供培养的细胞三维生长的底物的制作方法

专利名称：：供培养的细胞三维生长的底物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种含聚合的高内相比乳液聚合物(polyHIPE)的细胞培养底物，该底物适用于装置和使用在现有的细胞培养塑料件中，以便于细胞(典型的为哺乳动物细胞)生长；还涉及该底物于细胞培养系统中的应用，以便于细胞增殖、分化和功能化的分析。
背景技术：
：真核细胞如哺乳动物细胞的培养，已成为一种常规程序，容许细胞进行增殖、分化和功能化的细胞培^件已很明确。典型地，哺乳动物细胞的培养需要一消毒容器，通常该容器由塑料制得(典型的为聚苯乙烯)，成分明确的生长培养基，以及在一些例子中，还需祠细胞和血清，典型的为小牛血清。饲细胞用于提供刺激细胞增殖和/或维持细胞处于未分化状态的信号，并能影响细胞功能。原核细胞的培养，例如细菌细胞，也是成熟技术，并已在许多有重要价值的分子产品生产上应用多年。哺乳动物细胞的培养应用广泛,有众多体外分析和模型要用细胞培养来进行实验和研究；例如在组织工程中细胞的应用；在重组蛋白生产中哺乳动物表达系统的应用和在药物初筛时哺乳动物细胞的应用.组织工程是一门涉及临床和美容外科的许多领域的科学，更具体的，组织工程涉及移植和/或复原和/或修补受损和/或患病的组织以使组织和/或器官恢复正常功能状态。例如，组织工程在皮肤移植供应上十分有用，可用于治疗因擦伤、烧伤、静脉的或糖尿病溃疡引起的组织治疗失败带来的伤口。组织工程需要待移植组织的体外培养，之后该组织用于待修复伤口的手术治疗。在细胞表达系统中生产重组蛋白是以原核细胞表达或真核细^达为^8A的.当蛋白需要后转录修饰的时候后者为首选。真核系统包括哺乳动物细胞的使用，如CH0细胞；昆虫细胞，如甜菜夜蛾；或酵母，如哞酒酵母，毕赤酵母.重组蛋白的大范围生产需要有高标准的质量控制，因为这些蛋白是作为医药品使用的，例如生长激素；l印tin;红细胞生长素；泌乳激素；TNF;白细胞介素；粒细胞集落刺激因子(G-CSF);粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF);睫状神经营养因子(CNTF);心肌营养素-1(CT-1);白血病抑制因子(LIF);抑瘤素M(0SM);干扰素；IFNcc,IFNy。而且，疫苗的Hl,特别是亚单位疫苗(在一成分明确的抗原基础上的疫苗，例如HIV的gpl20)，需要大量纯化蛋白的生产，这些蛋白不含可能导致过敏性反应的抗原.在一些情况下，在一些已分化的和可对表达的多肽进行加工的细胞上生产重组蛋白是很理想的，后转录加工包括前体蛋白的水解和增加或移去化学基团(例如磷酸化、异戊二烯化、葡糖基化、法尼基化(farnesylation))。进一步，在药物初篩中，在进行动物实验之前，也要用哺乳动物细胞来确定一主要治疗剂(例如，小分子激动剂或抑制剂，单克隆抗体，治疗性多肽，核酸适体，小分子干扰RNA(siRNA))是否有效。提供用于培养哺乳动物细胞的改进的细胞培养系统是很有必要的，系统用于提供大量技术上尽可能接近其自然状态的细胞，以^^更能以可靠的方式进行细胞增殖、分化和功能化的分析。细胞培养系统在本领域已众所周知，本领域技术人员已使用多年。典型的细胞培养涉及在消毒条件下，细胞在一个密闭的培养亚中生长成为一单层。最近，细胞培养系统已得到发展，有一些方法使细胞在三维上培养以更加类似于体内建立的环境.例如，WO2003/014334公开了一种体外细胞培养方法，在该方法中提供了一种培养条件，可使前列腺上皮细胞形成十分类似于体内生长的前列腺腺泡的前列腺腺泡类似物。这在抗癌制剂控制前列腺癌细胞的增殖或转移的效率检测上是十分有用的，因为转化的前列腺上皮细胞在细胞培养系统中也同样形成腺泡.进一步，在W000/34454中描述了一种细胞培养物，其中含有被描述为polyHIPE聚合物的微孔聚合材料，该文献内容在此以参考方式全文并入本发明。这些聚合物形成多孔网状结构，这些空泡(孔)彼iM目连以提供细胞粘附与增殖的底物.polyHIPE的形成过程可使空泡体积从75%-97%精确控制。空泡的尺寸从0.1~1000微米变化，相连的连接泡从几微米到IOO微米变化.此外，polyHIPE可与其它组分一起使用以更有利于细胞的增殖和/或分化。因而polyHIPE是在细胞培养系统中可供细胞粘附与增殖的通用底物。12polyHIPE制备过程在本领域已众所周知，在WO2004/005355和W02004/004880中也有公开，这2篇专利文献内容在此以参考方式全文并入本发明.polyHIPE可商业购买得到，它包括油相如单体苯乙烯、二乙烯基苯和表面活性剂，如Span80去水山梨醇油酸酯。另外，polyHIPE聚合时形成的聚合物^Jt变可被单体杂质影响，例如丙烯酸2-乙基己基酯。polyHIPE从乳液开始的聚合过程是从添加催化剂，如二石充酸铵盐开始的，在W000/34454、WO2004/005355和W02004/004880中描述了多种用于polyHIPE的制造过程的条件，例如，苯乙烯浓度可从15%(w/w)~78%(w/w)之间变化；表面活性刑可从14%(w/w)-15%(w/w),丙烯酸2-乙基己基酯的添加可为60%(w/w)-62%(w/w)。此外，这些应用涉及供细胞粘附与生长的单一的细胞支撑物的生产。这些过程合成的polyHIPE的空泡体积于75%~97%之间变化。
发明内容在本发明中我们公开了一种用于形成高内相比乳液聚合物(polyHIPE)的方法，与之前的方法形成的polyHIPE对比时，本发明的polyHIPE具有一些特别良好的特性，适用于常规细胞培养，典型的如哺乳动物细胞培养。使用本方法形成的polyHIPE空泡体积约90%左右，并被进一步处理为薄膜或薄层(例如，采用超薄切片机切)以获得含多层polyHIPE薄片的、适用于现有细胞培养容器的细胞培养底物。polyHIPE也被有机单体和聚合物修饰以获得适用于特别的细胞类型的细胞培养底物。在本发明中所公开的细胞培养系统可用于培养真核细胞和原核细胞，来提供用于产生更接近于体内环境内的细胞的方法，以提供更可靠的细胞培养系统以用于组织工程、重组蛋白生产和药物初筛等。本发明的一方面，提供一种含多层薄片的微孔聚合材料的细胞培养底物，其中微孔聚合材料的空泡体积为88%~92%.空泡体积定义为空泡在材料总体积中的百分数，由母乳液中的液滴百分数决定。在本发明的一个较佳实施例中，所述的空泡体积约90%.我们已经证实空泡体积约90%的微孔聚合物薄膜是一种对细胞生长具有出人意料的13良好效果的出色底物。我们证实了细胞的粘附、增殖和功能化被聚合材料的结构显著影响。与其它不同空泡体积的聚合物(例如95%空泡体积)相比，在90%空泡体积的聚合物上，细胞粘附、增殖都更好，并显示了更强的功能。此外，我们证实了与在传统二维组织培养塑料件上生长的细胞相比，在90%空泡体积聚合物上生长的细胞，其增殖和功能显著提高.在本发明的再一个较佳实施例中，所述的底物包括疏水性弹性体，其浓度为总单体浓度的20%-40%(w/w)。在本发明的一个较佳实施例中，所述的疏水性弹性体浓度为25%~35%(w/w).更佳地，所述的浓度为下述之一26%(w/w);27%(w/w);28%(w/w);29%(w/w);30%(w/w);31%(w/w);32%(w/w);33%(w/w);或34%(w/w)。在本发明的一个较佳实施例中，所述的疏水性弹性体浓度为30%(w/w).在本发明的一个较佳实施例中，所述的弹性体选自下列之一丙烯酸2-乙基己基酯；丙烯酸丁酯和丙烯酸己酯。在本发明的一个较佳实施例中，所述的弹性体为丙烯酸2-乙基己基酯，更佳地，所述的丙烯酸2-乙基己基酯浓度为28%~32%;更佳地，所述的丙沐酸2-乙基己基酯优选为30%左右，在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞培养底物包括乙烯聚合物，更佳地，所述的乙烯聚合物为聚苯乙烯；更佳地，聚苯乙烯包括苯乙烯单体和二乙烯基苯。在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞培养底物中含有表面活性剂.在本发明的一个较佳实施例中，所述的表面活性刑浓度为乳液单体浓度的20%~30%(w/w),更佳地，浓度为24%~26%，最优的浓度为25%左右，在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞培养底物包括多个微孔聚合物材料切片，其中所述的切片厚度为50pm-1000Mm;较佳地，所述的切片厚度为500nm~750[ini;更佳地，所述的切片厚度为100nm-200nm。在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞培养底物包括多个微孔聚合物材料切片，其中所述的切片厚度为50jum~250ym;更佳地，所述的切片厚度约为150在本发明的另一个较佳实施例中，所述的细胞培养底物包括多个微孔聚合物材料切片，其中所述的切片厚度为50nm-150pm;更佳地，所述的切片厚度约为120jam。在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞培养底物切片厚度约300pm,在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞培养底物进一步包括有机单体。在本发明的一个较佳实施例中，所述的有机单体选自下列组分之一曱基丙烯酸正丁基酯、曱基丙烯酸己基酯、丙烯酸环己基酯、曱基丙烯酸环己基酯、丙烯酸苯基酯、甲基丙烯酸苯基酯、3-氯曱基苯乙烯、对氯曱基苯乙烯、对乙酰氧基苯乙烯。在本发明的再一个较佳实施例中，所述的细胞培养底物进一步包括有机聚合物.在本发明的一个较佳实施例中，所述的有机聚合物选自下列组分之一聚曱基丙烯酸丁基酯、聚甲基丙烯酸正己基酯、聚丙烯酸环己基酯、聚曱基丙烯酸环己基酯、聚丙烯酸苯基酯、聚曱基丙烯酸苯基酯、聚3-氯甲基苯乙烯、聚对氯曱基苯乙烯、聚对乙酰l6^笨乙烯。在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞培养底物包括被一覆盖层(coating)修饰过的表面，该覆盖层有利于在表面上粘附的细胞粘附、增殖和/或分化。在本发明的一个较佳实施例中，所述的修饰为提供一蛋白质覆盖层。在本发明的一个较佳实施例中，所述的蛋白覆盖层为下述分子中的最少一种层粘连蛋白、胶原，例如，细胞支持物如Matrigel、纤维连接蛋白、非胶原多肽基质(non-collagenbasedpeptidematrices),非胶原多肽基质的一个例子为PuraMatrix'"。在本发明的另一个较佳实施例中，所述的蛋白质覆盖层包括多聚4M^酸覆盖层，在本发明的一个较佳实施例中，多聚猛酸具有仿蛋白和特别的蛋白的特性，细胞可粘附与生长。多聚氨基酸可以是均聚物或是杂聚物.在细胞培养中有用的多聚氨基酸包括聚L-鸟氨酸和聚L-赖氨酸.蛋白褒盖层技术是众所周知的.例如，可见"动物细胞的培养"(IanFreshneyWiley-Liss1994),在此以参考方式全文并入本发明'在本发明的另一个较佳实施例中，所述的细胞培养底物表面经物理修饰.在本发明的一个较佳实施例中，所述的底物包括经等离子气体修饰的表面.15等离子气体处理细胞培养底物是本领域技术人员熟知的技术,等离子处理可用于改变细胞培养底物表面的物理性质。例如，氨气和氧气可作为等离子气体使用来提高细胞培养产品中的细胞粘附与增殖.