涂有光刻胶的铜片放入铜刻蚀液(含lmol/L三氯化铁和lmol/L盐酸的溶液)中刻蚀至铜反应完全；得到附着在光刻胶上的石墨烯膜。
[0064](2)参考图3，将具有280nm热氧化S12的硅片(大小为3cmX 3cm，厚度为0.52cm，购自美国sillicon Valley Microelectrics)作为基板，即基层为娃片，面层为二氧化娃层的基板。将附着在光刻胶上的石墨烯膜转移到基板上，并按压使石墨烯膜与基板紧密接触；然后通过光刻胶溶解液(丙酮)将石墨烯膜表面的光刻胶溶解掉，保留石墨烯膜在基板上，得到附着有石墨烯膜的基板。基于干涉效应在光学显微镜下予以定位并标记边界，以用于确定形成电极的区域。
[0065](3)参考图4和图5，在附着有石墨烯膜的基板上形成源电极和漏电极。具体地，在附着有石墨烯膜的基板表面旋凃一层300nm厚的光刻胶(PMMA950K，购自德国ALLRESIST公司)，180°C下烘烤至溶剂挥发完全。根据光学显微镜下标记的石墨烯膜的边界，确定形成电极的区域，形成电极(宽度为2μπι的条形电极)的区域中被石墨烯膜覆盖的区域和未被石墨烯膜覆盖的区域的面积比为1:1，用电子束曝光机对形成电极的区域进行曝光，在显影液(4-甲基-2-戊酮和异丙醇按1:5的体积比混合的混合液)中显影lOmin，异丙醇中定影1min后用氮气吹干；由此暴露形成电极的基板区域而掩蔽不形成电极的基板区域。
[0066]参考图6，在高真空条件下，按照文献(《薄膜制备技术基础》，麻蒔立男(日本)著，陈国荣译，化学工业出版社，2009)中的方法，利用电子束蒸镀机在样品(即暴露形成电极的基板区域而掩蔽不形成电极的基板区域的基板)上依次蒸镀5nm厚的Cr和50nm厚Au,获得电极，分别作为源电极和漏电极待用。
[0067]参考图7，去除蒸镀好电极的样品上的光刻胶，被石墨烯膜覆盖的区域形成了电极与石墨烯膜之间的电链接，未被石墨烯膜覆盖的区域形成了电极与基板之间用于固定的连接，源电极和漏电极之间的距离为2000nm。
[0068](4)参考图8-11，在形成了电极的基板上，以设置有石墨烯膜和电极的基板面为底面，用PDMS围成侧壁以形成储液池(大小为1.5cmX 1.5cm，深度为0.8cm),以使当该储液池封存液体时，石墨烯膜完全浸泡于液体中。在储液池中加入二氧化硅蚀刻液(浓度22重量％的氢氟酸)，浸泡石墨烯膜5min，氢氟酸渗入石墨烯膜下并蚀刻二氧化硅形成空腔。在光学显微镜观察测得空腔的底面积为石墨烯膜的面积的90%。
[0069]结构基本上如图10所示的元件即为本实施例制备的传感元件。利用扫描电镜观察其微观结构，如图12所示:虚线方框内为石墨烯(Graphene)，两侧为源漏电极，材料为铬金(Cr/Au)。可见石墨烯在两侧铬金电极的支撑下呈悬空状，离开基底约200nm的距离。
[0070]对比例I
[0071]按照实施例1的方法制备传感元件，不同的是，不使用二氧化硅蚀刻液进行蚀刻，即得到不具有空腔的传感元件。
[0072]测试实施例1
[0073]本实施例用来说明传感元件(S卩，悬浮石墨烯场效应器件)的电学性能。
[0074]参考图13，使用制备实施例1制备的传感元件，将石墨烯两端的两个Cr/Au电极分别作为源极和漏极，Ag/AgCl电极作为参比电极(即，溶液栅电极(Vgate))，从而组装成为传感器。
[0075]将漏极接地，在源极上加固定的电压Vsd (0.01-0.1V)，测量源极和漏极之间的电导G随栅极电压Vgate的变化关系，以表征石墨烯的电子输运性质。如图14所示:未悬浮石墨烯的传感元件(即对比例I的传感元件)中，G-Vg曲线的空穴支和电子支明显不对称，狄拉克点相对本征的石墨烯在Vgate轴上出现了平移,表明石墨烯受到其贴覆的Si/Si02基底的掺杂影响；石墨烯悬浮的传感元件(即实施例1的传感元件)中，测得其G-Vg (是一条关于纵轴对称的曲线，对称轴过狄拉克点，近似于本证石墨烯的G-Vg曲线，电导相对于悬浮如有很大的提闻。