该处理过程涉及低压和放射频率带来的周围温度下气态产品的刺激，等离子体包括自由电子和其它亚稳态粒子，与聚合物表面碰撞可打断化学键而对聚合物表面进行修饰.这个过程产生同样可修饰聚合物表面的自由基。本发明另一方面，提供一种含本发明所述的细胞培养底物的细胞培养容器."细胞培养容器"定义为任何适合容纳上述细胞培养底物的容器。典型地，这样的一个容器如培#^;细胞培养瓶或烧瓶或多孔培养板或嵌入式培养板。多孔培养板有6、12、48、96或384个孔等格式，通常与自动加栽和机械处理系统一起使用。典型地，高通量篩选采用指示剂同试刑混合，指示剂经转换或修饰以信号输出。该信号釆用合适的手段测量(例如荧光放射、光学密度或放射性检测)，之后综合分析来自每个孔中的信号，这些孔里含细胞、底物/制刑和指示剂混合物。在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞培养容器含所述的细胞培养底物，所述的细胞培养底物进一步包括细胞和细胞培养基。在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞是真核细胞；更佳地，所述的真核细胞为下列之一哺乳动物细胞、植物细胞、真菌、黏菌。在本发明的一个较佳实施例中，所述的哺乳动物细胞为灵长类细胞；更佳地，所述的灵长类细胞为人类细胞。在本发明的一个较佳实施例中，所述的哺乳动物细胞选自下列之一表皮角质细胞；成纤维细胞(例如皮肤、角膜、肠粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝脏)、上皮细胞(例如角膜、皮肤、肠粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝脏)；神经元胶质细胞或神经细胞；肝细胞或肝星形细胞；间充质细胞；肌肉细胞(心肌细胞或肌管细胞)；肾细胞；血液细胞(如CD"淋巴细胞、CD'+淋巴细胞；胰腺p细胞或内皮细胞).在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞是来自癌组织的细胞系。在本发明的另一个较佳实施例中，所述的哺乳动物细胞是干细胞.在本发明的一个较佳实施例中，所述的干细胞选自下列之一造血干细胞；神经干细胞、骨干细胞、肌肉干细胞；间质干细胞、上皮干细胞(来源于皮肤、胃肠粘膜、肾、膀胱、乳腺、子宫、前列腺、内分泌腺如垂体等器官)；内胚层干细胞(来源于肝脏、胰腺、肺脏和血管等器官)；胚胎干细胞；胚胎生殖细胞；胚胎癌干细胞。在本发明的一个较佳实施例中，所述的胚胎干细胞/胚胎生殖细胞为万能细胞而非全能细胞。在本发明的另一个较佳实施例中，所述的细胞为原核细胞，更佳地，为细菌细胞。在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞或细胞系经基因修饰。在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞培养容器为生物反应器；更佳地，所述的生物反应器为所述细胞类型的增殖、分化和功能化的放大而设计。本发明的一方面，提供一种细胞培养方法，该方法包括步骤i)提供一细胞培养容器，该容器包括a)细胞；b)本发明所述的细胞培养底物；b)足够的供所述的细胞生长的细胞培养基；和ii)提供能促进所述细胞增殖和/或分化和/或功能化的细胞培养条件。在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞为哺乳动物细胞；更佳地，为人类细胞。在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞为肝细胞.在本发明的另一个较佳实施例中，所述的细胞为原核细胞；更佳地，为细菌细胞.如果微生物在本发明的细胞培养方法中使用，它们的生长或培养是以现有技术人员熟悉的方式进行的，这取决于培养物。常规下，微生物生长于液体培养基中，培养基中含碳源(通常为糖的形式)、氮源(通常为有机氮的形式如酵母提取物或盐，如硫酸铵)、微量元素(如铁盐、锰盐、镁盐)，如果合适，通氧时在0匸-100TC下，更佳地，在10iC-60r下加维生素。液体介质的pH值可以保持不变(就是说在培养时期控制pH值)或可以改变。培养可以为批次培养、半批次培养或连续培养。营养元素可以在发酵前供给或半连续供给或连续供给。所得产品可采用本领域技术人员所知的技术从微生物体中分离，例如提取、蒸发、17结晶，或可用盐析和/或层析。为此目的，可事先将微生物尽量分解，在此处理过程中，pH值最好保持在4-12之间，更佳地，保持在6~9之间，最佳为7~8之间。如上所述，和本发明所用相关的培养基含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素、和/或微量元素。首选的碳源为糖、例如单糖、双糖或多糖。碳源的例子如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素，糖也可通过混合物的方式(例如糖精炼过程中产生的糖蜜或其它副产品)加入培养基中。同样，也可以釆用多种碳源混合的方式添加.其它可能的碳源例如油、月旨(如大豆油、葵花子油、花生油和/或椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和/或亚麻酸)、酒精和/或多元醇(如甘油、曱醇和/或乙醇)、和/或有机酸(如醋酸和/或乳酸)。r、〃氮源通常为有机或无机氮化合物或包含这些化合物的原料。氮源的例子如气态或液态的氨，或铵盐(如硫酸按、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵)、硝酸盐、尿素、氨基酸或复合氮源(如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉骨或其它).这些氮源可单独使用或混合使用。无机盐化合物在介质中可以为Ca、Mg、Na、Co、Mo、K、Mn、Zn、Cu或Fe的氯化物、砩酸盐和硫酸盐。无机含硫化合物如硫酸盐、亚硫酸盐、二亚硫酸盐、四亚硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物或是有才;w充化合物如硫醇和疏醇类也可作为硫源用于生产含石危化合物产品，特别是曱喊酸。磷酸，磷酸二氮钾或磷酸氛钾或相应的钠盐可作为磷源.整化剂可加入到培养基中以使金属离子保持溶解状态.特别适合的螯化剂包括邻-间对苯二酚，如儿茶酚，或原儿茶酸和有机酸，如柠檬酸.本发明的再一个方面提供一种筛选制剂的方法，其中所述的制刑可影响细胞的增殖、分化或功能化，该方法的包括以下步骤i)提供细胞培养物，其中最少包括细胞和本发明中的细胞培养底物；ii)添加最少一种待测试刑；和18iii)监测试剂对所述细胞增殖、分化或功能化方面的活性影响.在本发明的一个较佳方法中，所述的细胞为肝细胞。在本发明的一个较佳方法中，所述的筛选方法包括以下步骤整理前述步骤(iii)中所得的活性数据；将这些整理后的数据转换为可分析的形式；从分析后的数据中得到结果，已有大量方法可反映和概括细g达时含时间和空间改变的信息，如荧光蛋白法和基因表达的其它标记法(见Taylor等，Scientist80:322-335,1992)，该文献的公开内容在此以参考方式并入本发明。另外，US5989835和US09/031271公开了光学系统，文献的公开内容在此以参考方式并入本发明。这些系统用于检测细胞中荧光报告分子的分布和行为以大量筛选生物学活性剂。上述专利中公开的系统还描述了一种处理、储存和显示产生的数据的计算机方法。大量试剂的筛选需要准备细胞阵列以操作细胞和监测试剂。阵列装置的例子如标准带6、12、48、96或384孔的多孔板，这些板通常与自动装栽和自动处理系统一起使用。典型地，高通量筛选都与同一种制剂及指示刑相混合，指示剂经转化或修饰后产生信号。信号采用合适的手段测量(例如荧光、光学或放射检测)，之后综合分析来自每个孔中的信号，这些孔里含细胞、底物/试剂和指示刑混合物。术语"试剂"包括任何小分子、抗体、多肽、聚合的多肽、核酸适体、双链RNA或siRM.这些可作为激动剂或抑制剂。小分子抑制剂包括化学治疗剂，在一些疾病例如癌的治疗中十分有用.抗体或免疫球蛋白(Ig)是一类结构类似的蛋白，这些蛋白由两对多肽链组成，一对为轻链l(低分子量)(K或x),另一对为重链h(y、a、n、5和e)，这四M通过S-S键链接在一起。重链H和轻链L上都由抗原结合区，每种Ig分子中的抗原结合区是高度不同的。另外，重链H和轻链L还有稳定区。L链由两个域组成.KU^末端在一给定类型中是同一的并被认为是"稳定"区(c区)。M末端域在各l链中是不同的，用于抗体结合位点。因为其可变性，它被命名为"可变"区(V区).可变区包括形成抗原结合袋的互补决定区或CDR区，抗原结合袋包括H链和L链抗原识别的可变区.单可变区的19产生是可能的，所以把它叫做单链抗体可变结合片段(scFv，s)。如果有用于生产某一单克隆抗体的杂交瘤细胞，本领域的技术人员可采用RT-PCR法从所述的杂交瘤细胞的mRM中分离得到scFv，s。另外，抗生素筛选可用于确定scFv，s的克隆表达。此外，所述的片段为"域抗体片段"，域抗体为抗体的最小结合单位(约13kDa)。此技术的例子公开于US6248516、US6291158、US6127197和EP0368684,在此都以参考方式全文并入本发明。核酸适体是小的、通常稳定的核酸分子，它含一目标分子结合域.US5270163公开了一种确认核酸适体的方法，在此以参考方式并入本发明.核酸适体典型的是寡聚核苷酸，它可以是单链脱氣核苷酸、核苷酸或经修饰的脱氧核苷酸、核苷酸。一个最近的用于特异消除基因功能的技术是通过双链RNA的介入，也称为siRNA,它们进入细胞后使与siRNA分子序列互补的mRNA降解siRNA分子包括两条完整的RNA链(一条正义链和一条反义链)，退火之后形成双链的RNA分子。siRNA分子通常来源于待消除基因的外显子。RNA干涉的机制正被阐明。许多有机体对双链RM采用激活级M应的方式，这促使siRNA的形成.双链RM的存在激活了一种含核糖核酸酶III(RNaseIII)的蛋白组合物，可将双链RM处理成为小片段(siRNA，长度约21~29个核苷酸)并成为核糖核蛋白组合物的一部分。siRNA作为Rnase复合物的引导使与siRNA的反义链互补的mRNA断裂，结果mRM降解。基于siRNA的试剂在确定某个基因在细胞增殖和/或分化中的功能是纟M"价值的.在本发明的再一个方面，提供一种细胞分化过程中的基因确定方法，该方法包括以下步骤i)提供细胞培养物，其最少包括一种细胞和本发明的细胞培养底物；ii)从所述的细胞培养物中的细胞中提^fe酸；iii)所述的提取的核酸排成核酸阵列；和iv)检测指示在所述的核酸阵列上所述的核酸和其结合物结合的信号.在本发明的一个较佳方法中，所述的细胞为肝细胞.更佳地，所述的方法还包括下列这些步骤i)收集所述的核酸与所述的结合物的结合所产生的信号；ii)将收集的信号转换为可进行数据分析的形式；和可选择；iii)提供分析后的数据结果。细胞分化标记和/或细胞转化标记的确认方法包括基于免疫的技术(如用细胞作为免疫原来产生抗血清来产生细胞表面标记或其它类似物)、基于核酸的技术(例如采用cDNA从正常和转化细胞中来进行差异筛选)。同样地，多年前就已知癌细胞会产生多种癌细胞特别抗原，其中一些存在于癌细胞的表面。这些通常被称为癌拒绝抗原，它们来源于被称为癌拒绝抗原前体的大分子多肽。癌拒绝抗原通过HLAiiX免疫系统.免疫系统识别这些分子作为外来物，并自然选择和摧毁细l&^达这些抗原。