[0076]测试实施例2
[0077]本实施例用来说明传感元件(S卩，悬浮石墨烯场效应器件)的电学性能和在测量溶液中化学物质的变化中的应用。
[0078]参考图13，使用制备实施例1制备的传感元件，将石墨烯两端的两个Cr/Au电极分别作为源极和漏极，Ag/AgCl电极作为参比电极(即，溶液栅电极(Vgate))，从而组装成为传感器。
[0079]通过溶液中的参比电极Ag/AgCl施加电压，同时在源极和漏极(Cr/Au电极)之间施加恒定的通道电压。向储液池中加入样本溶液，样本溶液中带电离子浓度及种类的变化会通过改变石墨烯表面的电荷浓度，从而改变了石墨烯场效应管的电流。通过检测石墨烯电流的变化，可以检测到溶液中化学物质的变化。
[0080]基于上述检测原理，将悬浮石墨烯场效应器件用于检测溶液pH的变化。向储液池中依此加入不同pH值(pH分别为6、7、8和9)的pH值校准液(购自美国Sigma公司)，由于不同PH值的待测样本溶液中带电离子浓度及种类的变化会改变石墨烯膜表面的电荷浓度，进而改变了石墨烯场效应管的电流。如图15所示，检测到石墨烯场效应管的电导值发生相应的变化，反应极为迅速且灵敏，不同PH值间变化呈阶梯状。
[0081]实施例1
[0082]如图16所示，通过在石墨烯两端的源极和漏极之间施加恒定的通道电压，在此电压下石墨烯纳米带中产生一个恒定的电流。细胞或组织与器件中石墨烯形成紧密接触后，当细胞的膜电位发生变化时，这个微小的电压对通过铬金电极施加在石墨烯上的电势产生影响，进而使流过石墨烯的电流产生相应的变化，通过检测这一电流变化进而实现对细胞膜上的动作电位变化的测量。
[0083]基于上述检测原理，如图16所示，将悬浮石墨烯场效应器件(即实施例1的传感元件)用于检测心肌细胞膜电位的变化。参照文献(Dhein S，Mohr Fff, Delmar M.PracticalMethods in Card1vascular Research.Springer:New York, 2005, 424-445)中的方法，急性分离的小鼠心脏具有窦房结，能够维持搏动。参考图18，将急性分离的小鼠心脏置于悬浮石墨烯场效应器件储液池中(储液池中具有台式液Tyrode’s Salts Solut1n)。如图19所不，当小鼠心脏与石墨稀器件形成接触后，随着小鼠心脏的搏动，石墨稀场效应管能够记录到对应的小鼠心脏的动作电位变化，相对于石墨烯未悬浮的传感元件(即对比例I的传感元件)，悬浮后检测到的信号幅度大大提升，证明了悬浮石墨烯场效应传感器具有很高的检测灵敏度。
[0084]盐酸异丙肾上腺素是临床上常用强心类药物，能够加快心率。将盐酸异丙肾上腺素作为参考药物，以10μ g/mL的浓度(浓度为储液池中的终浓度)施用于小鼠心脏上，得到小鼠心脏的动作电位发放频率的变化。结果如图20所示，相对于离体小鼠心脏正常的动作电位信号(图20，对照组)，通过灌流系统将含有10μ g/ml异丙肾上腺素的灌流液加入储液池中，作用5min后，可检测到离体心脏的动作电位信号发放明显加快。与异丙肾上腺素加快心率的临床应用效果相一致，证明了悬浮石墨烯场效应传感器能够用于体外筛选药物。
[0085]对比例2
[0086]使用实施例1的方法测定小鼠心脏的动作电位变化，不同的是石墨烯场效应器件为对比例I的不具有空腔的传感元件。结果如图19所示。
[0087]根据实施例1和对比例2的结果的比较，可以看出，本发明大幅度地提高了传感器中的石墨烯的电导率，并进而提高了体外筛选药物的效率。
[0088]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0089]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0090]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【权利要求】