如果转化细胞逃过监测，就会发展成为癌，已m出在显性癌拒绝抗原基础上的疫苗，该疫苗可为个人提供防止癌细胞形成的预防保护.本发明中的方法提供一种方式来确认癌拒绝抗原和先导链，这在疫苗发育中为病人激活自身的免疫系统来防止癌产生的方面是有用的。本发明还有一方面，就是提供一种在体外从正常细胞中分析癌细胞发育的方法，该方法包括i)制M本发明细胞培养底物的预备物，包括细胞；ii)加入最少一种可诱导细胞转化的制剂；和iii)监测所述的制剂在所述细胞转化中的影响或是无影响。在本发明的一个较佳方法中，所述的细胞为肝细胞，本领域的技术人员都知道，有多种试剂可以将正常细胞转化为带癌细胞的多种特征的转化细胞。这些试剂包括，如病毒、DDA插入刑、致癌基因和端粒酶基因。其中，术语"癌"(cancer)或"癌的"指可自我生长的细胞，自我生长的例子如以细胞快速增殖为特征的一种反常状态或情形。该术语的意思包括所有类型癌的生长或致癌过程、转移组织或恶性转化细胞、组织或器官，其与病理学类型及侵入阶段无关.术语"癌"包括各种器官系统的恶性癌，如肺、乳房、甲状腺、淋巴、胃肠和生殖泌尿道中的，也包括腺癌，腺癌包括恶性癌，如大部分结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或華丸癌、肺的非小细胞癌、小肠癌和食道癌.术语"恶性上皮细胞肿瘤"(carcinoma)已为本领域技术人员所熟知，指的是上皮或内分泌组织的恶性组织，如呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖21系统癌、睾丸癌、乳房癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。恶性上皮细胞肿瘤的例子包括那些从子宫颈、肺、前列腺、乳房、头部和颈部、结肠和卵巢组织中形成的那些肿瘤.术语"恶性上皮细胞肿瘤"也包括癌肉瘤，例如由癌或肉瘤组织形成的恶性肿瘤。"腺癌"(adenocarcino咖)指来源于腺组织的癌或癌细胞形成可识别的腺体结构。术语"恶性毒瘤"(sarcoma)已被本领域技术人员所熟知，指来源于间叶细胞的恶性肿瘤。本发明的再一方面，提供一种形成微孔聚合材料的处理方法，该方法包括i)制备一预备液，其包括高内相比乳液，乳液中包括浓度为20%(w/w)~40%(w/w)的疏水弹性体；ii)制^^化剂的预备液；iii)将(i)和(ii)中的预备液混合；和iv)混合后的预备液孵育以形成高内相比乳液聚合物。在本发明的一个较佳方法中，所述的疏水弹性体浓度为25%(w/w)-35%(w/w);更佳的浓度为30%(w/w).在本发明的一个较佳方法中，所述的疏水弹性体选自下列之一丙烯酸2-乙基己基酯、丙蜂酸正丁基酯、丙烯酸正己基酯.在本发明的一个较佳方法中，步媒(ii)中的预备液加热到501C~801C。在本发明的再一个较佳方法中，步骤(ii)中所述的预备液加热到50TC或60X:或80iC。在本发明的再一个较佳方法中，步骤(i)中所述的预备液含笨乙烯单体。在本发明的再一个较佳方法中，步骤(i)中所述的预备液含二乙烯基苯。在本发明的另外一个较佳实施例中，步蜾(i)中所述的预备液含浓度为20%(w/w)~30%(w/w)的表面活性剂；更佳的浓度为24%(w/w)~26%(w/w);最佳的浓度为25%(w/w)左右，在本发明的一个较佳方法中，步骤(i)中的预备液含60。/。(w/w)苯乙烯；30%(w/w)丙烯酸2-乙基己基酯；10%(w/w)二乙蜂基苯和25%表面活性剂.在本发明的一个较佳方法中，步骤(iv)所述的高内相比聚合物进行切片；更佳地，所述的聚合物切为薄膜或薄层。在本发明的一个较佳方法中，所述的聚合物加工成约50nm~150pm厚的薄膜或薄层；更佳地，所述的薄膜厚约120pm。在本发明的再一个较佳方法中，提供一种采用高内相比乳液聚合物，该聚合物为釆用本发明方法得到的或可以得到的。在本发明的一个较佳实施例中，所述的高内相比乳液聚合物空泡体积约90%。本发明的再一方面，所述的高内相比乳液聚合物用于细胞的培养。在本发明的一个较佳实施例中，高内相比乳液聚合物空泡体积为90%左右；更佳的为90%.本发明的再一方面，提供一种含高内相比乳液聚合物的底物，用于确定试剂的肝脏毒性。在本发明的一个较佳实施例中，所述的试刑为化学治疗剂。在本发明的另一个较佳实施例中，所述的制剂为病毒基因治疗栽体.本发明的再一方面，提供一种测试制剂的肝脏毒性的方法，步骤包括i)提供一种细胞培养物，其最少包括一种肝细胞和权利要求1-31中任一项中所迷的细胞培养底物；ii)加入最少一种待测制剂；和iii)监测该制刑关于所述肝细胞的增殖、分化或功能化方面的活性，作为该制剂的毒性测重。在权利要求83中所述的一个较佳方法中，所述的制剂为化学治疗剂。在本发明的另一个较佳方法中，所述的制剂为病毒基因治疗栽体。本发明的再一方面，提供一种方法，该方法用于角质细胞和/或角质细胞前体干细胞的生长和分化，步骤包括i)形成预备液，预备液中含本发明中的细胞培养底物、成纤维飼细胞和细胞培养基；ii)培养所述的饲细胞，使细胞培养底物充分被饲细I^L盖；iii)角质细胞和/或角质细胞前体干细胞接触所述的覆盖后的底物;和iv)在古*1+&庶&始.知/劣A添細始i汰羊細始AJ^i^^i胞预备液，在本发明的一个较佳方法中，所述的成纤维饲细胞为真皮成纤维细胞.在本发明的另一个较佳方法中，所述的纤维饲细胞选自下列之一角膜成纤维细胞、肠粘膜成纤维细胞。口腔粘膜成纤维细胞、尿道粘膜成纤维细胞或膀胱成纤维细胞.在本发明的再一个较佳方法中，所述的角质细胞为上皮角质细胞。在本发明的一个较佳实施例中，所述的纤维细胞为人类纤维细胞。在本发明的再一个较佳方法中，所述的角质细胞为人类角质细胞。在本发明的一个较佳方法中，所述的预备液进一步含胶原。在本发明的一个较佳方法中，胶原为l型胶原.在本发明的再一个较佳方法中，所述的胶原为胶状。在本发明的另一个较佳方法中，所述的胶原为溶液状。在本发明的再一个较佳方法中，最少将所述的角质细胞转移以接触空气，以便于i秀导角质细胞的层化。在本发明的一个较佳方法中，提供一种用于测试试剂的方法，包括i)制备本发明所述的预备液，预备液中含待测试剂；ii)监测所述制剂对角质细胞生长和/或分化的影响，并与无所述制剂的对照液相比较.本发明的再一方面，提供一种细胞培养设备，该设备包括权利要求1-31任一项中所述的细胞培养底物、细胞培养容器和适于与所述的细胞培养容器配合、并容纳所述细胞培养底物和所述细胞的嵌入物。在本发明的一个较佳实施例中，所述的细胞培养底物包括成纤维细胞和角质细胞.本发明的再一方面，提供本发明中的底物的一种用途,它用于制备分化的皮肤复合物.在本发明书中的描述和权利要求中，术语"包括"和"含"以及类似的词语，意为"包括但不限于"，而非(也没有)将其它部分、添加物、组分、整体(integers)或步骤排除在外.在本发明书中的描述和权利要求中，单数形式的词语也含复数形式的词语，除非文中另有需要。特别是，当使用模糊的词语时，必须理解，该说明复数和单数形式都一样，除非文中另有需要。必须理解，在本发明的某一方面、实施例或例子中描述的特征、整体、特点、化合物、化学基团或官能团可用于任一其它方面、实施例或例子中，除非与之矛盾。附困说明下面结合附困来说明本发明中的实施例，其中，实施例仅作为例子使用图1为一典型的PolyHIPE材料的扫描电镜(SEM)照片，图中的球形空穴为空泡，相连空泡间的洞称为"连接泡"，比例尺-20nm;图2为不同液体温度下制备的PolyHIPE的SEM照片(a)室温；(b)50X:;(c)601C;(d)80匸；比例尺-100nm。图3为水相温度对空泡直径分布的影响，从前到后室温；501C;60X3;困4为采用不同水相温度形成的PolyHIPE的连接泡的大小分布；室温(□);50t:();601C(△);80TC(O);图5为水相添加剂对PolyPIPE的形态影响(a)无添加剂；(b)1.5%(w/v)聚乙二醇PEG(Mn-300);(c)4%(v/v)曱醇;(d)l.5%(v/v)四氩呋响；比例尺-50nm。图6为采用不同水相添加刑制得的PolyPIPE的空泡直径分布区域图；(a)聚乙二醇(从前到后不含聚乙二醇、0.2%、0.4%、0.8%、1.5%);(b)曱醇(从前到后不含曱醇、1%、2%、3%、4%);(c)四氪呋喊(从前到后无四氩呔喃、0.4%、0.8%、1%、1.5%)。PEGMn=300;除了聚乙二醇为w/v，其它所有百分数都为v/v,在每个例子中，水相在乳液制备过程中都处于室温下。图7为采用不同水相添加剂制得的PolyPIPE的连接泡大小分布图a)聚乙二醇(□不含聚乙二醇、厶0.2%、x0.4%、O0.8%、Ol.5%);(b)曱醇(口不含曱醇、Al%、02%、03%、x4%);(c)四氩呋喃(口不含四氩呔喃、00.4%)厶0.8%、xl%、01.5%);PEGMn=300;除了聚乙二醇为w/v,其它所有百分数都为v/v.在每个例子中，水相在乳液制备过程中都处于室温下.图8为水在采用不同液相添加剂制得的PIPE中的自扩散系数(^无添加剂；口1.525%四氢呋喃；厶1.5%聚乙二醇；02%曱醇)。PEGMn=300;除了聚乙二醇为w/v，其它所有百分数都为v/v。在每个例子中，水相在乳液制备过程中都处于室温下.图9为在有水相添加剂情况下，采用不同表面活性剂浓度(Cs)制得的PolyPIPE的SEM照片1.5%四氬呋喊，Cs-20%(a);1.5%四氬吹《*，Cs=30%(b);4%甲醇，Cs=20%(c);4%甲醇，Cs-30%(d);比例尺=50pm.PEGMn-300;除了聚乙二醇为w/v，其它所有百分数都为v/v,在每个例子中，水相在乳液制备过程中都处于室温下.图IO为在有水相添加剂情况下，采用不同表面活性剂浓度(Cs)制得的聚PIPE的空泡直径分布图1.5。/。四氢呋喃(a);4。/。曱醇(b);从前到后Cs=30、25和20%(w/w)PEGMn=300;除了聚乙二醇为w/v,其它所有百分数都为v/v。在每个例子中，水相在乳液制备过程中都处于室温下。图11为在有水相添加剂情况下，采用不同表面活性剂浓度(Cs)制得的聚PIPE的连接孔大小分布图(a)1.5%四氢呋喃；(b)4%甲醇(口Cs-20。/。；ACs=25%;OCs=30%，所有百分数都为v/v),在每个例子中，水相在乳液制备过程中都处于室温下。图12为基于苯乙烯的PolyPIPE骨架的一个应用例，它作为薄膜使用于现有细胞培养容器如多孔板或孔嵌入物中。图13为孔嵌入物原型的光学照片，该嵌入物带120微米厚的、具90%空泡体积的聚苯乙烯骨架。这些例子是为6孔(大嵌入物)培养亚和12孔(小嵌入物)培养亚而设计的嵌入物.图14是SEM照片，它显示了MG63造骨细胞于90%孔体积的聚苯乙烯骨架中体外生长7-28天的情况。这些材料已经调整以便用于如困12中所示的现有的细胞培养塑料件。困15显示了聚合物的制备方法及结构特征影响骨架内细胞的生长(例90%Vs95%空泡体积)。该例子显示了细胞形态如何被影响。MG63造骨细胞的扫描电镜照片在聚苯乙烯骨架上体外培养7天.这些材料为采用90%空泡体积(PV)和95%空泡体积而得.(A)于90%聚合物上生长的造骨细胞(箭头)伸展和显示出众多的板状伪足(箭头)，与加强与相连的细胞的相互作用.(B)然而，于95%聚合物上生长的造骨细胞(箭头)保存圃形并只产生少数的板状伪足(照片放大同样的倍抝.26图16显示了底物的结构如何影响细胞行为。数据显示了在不同类型底物上生长的细胞的增值率的显著不同。请特别注意90%空泡体积和95%空泡体积的聚合物之间的比较这表明了为细胞生长而调整这些骨架的重要性。该图显示了于90%空泡体积(PV)或95%空泡体积聚苯乙烯骨架上，或平坦的、传统的组织培养塑料件(TCP)上生长的MG63造骨细胞的MTT细胞增殖分析数据。每孔中细胞接种重为1x10'。柱代表平均值土标准差，n=3。注意于90%骨架上生长的细胞增值率显著高于TCP和和95%PV材料上的细胞增值率。这些数据也显示细胞在95%PV的骨架上增殖率最小。困17显示了底物的结构如何影响细胞行为。数据显示了在不同类型底物上生长的细胞的增值率的显著不同。请特别注意90%空泡体积和95%空泡体积的聚合物之间的比较。这表明了为细胞生长而调整这些骨架的重要性。该图显示了于90%空泡体积(PV)或95%空泡体积聚苯乙烯骨架上，或平坦的、传统的组织培养塑料件(TCP)上生长的骨髄源干细胞(MSCs)的MTT细胞增殖分析数据。每孔中细胞接种重为1x10'。柱代表平均值土标准差，n-3。这些数据再次表明90y。骨架上生长的细胞增值率显著高于TCP和和95。/。PV材料上的细胞增值率。此外，细胞在95。/。PV的骨架上的细胞增殖率最小.图18显示了与传统二维组织培养塑料件中生长的细胞相比，在三维90%空泡体积的聚苯乙烯骨架上生长的细胞的功能有显著不同。实验测量了在90%空泡体积(PV)的聚苯乙烯骨架上生长的与在传统平面组织培养塑料件(TCP)上生长5-7天的MG63细胞的碱性磷酸酶的水平。每孔中细胞接种重为lxlO'。因细胞数目不同，数值已被标准化，柱代表平均值±标准差，n=3。注意于三维聚苯乙烯上生长的造骨细胞的碱性砩酸酶水平显著高于在平面聚苯乙烯表面上生长的.这些数据表明与生长于传统二维培养塑料件相比，生长于三维骨架上的这些细胞的活性加强了.图19显示了与传统二维组织培养塑料件中生长的细JlM目比，在三维90%空泡体积的聚苯乙烯骨架上生长的细胞的功能有显著不同.实验测重了骨髄源MSCs中的骨钩素水平，在地塞米松谦导下形成骨节。细胞于在90%空泡体积(PV)的聚苯乙烯骨架上生长或在传统平面组织培养塑料件(TCP)上生长1435天.每孔中细胞接种量为lx106.因细胞数目不同，数值已被标准化。柱代表平均值土标准差，n=3,注意于三维聚苯乙烯上生长的分化细胞的骨钙素水平显著高于在平面聚苯乙烯表面上生长的。这些数据再一次表明与生长于传统二维培养塑料件相比，生长于三维骨架上的这些细胞的活性加强了。困20是冯库萨(V0NKossa)染色的光学显微照片，它显示了位于中心的骨节的形成，骨节来源于受地塞米柏"诱导分化的间叶干细胞，这些细胞于90%空泡体积的聚苯乙烯骨架上生长.细胞采用Mayor，s苏木精复染。图21显示了生长底物的结构如何影响细胞的行为。数据举例说明了与传统组织培养塑料件上生长相比，细胞在90%空泡体积聚苯乙烯骨架上生长更有优势.图中显示了培养的HEPG2肝细胞的MTT相比增殖的分析，这些细胞生长于90%空泡体积(PV)聚苯乙烯骨架上或传统的平面组织培养塑料件(TCP)上。每孔中细胞接种量为1x106。因细胞数目不同，数值已被标准化。柱代表平均值土标准差，n-3。注意90%骨架上的细胞增值率显著高于在二维TCP上生长的细胞增值率。困22显示了生长底物的结构如何影响细胞的功能。数据举例说明了与传统组织培养塑料件上生长相比，细胞在90%空泡体积聚苯乙烯骨架上生长更有优势.实验测量了HEPG2肝细胞产生的清蛋白水平。这些肝细胞于在90%空泡体积(PV)的聚苯乙烯骨架上生长或在传统平面组织培养塑料件(TCP)上生长1-28天。每孔中细胞接种量为1x10',因细胞数目不同，数值已被标准化。柱代表平均值土标准差，n=3。注意于三维聚苯乙烯上生长的分化细胞的清蛋白水平显著高于在平面聚苯乙烯表面上生长的.这些数据再一次表明与生长于传统二维培养塑料件相比，生长于三维骨架上的这些细胞的活性加强了.图23显示了生长底物的结构如何影响细胞的功能。在本实施例下，细胞对细胞毒素的抵抗力加强。数据举例说明了与传统組织培养塑料件上生长相比，细胞在90%空泡体积聚苯乙烯骨架上生长更有优势。图显示了于90%空泡体积(PV)聚苯乙烯骨架上，或平坦的、传统的组织培养塑料件(TCP)上生长的HEPG2肝细胞的MTT细胞增殖分析数据，这些细胞都在有(125mM)或无细胞毒素曱氨蝶呤(NDA合成抑制刑)的情况下生长3天.每孔中细胞接种重为1x106.因细胞数目不同，数值已被标准化.柱代表平均值±标准差，n=3.注意于90。/。骨架上生长的细胞增值率显著高于在二维TCP上生长的.这些数据表明生长于骨架上的这些细胞在该生长*下对这种细胞毒素的抗性加强了。图24显示了生长底物的结构如何影响细胞的功能，并进一步说明了与传统组织培养塑料件上生长相比，细胞在90%空泡体积聚苯乙烯骨架上生长的不同.图显示了于90%空泡体积(PV)聚笨乙烯骨架上、或平坦的，传统的组织培养塑料件(TCP)上生长1~3天的HEPG2肝细胞的MTT细胞增殖分析数据。每孔中细胞接种量为1x106。因细胞数目不同，数值已被标准化。柱代表平均值土标准差，n=3。转谷氨耽胺酶是蛋白交联酶，已知它在肝细胞中表达,诱导肝细胞it^细胞凋亡.注意当细胞毒素曱氨蝶呤的浓度增加时，于平面聚苯乙烯表面上生长的肝细胞转谷氨酰胺酶水平显著高于在90%骨架上上生长的。这些数据进一步表明生长于骨架上的这些细胞在该细胞毒素条件下的抗性加强了，这可能是因它们生长于较少逆境的结果，而不象那些在二维单层中生长的细胞。图25的扫描电子显微照片显示了HEPG2肝细胞在二维(A、B)或三维(C-F)聚苯乙烯底物上生长7天(A、C、E)或21天(B、D、F)。与在三维表面(C)上生长的细胞相比，二维表面上生长的肝细胞在结构上显著不同。减少接种密度使在三维骨架(sc)上生长的细胞个体更清楚的显示出来(D)。HepG2细胞;SJl出复杂的三维形状并和附近的细J!M目互作用(D).放大倍数的困片显示在细JJ^面形成了巨大数量的微绒毛(mv)(E、F).与在二维表面生长的细胞(A、B)相比，三维生长的细胞有更大数量的微绒毛。比例尺A-D25n迈；E和F5nm。图26:透射电子显微照片显示了在二维或三维表面上培养21天的H印G2细胞的超微结构细节，(A)二维塑料件上培养的HepG2细胞显示了众多清晰可辨的细胞器，包括细胞核(n)、线粒体(mt)、粗面内质网(rER),微绒毛(mv)和脂滴(ld)。(B、C)在聚苯乙烯骨架(sc)上培养的H印G2细胞生长与聚合物密切配合，如图所示，完全覆盖了材料中的杆.图中表明三维生长的细胞也同样显示出细胞器的排列，如细胞核(n)、线粒体(mt)、粗面内质网(rER),微绒毛(mv)、脂滴(ld)和过氣化物酶体(PC),(D)高放大倍数的显微照片显示了相邻细胞间紧密连接的形成.细胞间的空泡几乎形成一个胆小管(bc)，从中排出微绒毛(mv).比例尺A和B2nm;Clnm;D500nm.图27:在二维(实心柱)或三维(空心柱)聚苯乙烯上培养21天的H印G2细胞的性能'(A)采用MTT分析的细胞生存能力的评价。(B)HepG2细胞向培养基分泌的清蛋白.清蛋白分泌量以每孔蛋白总量为准。在这2种实验中，细胞接种密度为1x107孔。柱代表平均值土标准差，三次重复。显著性表示为"p^.01,釆用曼-惠特尼U检验(MannWhitneyUtest),图28:在二维(实心柱)或三维(空心柱)底物上、并有细胞毒素-甲氨蝶呤(MTX)存在的条件下培养的H印G2细胞的性能.数据显示了采用只有栽体的情况(对照)、或31HMMTX、或125pMMTX培养到IO天.(A)采用MTT分析的细胞生存能力的评价。(B)测量细胞向培养基分泌的清蛋白分泌量以获得HepG2细胞的代谢活力。清蛋白分泌量以每孔蛋白总量为准.(C)细胞伤害度采用转谷氨酖胺酶活来确定。酶水平以每孔蛋白总量为准.在每次实验中(A-C)，细胞接种密度为1x107孔。数据为平均土SEM，三次重复，显著性采用曼-惠特尼U检验表示为"〈0.05、"p<0.05和**"<0.001,图29:扫描电子显微照片显示了曱氨蝶呤(MTX)对HepG2细胞表面结构的影响。图版显示了在二维(A、C、E、G)和三维(B、D、F、H)底物上培养的HepG2细胞，这些细胞采用栽体(对照，无MTX(A,B))、8nM(C,D)、31pM(E，F)或125pM(G，H)MTX处理。注意不管是在二维(A,C)或三维(B、D)底物上，对照组(A、B)和MTX低浓度组(C、D)中的细胞表面上的微绒毛(mv)都是清晰可辨的.在细胞毒素高浓度组中，二维底物上生长的细胞仅有少重微绒毛(E)，且在MTX最高浓度的实验组(F)中，表明其细胞表面结构已被破坏。与"M目比，三维生长的H印G2细胞在MTX含量增加的情况下始^f呆存完整，并展现出众多数量的微绒毛(F，H)。比例尺A-H2nm。困30:甲氨蝶呤(MTX)对HepG2细胞超微结构的影响，图版显示了在二维(A、C、E、G)和三维(B、D、F、H)底物上培养的H印G2细胞，这些细胞采用栽体(对照，无MTX(A,B))、8nM(C，D)、31pM(E,F)或125pM(G,H)MTX处理.对照组的照片显示与生长底物对应的细胞的正常结构(A，B)。在平面组织培养塑料件上及8pMMTX条件下生长的细胞大部分还都具有接近正常的细胞结构，虽有少量死亡的细胞(C，nc).MTX浓度的增加，使在二维底物上生长的细胞绝大部分死亡(E，G)。可以证实核膜解体和在健康细胞中找到细胞器.大空泡体(v)和被称为自噬小体(ap)(E)的膜体不断增加。与iU目比，在125nM浓度MTX^Hf下，三维骨架上生长的HepG2细胞细胞结构保持完整，只有少量死亡细胞(nc)。比例尺A-H2Mm。图31:哺乳动物皮肤上皮细胞的有机共培养示意图。(A)多孔平板(如6孔板)上，三维多孔聚苯乙烯骨架插入孔底部中，皮肤纤维细胞在有或无胶原条件下于三维聚苯乙烯骨架上生长。(B)角质细胞(如HaCaT细胞)接种于皮肤纤维细胞培养物表面.(C)表皮角质细胞暴露于空气使细胞成层，此为采用减少培养基的方法来达到该效果.在三维骨架上生长的细胞易于在不同细胞培养容器间转移，使得用户更容易搮作.图32:三维聚苯乙烯骨架上生长的皮肤纤维细胞的扫描电子显微镜，A为低倍数下，B为高倍数下。箭头所指为细胞层下的骨架.细胞的结构性支撑提高了用户常规培养处理的可操作性.图33:三维条件下，人类角质细胞(HaCaT细胞)与纤维细胞共培养的层化。用于组织学分析，切片，细胞采用苏木精和伊红染色。表l在不同液温和水溶性添加刑条件下制备的polyHIPE的形态学参数；表2在液体添加刑条件下制备的PolyHIPE的空泡和连接孔的平均直径，以及HIPEs'母液的水自扩散系数；和表3表面活性剂对采用液体添加剂制备的PolyHIPE的形态学影响。具体实施例方式制备用于细胞培养中常规使用的生长底物的材料与方法材料二乙烯基苯(Aldrich:80%体积二乙烯基苯，其余为邻-乙基苯乙烯和对乙基苯乙烯，丙烯酸2-乙基己酯(A1drich;99%)和苯乙烯(A1drich;99%),以上材料过活性氧化铝柱(Aldrich;Brock咖nn1)，以去除所有抑制剂(抑制苯乙烯和二乙烯基苯的对叔丁基邻苯二盼，抑制丙烯酸2-乙基己酯的对^Lji酚或对^酚单甲醚).并使用过疏酸钾(Aldrich)、去水山梨糖醇单油酸酯(SPAN80Aldrich)、聚乙二醇(Aldrich，Mn=300)、二水氯化钾(Aldrich).PolyHIPE聚合物的制备和用于细胞培养的薄膜的制备采用高内相比乳液(HIPE)的聚合来制备PolyHIPE泡沫材料，31'油相中含60%苯乙烯，30%丙烯酸2-乙基己酯，10%二乙烯基苯和25%表面活性剂(去水山梨糖醇单油酸酯)(所有百分数为w/w)。-水相中在去离子水中含1%过疏酸钾。