1.一种在体外筛选药物的方法，该方法包括如下步骤: Ca)将急性分离的动物心脏置于传感器上并分别施用候选药物； (b)通过所述传感器测定心脏的动作电位的变化； (C)比较心脏的动作电位的变化，依据动作电位的变化选择候选药物； 其中，所述传感器包括传感元件和参比电极，所述传感元件包括基板以及固定于该基板上的源电极和漏电极，且源电极和漏电极之间电连接有石墨烯膜，石墨烯膜与基板之间具有空腔。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，空腔的高度为100-280nm，优选为120_260nm，更优选为 140-240nm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，空腔的底面积为石墨烯膜的面积的70-99%，优选为75-95%，更优选为80-90% ;源电极和漏电极之间的距离为500_5000nm，优选为750-4000nm,更优选为 1000_3000nm。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述传感元件通过包括如下步骤的方法制得: (1)在基板上附着石墨稀月旲； (2)在附着了石墨烯膜的基板上形成电极，所述电极包括源电极和漏电极，且在源电极和石墨烯膜之间以及在漏电极和石墨烯膜之间形成电连接； (3)使石墨烯膜下的基板的表面变低，以使石墨烯膜下的基板的表面与石墨烯膜分离，形成空腔；且使源电极和漏电极固定在基板上。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(I)中，基板包括基层和附着在基层上的面层，且将石墨烯膜附着在基板的面层上；基层为硅片，面层为二氧化硅层。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤(2)中，在基板上形成电极的基板区域包括被石墨烯膜覆盖的区域和未被石墨烯膜覆盖的区域；源电极和漏电极之间的距离为500-5000nm，优选为 750_4000nm，更优选为 1000_3000nm。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，步骤(3)中，通过将二氧化硅蚀刻液与基板接触的方式使得石墨烯膜下的基板的表面变低，且二氧化硅蚀刻液与基板接触的条件使得源电极和漏电极下的面层不被全部腐蚀。
8.根据权利要求4所述的方法，其中， 步骤(I)中，基板包括基层和附着在基层上的面层，且将石墨烯膜附着在基板的面层上；基层为硅片，面层为二氧化硅层，且厚度为275-300nm并且大于空腔的高度； 步骤(2)中，在基板上形成电极的基板区域包括被石墨烯膜覆盖的区域和未被石墨烯膜覆盖的区域；源电极和漏电极之间的距离为500-5000nm，优选为750_4000nm，更优选为1000-3000nm ;通过蒸镀的方式，在待形成源漏电极的基板区域上形成电极； 步骤(3)中，通过将二氧化硅蚀刻液与基板接触的方式使得石墨烯膜下的基板的表面变低，且二氧化硅蚀刻液与基板接触的条件使得源电极和漏电极下的面层不被全部腐蚀；二氧化硅蚀刻液为浓度21-22重量％的氢氟酸；通过控制氢氟酸与基板接触的时间，使得空腔的底面积为石墨烯膜的面积的70-99%，优选为75-95%，更优选为80_90%，并且使得源电极和漏电极下的面层不被全部腐蚀。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，急性分离的动物心脏具有窦房结。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，源电极和漏电极之间的电压为10-70mV。
【文档编号】G01N27/00GK104237308SQ201310231444
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】侯俊峰, 程增光, 方英 申请人:国家纳米科学中心