方法1、简而言之，将油相置于一个250mL的三颈圓底锥瓶中，瓶中装有一个悬置的搅拌器(具有D形聚四氣乙烯桨的玻璃棒)、一个100mL的压力平衡漏斗(插入于一侧颈)和一个橡皮膜。混合物通氛气净化15分钟。2、水相在搅拌加热板上加热到801C，然后以平稳的速率在2分钟的时间里加入到油相中'之后乳液再进行搅拌。3、乳液转移到一个50ml的聚乙烯管中，60TC过夜。4、24小时后，聚合物从管中取出，然后于在索式提取器中用水及异丙醇各洗24小时.薄膜的制备聚合物加工为120微米厚的薄膜。这可采用超薄切片机来实现，如果需要itf的切片(一直到lmm)，也可用振动切片机。之后聚合物膜用无水酒精灭菌，然后采用梯度酒精溶液浸泡，使用前再用灭菌的磷酸緩沖液(PBS)洗(x3)。薄膜可直接装于现有细胞培养塑料件(如6孔板)的底部，或是贴于细胞培养孔嵌入物中(见困12和13),扫描电子显微镜方法材料的形态学用FEIXL30ESEM分析，扫描电镜搮作电压为20~25kV,材料片置于碳纤維垫上，并附在铝台上，然后用EdwardsPirani501sputtercoater喷金。空泡的平均大小采用图像分析软件ImageJ(NIHi咖ge)计算。这种方法测量的平均直径会低于实际值.所以需要用统计学方法更正1,方法为测重R/r的平均率，其中R为空泡直径的赤道值，r为显微照片中测量的直径值.统计因子从等式(l)中获得.H、R2-r2(1)由于可能W巨中心部分的任何距离(h)进4亍切片，该值和所有h值都一样，所以h值的平均可能值为R/2，将该值代入式(l)中可得R/r-2/(3"2)。增加空泡体积的获得平32均值，可以得到更精确的值。压汞实验压汞试验采用MicromeriticsAutoPorem9402压汞仪进行。水4艮压入和压出接触角为130°。透度计柱体积为1.836mL，球体积为5mL。压入体积为柱体积的45%~80%,PolyHIPE的压入压力未超过200psi''HNMR核磁共振试验水的自扩散系数(D，)采用500MHz的VarianUnityInova500窄柱光谦仪进行，配备Perfcraan梯度脉冲放大器和5咖反向探针.采用基于氘自旋回波的自动z梯度匀场。所有测量温度为25±0.1匸。水自扩散系数采用脉沖序列结合脉冲场梯度(如BPPSTE脉沖梯度)测量.监测磁场梯度幅度的信号衰减，从BPPSTE光详中可得到水的自扩散系数。代入等式(2)中得到实验结果。在等式(2)中，I为从指定的梯度幅度中测得的共振密度，G，1。为无梯度脉沖时的密度，Y为回磁比，5为双极梯度脉冲对的持续时间，厶为扩散延迟时间，T为短梯度回复延迟时间，在此期间他豫和自旋耦合不显著。肝细胞培养人类肝癌细胞系HepG2，来自美国典型培养物收集中心(ATCC)。H印G2细胞于5%C02、371C于培养基中培养(D-MEM培养基，Gibco/BRL)，培养基中加有10%(v/v)胚胎小牛血清(FBS，Gibco/BRL),100pg/mL青審素和10pg/mL链莓素(Gibco/BRL))。细胞每5~7天传代培养。汇合的细胞培养物用PBS清洗，狭岛素/EDTA溶液分离，用血球计计算细胞数目。之后HepG2细胞悬浮液进行平均接种，或直接接种于标准6孔板(Nunc)的孔中，或在6孔板上位于孔内、经改良的孔嵌入物中.培养物在培养基中保留，培养基每3-4天或根据需要更换。活细胞的计算活细胞的计算采用商业可购买得到的比色记分析(Promega)，该比色计基于Mosmann的用于测量细胞活性的独创方法，该方法涉及将四唑盐转换为分光光度计(570nm)可识别的蓝色甲臜(formazan)[32],按厂商说明书的方法对在二维和三维底物上生长的、不同生长M下不同时期的H印G2细胞进行分析。甲^呤(MTX)毒性研究细胞在二维或三维表面接种三分之一，然后使其停留和粘附24小时。之后更换培养基，新的培养基中含不同浓度的MTX(无MTX(仅有栽体，对照组)，8mM、31jhM和125HM)之后细胞孵育l、3、7或10天，然后取样分析细胞数量/活性，并测量清蛋白量及酶量，肝细胞代谢活性清蛋白常用于作为肝细胞代谢活性的指示物。清蛋白的产生量采用可商业购买到的基于现有方法的试剂盒(Bioassaysystems)测量。该方法利用澳甲酚绿与清蛋白的特异结合产生的的颜色，于620nm下分辨。人类清蛋白的已知数量用于建立标准曲线。清蛋白分泌量的特异重用总蛋白量标准化(如采用标准Bradford法).扫描电子显徵镜(SBM)和透射电子显微镜(TEM)样品的制备制备SEM样品时，二维或三维生长的细胞在2%曱醛和2.5%戊二醛中室温下固定1小时，緩沖液为Sorenson磷酸緩冲液.之后样品用0.1M裤酸緩冲液洗涤，在用1%0304(aq.)溶液浸泡l小时，然后于50%、70%、95%和1Q0。/。酒精中脱7jc各5分钟，每个脱水步骤重复4次.之后，二维或三维的固定样品切成小块(约25咖2)，装于样品固定装置上，用C0,于38t:下1200psi干燥.然后样品在喷上7nm厚的铬，并用HitachiS5200SEM分析。使用TEM分析时，三维生长的细胞采用上述SEM的方法固定和处理.然而，脱水和切成小块后，样品采用树脂(AralditeCY212,AgarScientific)于37iC下包埋l小时，然后置于锥形台上601C过夜.对于二维生长的细胞的制备，采用2%甲瘙和2.5%戊二搭中室温下固定l小时，緩冲液为Sorenson磷酸緩冲液.之后细胞从组织培养塑料件中撕下，1S000rpm离心10min。离心后的细胞用0.1M磷酸緩冲液洗涤，在用1%0s0,(aq.)溶液浸泡l小时，然后于50%、70%、95%和100%酒精中脱水各5分钟，每个脱水步骤重复4次。脱水后的细胞浸于树脂(AralditeCY212)60min，371C。之后，切出树脂包埋样品的超薄切片，用TEM(HitachiH7600)分析，转g耽胺蘇的醉学分析组织中的转谷氨跣胺酶是一个交连酶，最近被认为在纤维化损害的形成过程中扮演重要角色.该酶的代谢常被作为体外毒性测试的标志物，如有该酶存在，则表明细胞膜的损害在产生.几个体内和体外实验模型系统表明了组织中转谷氨跣胺酶表达和活性、细胞生长的抑制和程序性细胞死亡之间的直接联系[33-35]。转谷氨酖胺酶的量采用前述的数量酶活分析仪(Sigma，UIC)进行分析[36]。统计学分析实验最少独立重复3次。数据采用曼-惠特尼U检验分析统计显著性(5%的显著性差异水平或更高)。实施例1水相温度的影响增加水相温度，发现PolyHIPE材料的连接泡和空泡直径都显著增加(图2)。空泡的平均直径从50个空泡计算得到，直径用SEM显微照片的图像分析来确定。计算出的平均空泡直径值(D)显示随着水相温度的增加，D值也稳定增加，这极可能是因水相温度逐步增加时，HIPE的稳定性逐渐降低.增加水相温度，水滴中的热激活剂将增加接触频率，结果水滴融合的可能性加强2。Lissant还报导说，当乳液受热时，液滴之间的连接膜上的表面活性剂在液相中可溶性增加，因此会从分界面迁移3。这将增加界面上的表面张力，促进液滴融合。HIPE粘性减少表明液滴具有更强的可移动性。这也有利于促进液滴融合。参考文献4中描述了经溶合后的乳液的液滴大小分布图，图中含向大液滴尺寸方向延伸的分布尾，其中大液滴大小相对保持不变.液滴大小分布困(图3)显示了分布尾朝向大的空泡尺寸.尾部随温度的增加而增加，也可看到分布区域的变宽.因此，可以进一步认为，当液相温度增加时，溶合是乳液不稳定性增加的主要机制.压入体积Vs连接泡直径的不同分布区域图(图4)表明当水相温度增加时，连接泡35大小也增加。该区域图还显示，当水相温度增加时，在狭窄区域内分布大部分大尺寸连接泡和其它宽的区域分布少数小连接泡的材料是存在的。这意味着，对于每种乳液来说，其连接泡的直径大小是有限的。与4^目比，当温度增加时，空泡的大小分布于更广的区域。连接泡直径的平均值(d)与空泡直径平均值(D)的比提供连接度的一个测量方法。M究中制备的材料的值见表l.当温度增加时，PolyHIPE材料的连接度(d/D)下降。it^明当^M目温度增加时，乳液稳定性降低，实施例2添加剂的影响乳液部分不稳定性可由水相中的有机添加剂引起。这些添加剂必须在乳液的连续相和内相(^Hft相)中都部分可溶，这样可以将其水分子从一个液滴到另一个液滴的分散性，刺激奥斯特瓦尔德熟化(0stwaldripening)。Lissant报导了共溶的添加剂，如丙酮或曱醇，可以破坏界面中的膜，因它们在两相中均可溶。这些添加剂使界面层变薄，使得一些表面活性剂迁移入主相，因此促进乳液液滴之间的溶合.出于选择不同极性范围和摩尔量范围的试剂样品考虑，Mn-300的聚乙二醇(PEG3。。)，曱醇和四氢呋喃(THF)被用作水溶性有机试剂。每种成分都逐步加量添加到HIPEs中，直至液相分离发生，发现与THF或PEG相比，乳液中可添加更多量的曱醇，当考虑到每种试剂的摩尔量时(0.1mol曱醇、0.02molTHF和0.005molPEG),这更加明显.这是因至少与THF相比，曱醇更多的ii^7jc相。正辛醇/水分配系数值(logPoJ对THF来说为0.45，而曱醇为-O.77。未能找到PEG的logPow值。SEM照片显示每种添加剂都使空泡和连接泡变大。根据SEM显微照片的分析结果而来的空泡大小分布图见困6.图6a显示PEG添加刑产生的材料与无添加剂的PolyHIPE材料比，空泡的大小分布区域更宽。这种特点与添加曱醇(图6b)和THF(图6c)的结果类似，然而曱醇对分布结果的影响比THF或PEG的影响小，用THF或PEG制备的材料与用曱醇制备的材料比，含有更大范围的空泡尺寸.PEG和THF也使PolyHIPE材料具有更大的平均空泡尺寸值(见表l),连接泡的分布区域曲线对所有添加剂而言都很类似(图7).当添加剂的浓度增加时，材料呈现出大的连接泡平均直径和窄的尺寸分布区域的趋势.只有THF作为添加剂时例外。当THF处于高浓度时，分布区域还很宽。当使用PEG作为添加剂时，连接泡的平均直径随着水相中的PEG浓度的增加而稳定增加(表1)。这种效应在THF或曱醇中不明显；对这些添加剂而言，当连接泡直径要有显著的改变时，它们需要更高的添加剂浓度.在THF的情况下，这是未曾预料到的，因为它对空泡的平均直径影响最为显著。连接度(d/D)随着有机组分的添加而减小，这是由于与连接泡直径相比，空泡直径快速增加了。添加PEG或曱醇后，连接度随着水相中的添加剂浓度的增加而稳定增加。然而，在添加THF时，连接度随着浓度增加而持续降低。这是因为THF在浓度未达到1.5%时，对连接泡的尺寸都无显著影响。之前的研究工作5中，因添加共溶剂或添加剂而增加的PolyHIPE材料的空泡尺寸，都单独归因于奥斯特瓦尔德熟化.然而，也可能是有机添加剂影响了其它作用过程，导致乳液不稳定。如前所讨论，共溶剂的添加可使表面活性剂迁移至主液相、使得乳滴变为更倾向于溶合而破坏液相间的层。这可能是因共溶剂添加到系统中后，溶合性和奥斯特瓦尔德熟化都加强了，其中一个作用会占据上风，这取决于系统本身(乳液类型、表面活性剂类型等)。为检测奥斯特瓦尔德熟化的影响，采用每种添加刑8小时来测量水的自扩散系数Dw(表2)。当添加曱醇时，扩散系数与未添加的相比无显著不同。当添加PEG和THF时，扩散系数有显著不同，在THF中更为明显。这些值可能与空泡和连接泡的平均直径有关随着时间的过去，水的自扩散系数D，的变化可看出乳液中每种共溶刑的影响(图8),在添加THF和PEG时，D,与未添加共溶剂的乳液相比显著增加。这表明THF和PEG都使乳液中的扩散率增加，这使奥斯特瓦尔德熟化作用加强，并可能可以解释空泡尺寸增加的原因。添加剂的正辛醇/水的分配系数值(logP)(THF=0.45;甲醇=-0.77)表明THF比曱醇更易在油相中分配，使得添加THF后，乳液更不稳定.由于添加曱醇D，无显著增加，其它的影响因素如融合性必须考虑在内，用以解释空泡直径的增加。溶和性可由液相间的层变薄和因共溶剂的存在而增加了可溶性，表面活性剂随后迁移入主相而引起.如果确是这个原因，那么表面活性剂浓度(C,)对材料的最终形态是有影响的。为探讨C，对形态学的影响，采用THF和曱醇作为添加剂制备了不同C,值的PolyHIPE材料。由于THF已表现出可加强水的扩散，这使得我们可以探讨用THF得到的形态是单独因奥斯特瓦尔德熟化引起，或还涉及液相界面表面活性剂的减少。另一方面，曱醇对水的扩散无影响。因此可以预料，如果甲醇会影响液相界面的表面活性剂浓度，那么随着C,增加，形态也会显著受影响。从SEM照片(图9a，b)中可看出，当含THF的HIPEs中的表面活性剂增加时，材料的开放性(opennature)增加，M空泡直径无明显的影响.然而，从空泡分布表中，可看到表面活性剂浓度的增加，空泡直径向小的方向小幅度漂移(图10a)。但是当表面活性剂浓度减少时，未能观察到扁平或加宽的分布区域.使用THF作为添加剂，当表面活性剂浓度增加时，d/D值(表3)也增加。这是由于D的稍微减少而对d值几乎无影响而引起的，这也进一步说明，当THF存在，表面活性剂浓度增加时，材料的开放性增加.然而，虽然表面活性剂浓度增加时空泡的平均尺寸有稍微减小，与无添加剂制备的材料相比，其D值的增加还是明显的(表3中的第3项与表1中的第1项相比)。这表明，使用THF制备的基于聚苯乙烯的PolyHIPE材料中，奥斯特瓦尔德熟化对其形态是起决定性影响的，水相中含有曱醇，表面活性剂浓度也增加。这对最终材料的形态几乎无任何影响(图9c，d)。从空泡尺寸分布区域图(图10b)中，当表面活性剂浓度从20%增加到30%(w/w)时，分布区几乎看不出有什么区别.当表面活性刑浓度增加到30%(w/w)时，唯一可辨别的影响是直径处于30~40pm的空泡百分数有小的增加，更大尺寸的空泡百分数有所减少，然而，表3中说明了当"=25%时，D值最大.THF作为添加刑时，表面活性剂浓度对连接泡的直径几乎无影响(困lla)。与4^目比，采用曱醇，表面活性剂浓度从20%增加到25%时，顶峰向大的连接泡尺寸方向偏移(图lib).然而，当表面活性剂浓度从25%增加到30%时，连接泡直径变小，虽然这两种材料中d/D比(表3)还是相似的，这是因D同时减少了.从以上结果，我们明确了使用甲醇时，由于它对水自扩散系数无影响，因此奥斯特瓦尔德熟化并非空泡直径增加的原因.水能从一个液滴向另一液滴转移的另一作用过程是在w/om粒中'，这在HIPEs的连续相中是已知存在的'.表面活性刑浓度的增加将使连续38相中的粒数量增加，这加强了液滴间水的转移作用。为解释采用甲醇，表面活性剂浓度增加时的结果，我们认为添加的表面活性剂影响了两个彼此相反的作用过程它取代了被曱醇破坏的表面活性剂，这使乳液稳定性加强；它增加了w/om粒的数量，加强了水的转移，使乳液稳定性降低。这方面的证据来自"=25%时，D值和d值最大，说明这两个独立的过程都在起作用.这种关联的影响为采用甲醇制备PolyHIPEs,当表面活性剂浓度从20%增加到30%时，其形态几乎无任何不同。总之，以上已说明了不同方法可用来控制乳液的稳定性，以产生大范围的不周大小的空泡和连接泡的PolyHIPE材料。控制这些不同的参数可产生不同骨架结构，每种结构为不同细胞类型的三维培养量身定做。实施例3PolyHIPE材料的结构的可控制性十分有利于优化以三维方式培养的细胞的生长。为此目的，我们发展了这种材料的一种新用途，将基于苯乙烯的聚合骨架加工成适合于常规细胞体外生长的薄膜，用于现有组织培养塑料件(例子见图12和13)。采用该具有大表面积的薄膜的方法，使得(1)细胞不管是静态或动态接种，都极易ii^材料结构中；氧气和营养元素易于进入(在一些例子中从薄膜两側进入-见图12，实施例l)及废物和二氧化碳易于排出减少了在大面积聚合物骨架上植入的细胞死亡的几率。这利于促进三维培养细胞的存活；(2)外来的反应物(如待测试剂)易于进入三维生长的细胞中；(3)三维生长后的细胞可从骨架上分离以进一步采用酶学方法分析，如与胰岛素一起孵育(数据未给出)；(4)骨架内生长的细胞和组织了用电子或光学显微镜方法分析(各见图14和20).聚合物材料结构的可控制性对优化细胞生长和行为是十分重要的.这些材料上孔的细微不同都会显著影响细胞的骨架粘附、增殖、分化和功能化方面的能力(图15-17),与传统二维细胞培养塑料件相比，具90%空泡体积且为体外细胞生长优化过的、基于苯乙烯的聚合物材料同样加强了细胞增殖、分化和功能化作用(图18-24)。实施例4在材料中生长的H印G2细胞的形态学特点39扫描电子显微镜方法揭示了在二维或三维物上培养的HepG2细胞外表的显著不同(图25)。在二維平面上生长7天后的细胞程序化扁平伸展的结构。简而言之，二维培养细胞显示出异质性和无组织性。14天后，组织培养塑料件上生长的细胞开始聚集成簇并形成团。在培养14天的二维培养区域，HepG2细胞呈现出病态，一些变圆，另一些解体(数据未给出)。三维聚苯乙烯上培养的细胞，在骨架结构上延展和进入。细胞一开始在聚合物中簇集成紧密靠近的群，类似于小的多细胞团。这意味着在骨架上生长的相邻细胞间有更好的粘附与相互作用.7天后，三维生长的HepG2细胞培养物比二维生长的细胞呈现出更多的一致性.更低接种密度的生长培养表明细胞粘附在骨架上，并延伸穿过空泡.这解释了三维培养的细胞如何可以与相邻细胞及培养勤目互作用而将它们的表面积最大化.另外，三维生长的单个细胞的高倍数照片揭示了其与二维表面上生长的相比，明显具有更多绒毛，透射电子显微镜方法用于检测在不同材料中培养的H印G2细胞的超微结构特点(图26)。一般来说，对在二维或三维物上生长的完整细胞的分析，包括大部分哺乳动物细胞的细胞器，其中包括线粒体、细胞核、内质网和液泡。三维生长细胞的超薄切片清晰的显示出细胞如何在聚苯乙烯骨架上生长和与骨架之间的紧密联系。三维生长的细胞显示出肝组织的大量形态学特点。核膜显示正常.众多的线粒体显示出正常范围内的结构变化.光面或粗面内质网、高尔基体或核糖体上无可见的病理学变化。这些超微结构特点表明三维物上生长的H印G2细胞有代谢活性.在哺乳动物肝脏及肾中普遍存在的细胞器-过氣化物酶体的存在(图26B),更加说明了这个问题。肝脏过氧化物酶体已知是作用于胆汁合成过程中，胆固醇支链反应的P氣化的，该反应途径与肝分化细i!M目关[8]。在自然的肝组织中，当邻近的细胞形成胆汁通道时，肝细胞具两个或三个面朝小管的极性表面.三维生长细胞的细微照片揭示相邻的肝细胞间常共享以紧密连接方式排列的绒毛通道。该观察结果说明HepG2细胞可能极化并可形成组成胆汁分泌通道的通道[9]。这些结构已知具有大量微绒毛，细胞内新陈代谢的胆汁组分通常分泌于该通道中。实施例5;举勿應4^过程#>获付知^译#.'我们检测了这项研究中的材料表面是否与H印G2细胞的生长生物性相容。图27A显示了二维对照表面和我们三维骨架上生长的H印G2活细胞的MTT吸收值。活细胞在这两种介质中都成功地培养了21天。分析结果显示生长于三维上的细胞活性显著加强。值得注意的是，在骨架上生长的细胞有更多的表面积用于粘附和生长，与"M目比，平面上生长的细胞其每个细胞的空间有限，该不同已尽可能考虑，体外分析中的值已标准化。实施例6三举勿^&^炎《在H印G2细胞的代谢活性采用清蛋白分泌量来评价。图27B显示了二维组织培养塑料件和三维骨架上生长的细胞的清蛋白分泌的时间过程。值已标准化，以免因细胞数量不同而带来的任何不同结果。从图中可以清楚的看出，三维生长的细胞的清蛋白浓度在任何检测时间点都明显比二维培养的细胞的高。在平面组织培养塑料件上培养的细胞其清蛋白量在14天时达到顶峰，21天后急剧下降。三維生长的培养物上并未发生这种情况，说明三维生长环境更有益于细胞功能的保持.实施例7二举々三举if^媒吟彩喊.'二维和三维生长的HepG2细胞用不同浓度的MTX处理，来评价它们对这一已知的细胞毒素的抗性.每个处理周期后，培养物用于研究生化(图28)和形态学(图29及30)方面的改变。图28A显示了不同浓度MTX处理1天和7天后的细胞活性，用MTX处理H印G2细胞单层，結果15mMMTX处理24小时后，吸光率逐渐上升，但7天后吸光率开始下降(数据未显示)。当MTX浓度增加时，特别是细胞毒素达到高浓度时，二维表面生长细胞的活性明显下降。在三维培养细胞中，对MTX的敏感度在较低浓度的MTX时不明显；只有MTX浓度为62pM时，与对照组相比，其吸光率才明显下降。这种特点在培养7天的三维培养物中也可见到，而此时单层培养7天的细胞在MTX浓度为125yM时，其吸光率急剧下降.这些结果意味着在这些条件下，与三维骨架上培养的相比，二维面上培养的细胞有活性的时期更短。MTX浓度增加时，HepG2细胞的代谢活性显著下降(图28B)。二维生长的细胞对测试的最低浓度(8pM)的MTX也敏感，而这个浓度对三维生长的细胞的清蛋白分泌量物无显著影响(未出示数据)。然而，MTX浓度的增加U5.6pM)开始使骨架上培养的细胞的清蛋白分泌量下降。在整个细胞毒素作用过程中，与二维材料上生长的相比，三维生长的细胞的清蛋白分泌量都更高。这些数据说明肝细胞功能被MTX削弱，具体以量的大小决定，三维生长的细胞对细胞毒素显示出更强的抗性。转谷氨耽胺酶的测量用于测试HepG2细胞对增加的MTX浓度的反应。我们测试了细胞毒素下培养1、7和10天后，MTX对二维和三维培养物的转谷氨跣胺酶量的影响(图28C)。在对照组培养物中，未添加MTX,转谷氨酰胺酶量极小，表达量类似，当该药物浓度增加时，例如31pM,二维培养物的转谷氨酰胺酶分泌量显著加大，加大的程度取决于药物量，而三维生长的细胞则不同。与三维生长的相比，在培养7天或IO天的二维培养物上的这些不同也有统计学上的差异。在三维培养中，MTX浓度的增加并未明显增加转谷氨酖胺酶分泌量，虽然在该药物的高一些的浓度下，分泌到培养基中的酶的量也逐渐增加。这些数据进一步表明三维多孔材料上生长的细胞对增加的细胞毒素有更好的抗性。扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)显示了MTX处理后的取决于浓度的结构变化.这种形态学上代表性的变化见图29及图30。正常、健康的HepG2细胞在细胞表面显示出众多的微绒毛。当用MTX处理时，二维生长的细胞逐渐失去这些微绒毛，具体视试剂量的大小而定，而骨架上生长的细胞ii继续显示出该结构特征(困29)。MTX浓度增加时，HepG2细胞生长为单层，一开始绒毛数量减少，之后变平，再开始解体.而三维骨架生长的细胞未观察到这种变化，虽然在MTX测试的最高浓度(125pM)条件下生长的细胞的微绒毛，开始显示出变平的征兆.TEM的进一步分析揭示了该细胞毒素引起的超微结构变化(图30)。在对照組中，二维生长的细胞具正常的形态，有明显的和及可见的核仁.8nMMTX处理后，二维培养的细胞仍保持良好的结构，虽然已有一些地方的细胞结构破坏了.增加MTX浓度，肝细胞的二维培养物显示出细胞毒性，大部分细胞在高浓度MTX条件下死亡.也可观察到一些特征如内质网解体，出现核糖体影(riboso咖lghost)。而且，细胞质通常缺少组织结构，染42色质在核仁中*开。凋亡小体的亚细胞证据也可被观察到；质膜破裂，产生了大量液泡，或许反应了液滴和细胞降解的存在。细胞收缩明显，同时细胞与细胞间的接触丧失，之后形成凋亡小体(自喧小体)和细胞死亡。在最高浓度时，也可观察到细胞残余的鬼影(ghost)，这显示在高浓度MTX条件下，二维生长的细胞已经历了细胞死亡的高级阶段。与i^目比，在MTX条件下，三维生长的HepG2细胞对细胞毒素的影响抗性更强，低浓度MTX处理的超微结构在其胞质中有正常的细胞器官(粗面内质网、核糖体、线粒体和液滴)。细胞核中有正常的异染色质及核仁。这些特征在测试的MTX的大部分浓度下都很好的保持。然而，在125pMMTX时，一些细胞的核膜有不规则的形态和其它亚细胞特征，如线粒体呈现出轻微的不正常。因此，在高浓度MTX^fr下，三维培养的细胞也开始变化，如同二维培养的细胞在低浓度条件下就开始的变化。总之，在基于聚苯乙烯聚合物骨架上细胞的生长适合于现有细胞培养塑料件，可提供细胞在体外三维生长的机会。细胞的行为受细胞生长环境的影响，三维生长的细胞更类似于体内生长环境内生长的细胞。本发明中描述的装置为研究者提供了一种常规三维培养细胞的机会，这在细胞模型和分析过程中获得更精确的信息是极具价值的，该装置稳定、易使用、可被灭菌，制造及加工成本低，它足够坚韧和可重复利用，保质期长，用途广泛。实施例8聚苯乙烯骨架的用途的再一个应用方面，我们发展出一种哺乳动物皮肤的有机体模型，它由在皮肤纤维细胞层上、培养基/空气界面上生长的表皮角质细胞的分化层组成，骨架中有或物胶原或水溶性覆盖层。该系统使得十分接近于自然皮肤上的、极化的上皮细胞的长期培养和保持成为可能.该技术可用于在大范围内研究皮肤上皮细胞的功能，包括基础科学、药学发展、化合物毒性评测。哺乳动物皮肤的有机体模型之前已有很好建立，在体外有许多已有方法来达到这个目的(如Bohnert等，1986;Ikuta等，2006;Prunieras等，1983;Schoop等，1999)。现有的技术需要皮肤纤維细胞在胶原复合物中生长，角质细胞接种于两层细胞之间，胶原随时间收缩；之后暴露出空气/培养基界面使细胞生长和活性发生变化。胶的处理是要很灵敏的，这需要时间、技巧和专心。结果这种模型自然难以用于高通量的筛选方式，或用43于可变性需要减少和操作需要简化的环境。在此我们阐述了我们三维聚苯乙烯骨架的应用，使常规j吏用及处理有机体皮肤共培养的纤维细胞和胶原更可能。简而言之，在适当的生长培养基上，将皮肤纤维细胞培养物接种于我们三维聚苯乙烯骨架的表面(图31a)。细胞在表面上生长并进入三维薄膜的内部结构中(图32)。这可达到有或无胶原溶液/胶，或骨架用胶原溶液事先浸泡的效果(如I型胶原)。惰性的三维塑料骨架为培养的纤维细胞提供支撑。布满成纤维细胞的骨架易于处理，如需要，可转移到另一细胞培养塑料件上(如6孔板)。此外，胶原的胶体会收缩导致实验间的不稳定性。纤维细胞建立之后，将表皮角质细胞(如HaCaT细胞)接种于纤维细胞表面，建立起有机共培养物(图31b).当角质细胞培养物建立之后(~2天)，聚苯乙烯骨架的表面上升到空气-液面界面，空气使得角质细胞层化(图31c和33)。采用三维多孔聚苯乙烯骨架用于哺乳动物皮肤的有机共培养具有以下优点为细胞(和胶，如适用)提供支撑及为真皮纤维细胞提供三维环境可减少纤维细胞培养物/J!^、混合的搮作及避免胶/培养物的破裂或损坏■^^L原的胶体收缩达到最小使有机培养物易于转移到其它容器中减少培养基量或升高骨架自身都可使培养物上升到空气/液体界面上(例如，采用孑L嵌入结构与调节装置使嵌入物上升高度)。参考文献1、A.BarbettaandN.R.Cameron,他cro迈o/ecw/es，2004,37,3188.2、A.S.KabalnovandE.G.Shchukin，Adv.Co//o/cT//^er/"ace.Sc/.，1992,38,69.3、K.J.Lissant(ed.),'EmulsionsandEmulsionTechnologyPartl'，MarcelDekkerInc.,NewYork,1974.4、M.P.AronsonandM.F.Petko，义/"fer尸aceSc/.，1993,159,134.5、M.W.Hay咖n,LH.Smith,N.R.Cameron,andS.A.Przyborski,Bioche迈.Biophys.Res.6b咖wi,2004,314,483;M.W.Hayman，K.H.Smith,N.R.30Cameron,andS.A.Przyborski,/.5/ocAe瓜A/.o/力j^.始fAoc^,2005，62，231,<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula>dermalfibroblasts.JInvestDerrnatol112:343—353.表l水相温度(t:)-'添加剂(％)-bDU迈)_cd(nm)」d/D23-35110.2950-74160.2760-94190.2280-104260.2523PEG(0.2)82120.1523PEG(0.4)73140.1923PEG(0.8)84150.1723PBG(l.5)74160.2223MeOH(l.0)59120.2023MeOH(2.0)57120.2123MeOH(3.0)68160.2423MeOH(4.0)65140.2223THF(0.4)60120.2023THF(O.8)90120.1323THF(l.0)72120.1723THF(1.5)99150.15'水相温度b水相中的添加剂量Vol%(PEG为wt./vol.%)°SEM测得的空泡平均直径4压汞实验测得的连接泡平均直径表2<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>'在乳液制备过程中，每种情况水相温度都为室温b水相中的添加刑量(v/v)%(PEG为(w/vH)°SEM测得的空泡平均直径4压汞实验测得的连接泡平均直径°Dwi-水自扩散系数的初始值fDwf-水自扩散系数的^['口Dw-水自扩散系数的变化值<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>权利要求1、一种细胞培养底物，含微孔聚合物材料，其特征在于微孔聚合物材料的空泡体积为88％～92％。2、如权利要求l所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的空泡体积约90%。3、如权利要求1或2所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的底物中包括20%(w/w)-40%(w/w)浓度的疏水弹性体.4、如权利要求3所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的的疏水弹性体浓度为25%(w/w)-35%(w/w).5、如权利要求3或4所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的的疏水弹性体浓度为30%(w/w).6、如权利要求3或4或5所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的弹性体选自下列组分之一丙烯酸2-乙基己酯；丙烯酸正丁酯和丙烯酸正己酯。7、如权利要求6所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的弹性体为丙蜂酸2-乙基己酯.8、如权利要求6或7所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的丙烯酸2-乙基己酯浓度为28%-32%。9、如权利要求8所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的丙烯酸2-乙基己酯浓度约30%。10、如权利要求1-9任一项所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的细胞培养底物包括乙烯聚合物。11、如权利要求10所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的乙烯聚合物为聚苯乙烯。12、如权利要求11所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述聚苯乙烯含苯乙烯单体和二乙雄基苯.13、如权利要求1-12任一项所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的细胞培养底物包括表面活性剂。14、如权利要求13所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的表面活性剂浓度为20%-30%(w/w)。15、如权利要求14所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的表面活性刑浓度为24%-26%(w/w)。16、如权利要求11所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的表面活性剂浓度为25%(w/w).17、如权利要求1-16任一项所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的细胞培养底物包括微孔聚合物材料的薄膜或薄层，其厚度为50-1000pm.18、如权利要求ll所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的薄膜/薄层厚度为120~150ym.19、如权利要求1-18所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的微细胞聚合物材料进一步包括一种有机单体。20、如权利要求19所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的有机单体选自下列组分之一曱基丙烯酸正丁基酯、甲基丙烯酸正己基酯、丙烯酸环己基酯、曱基丙烯酸环己基酯，丙烯酸苯基酯、甲基丙蜂酸苯基酯、3-氣曱基笨乙烯、对氣曱基苯乙烯，对乙酰H基苯乙烯。21、如权利要求1-18所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的微细胞聚合物材料进一步包括一种有机聚合物.22、如权利要求21所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的有机聚合物选自下列组分之一聚甲基丙烯酸丁基酯、聚曱基丙烯酸己基酯、聚丙烯酸环己基酯，聚甲基丙烯酸环己基酯，聚丙烯酸苯基酯、聚甲基丙烯酸苯基酯、聚3-氯曱基苯乙烯、聚对氣甲基苯乙烯，聚对乙酰氧基苯乙烯.23、如权利要求122任一项所迷的一种细胞培养底物，其特征在于所述的细胞培养底物包括经一种有利于细胞粘附、增殖、和/或分化的覆盖层修饰的表面，24、如权利要求23所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的修饰为加一蛋白覆盖层。25、如权利要求24所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的蛋白復盖层包括下列的最少一种组分层粘连蛋白、胶原、纤维连接蛋白、非胶原多肽基质。26、如权利要求24所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的蛋白覆盖层包括多聚IU^酸覆盖层。27、如权利要求26所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的多聚M酸覆盖层包括聚L-鸟氨酸或L-赖氨酸.28、如权利要求23所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的细胞培养底物表面经物理修饰。29、如权利要求28所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的底物表面经等离子气体修饰。30、如权利要求29所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的表面经含氨的等离子气体修饰。31、如权利要求29所述的一种细胞培养底物，其特征在于所述的表面经含氧的等离子气体修饰，32、一种细胞培养容器，包括权利要求1-31任一项所述的细胞培养底物。33、如权利要求32-所述的一种细胞培养容器，其特征在于所述的细胞培养底物进一步包括细胞和细胞培养基。34、如权利要求33所述的一种细胞培养容器，其特征在于所述的细胞为真核细胞.35、如权利要求34所述的一种细胞培养容器，其特征在于所述的真核细胞选自下面中的一种哺乳动物细胞、植物细胞、真菌、黏菌。36、如权利要求35所迷的一种细胞培养容器，其特征在于所述的哺乳动物细胞为灵长类动物细胞.37、如权利要求36所述的一种细胞培养容器，其特征在于所述的灵长类动物细胞为人类细胞38、如权利要求35~37所述的一种细胞培养容器，其特征在于所述的哺乳动物细胞选自下列中的一种表皮角质细胞；成纤维细胞、上皮细胞；神经元胶质细胞或神经细胞；肝细胞或肝星形细胞；间充质细胞；肌肉细胞；肾细胞；血液细胞、胰腺p细胞或内皮细胞。39、如权利要求35~38任一项所述的一种细胞培养容器，其特征在于所述的细胞来自癌细胞，40、如权利要求33-31任一项所述的一种细胞培养容器，其特征在于所述的细胞经基因修饰.41、如权利要求35~40任一项所述的一种细胞培养容器，其特征在于所述的哺乳动物细胞为千细胞，42、如权利要求41所述的一种细胞培养容器，其特征在于所述的干细胞选自下列之一造血干细胞；神经干细胞、骨干细胞、肌肉千细胞；间充质干细胞、上皮千细胞；内皮干细胞；胚胎干细胞；胚胎生殖细胞；胚胎癌干细胞，43、如权利要求33所述的一种细胞培养容器，其特征在于所述的细胞为原核细胞或经基因修饰的原核细胞.44、如权利要求43所述的一种细胞培养容器，其特征在于所述的原核细胞为细菌细胞.45、如权利要求33-44所述的任一项一种细胞培养容器，其特征在于所述的细胞培养容器为生物反应器.46、一种细胞培养方法，包括以下步骤i)提供一细胞培养容器，该容器包括a)细胞；b)本发明所述的细胞培养底物；b)足够的供所述的细胞生长的细胞培养基，和；ii)提供能促进所述细胞增殖和/或分化和/或功能化的细胞培养条件。47、如权利要求46所述的一种细胞培养方法，其特征在于所述的细胞为哺乳动物细胞。48、如权利要求47所述的一种细胞培养方法，其特征在于所述的哺乳动物细胞为人类细胞.49、如权利要求46-48所述的一种细胞培养方法，其特征在于所述的细胞为肝细胞。50、如权利要求46所述的一种细胞培养方法，其特征在于所述的细胞为原核细胞。51、如权利要求50所迷的一种细胞培养方法，其特征在于所述的原核细胞为细菌细胞。52、一种筛选可影响细胞增殖、分化或功能化的制剂的方法，包括以下步骤i)提供一种细胞培养物，其最少包括一种肝细胞和权利要求1-31中任一项中所述的细胞培养底物；ii)加入最少一种待测制剂；和iii)监测该制剂关于所iiJt细胞的增殖、分化或功能化方面的活性，53、如权利要求52所述的一种影响细胞增殖、分化或功能化的制剂的筛选方法，其特征在于所述的细胞为肝细胞。54、一种与细胞分化有关的基因的确定方法，包括以下步骤i)提供细胞培养物，其最少包括一种细胞和本发明的细胞培养底物；ii)从所述的细胞培养物中的细胞中提取核酸；iii)所述的提取的核酸排成核酸阵列；和iv)检测指示在所述的核酸阵列上所述的核酸和其结合物结合的信号。55、如权利要求54所述的一种与细胞分化有关的基因的确定方法，其特征在于所述的细胞为肝细胞。56、如权利要求52~56任一项所述的一种与细胞分化有关的基因的确定方法，其特征在于i)收集所述的核酸与所述的结合物的结合所产生的信号；ii)将收集的信号转换为可比较的形式；和可选择；iii)提供分析后的数据结果，57、一种正常细胞转化为癌细胞过程的体外分析方法，包括以下步骤i)制4h^本发明细胞培养底物的预备物，包括细胞；ii)加入最少一种可诱导细胞转化的制剂；和iii)监测所述的制剂在所述细胞转化中的影响，或无影响。58、如权利要求57所述的一种正常细胞转化为癌细胞过程的体外分析方法，其特征在于所述的细胞为肝细胞。59、一种微孔聚合材料的制备过程，包括以下步骤i)制备一预备液，其包括高内相比乳液，乳液中包括浓度为20%(w/w)-40%(w/w)的疏水弹性体；ii)制M催化剂的预备液；iii)将(i)和(ii)中的预备液混合;和iv)混合后的预备液孵育以形成高内相比乳液聚合物。60、如权利要求59所迷的一种微孔聚合材料的制备过程，其特征在于所述的疏水弹性体浓度为25%(w/w)~35%(w/w),61、如权利要求59或60所述的一种微孔聚合材料的制备过程，其特征在于所述的疏水弹性体浓度为约30%(w/w).62、如权利要求59~61任一项所述的一种微孔聚合材料的制备过程，其特征在于所述的疏水弹性体选自下列組分之一丙烯酸2-乙基己基酯、丙烯酸正丁基酯、丙烯酸正己基酯。63、如权利要求59-62任一项所述的一种微孔聚合材料的制备过程，其特征在于步骤ii)中所述的预备液中的温度为501C-80t:。64、如权利要求63所述的一种微孔聚合材料的制备过程，其特征在于所述的步骤ii)中所述的预备液的温度为50x:或60x:或sox:。65、如权利要求59~64任一项所述的一种微孔聚合材料的制备过程,其特征在于步骤i)中所述的预备液中含苯乙烯单体。66、如权利要求65所述的一种微孔聚合材料的制备过程，其特征在于步骤i)中所述的预备液含苯乙烯。67、如权利要求59~66任一项所述的一种微孔聚合材料的制备过程，其特征在于步骤i)中所述的预备液含浓度为20%~30%(w/w)的表面活性剂。68、如权利要求67所述的一种微孔聚合材料的制备过程，其特征在于所述的表面活性剂浓度为24%~26%(w/w)。69、如杈利妻求67成28所迷的一种微孔聚备材抖的制备过程，其持征在子所速的表面活性剂浓度为25%(w/w)。70、如权利要求67或28所述的一种微孔聚合材料的制备过程，其特征在于步骤i)中所迷的预备液含60%(w/w)苯乙彿；30%(w/w)丙蜂酸2-乙基己基酯；10%(w/w)二乙烯基苯和25%表面活性刑。71、如权利要求59-70任一项所述的一种微孔聚合材料的制备过程，其特征在于步骤iv)所述的高内相比乳液聚合物被切成薄片。72、如权利要求71所述的一种微孔聚合材料的制备过程，其特征在于所述的聚合物被切成50~1000Mm厚的薄片.73、如权利要求72所述的一种微孔聚合材料的制备过程，其特征在于所述的薄片厚度约为12074、一种高内相比乳液聚合物，由权利要求59-73任一项所述的一种微孔聚合材料的制备过程所获得。75、如权利要求74所述的一种高内相比乳液聚合物,其特征在于所述的高内相比乳液聚合物中空泡体积为90%.76、一种底物使用方法，采用根据权利要求1~31任一项所述的含高内相比乳液聚合物的底物用于培养细胞。77、如权利要求76所迷的一种底物使用方法，其特征在于所述的高内相比乳液聚合物中的空泡体积为90%左右。78、如权利要求77所述的一种底物使用方法，其特征在于所述的高内相比乳液聚合物中的空泡体积为90%。79、一种底物使用方法，采用权利要求1-31任一项所述的高内相比乳液聚合物来检测制刑的肝脏毒性。80、如权利79所述的一种底物使用方法，其特征在于所述的制剂为用于化学治疗剂。81、如权利79所述的一种底物使用方法，其特征在于所述的制剂为病毒基因治疗栽体。82.—种检测制剂的肝脏毒性的方法，包括以下步骤i)提供一种细胞培养物，其最少包括一种肝细胞和权利要求1-31中任一项中所述的细胞培养底物；ii)加入最少一种待测制刑；和iii)监测该制剂关于所述肝细胞的增殖、分化或功能化方面的活性，作为该制剂的毒性测量结果。83、如权利要求82所述的一种检测制剂的肝脏毒性的方法，所述的制剂为用于化学治疗剂.84、如权利要求82所述的一种检测制剂的肝脏毒性的方法，所述的制剂为病毒基因治疗栽体。85、一种角质细胞和角质细胞前体干细胞的生长和分化方法，包括以下步骤i)形成预备液，预备液中含本发明中的细胞培养底物、成纤维饲细胞和细胞培养基；ii)培养所述的饲细胞，使细胞培养底物充分被铜细胞覆盖；iii)角质细胞和/或角质细胞前体干细胞接触所述的覆盖后的底物；和iv)在有利于角质细胞和/或角质细胞前体干细胞生长和分化的条件下培养混合细胞预备液。86、如权利要求85所述的一种角质和角质细胞前体干细胞的生长和分化方法，其特征在于所述的纤维饲细胞为真皮纤维细胞。87、如权利要求85所述的一种角质和角质细胞前体干细胞的生长和分化方法，其特征在于所述的纤维祠细胞选自角膜成纤维细胞、肠粘膜成纤维细胞.口腔粘膜成纤维细胞、尿道粘膜成纤维细胞或膀胱成纤维细胞。88、如权利要求85-87任一项所述的一种角质和角质细胞前体干细胞的生长和分化方法，其特征在于所述的角质细胞为表皮角质细胞.89、如权利要求85-88任一项所述的一种角质和角质细胞前体干细胞的生长和分化方法，其特征在于所述的纤维细胞为人类纤维细胞。90、如权利要求85-89任一项所述的一种角质和角质细胞前体干细胞的生长和分化方法，其特征在于所迷的角质细胞为人类角质细胞。91、如权利要求85-89任一项所述的一种角质和角质细胞前体干细胞的生长和分化方法，其特征在于所述的预备液含有胶原.92、如权利要求91所迷的一种角质和角质细胞前体干细胞的生长和分化方法，其特征在于所述的胶原为l型胶原。93、如权利要求91或92所述的一种角质和角质细胞前体干细胞的生长和分化方法，其特征在于所述的肢原为胶状。94、如权利要求91或92所述的一种角质和角质细胞前体干细胞的生长和分化方法，其特征在于所述的胶原为溶液状。95、如权利要求85-94任一项所述的一种角质和角质细胞前体干细胞的生长和分化方法，其特征在于最少将所述的角质细胞暴露于空气以诱导角质化过程.96、如权利要求85-95任一项所述的一种角质和角质细胞前体干细胞的生长和分化方法，其特征在于所述的细胞培养底物中包括多片约300ym厚的微细胞聚合物薄片。97、一种试刑检测方法，包括以下步骤i)制备本发明所述的预备液，预备液中含待测试剂；ii)监测所述制刑对角质细胞生长和/或分化的影响，并与无所述制剂的对照液相比较.98、一种细胞培养装置，包括权利要求1-31任一项所述的细胞培养底物、细胞培养容器和适合于所述的细胞培养容器使用的嵌入物，包括细胞培养底物和所述的细胞。99、如权利要求98所述的一种细胞培养装置，其特征在于所述的细胞培养底物包括纤维细胞和角质细胞。100、如权利要求1~31任一项所述细胞培养底物的使用方法，用于制备分化的皮肤组合物.全文摘要本发明公开了一种含聚合的高内相比乳液聚合物的细胞培养底物，经调整和修饰后用于常规的细胞三维培养，典型的用于哺乳动物细胞培养；还公开了该底物在细胞培养系统中的使用方法以研究和分析细胞的增殖、分化及功能化。文档编号C12N5/00GK101484574SQ200780024253公开日2009年7月15日申请日期2007年4月24日优先权日2006年4月28日发明者内尔·卡梅伦,斯蒂芬·亚历山大·普兹勃斯基申请人:雷诺维特有限公司