专利名称：冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型制作方法
技术领域：
本发明涉及动物模型的制作方法，更具体地说，是涉及冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型的制作方法。
背景技术：
随着在世界范围内对睡眠呼吸紊乱广泛而深入的研究，越来越多的证据表明睡眠呼吸紊乱与心血管疾病有着密切联系，它与心血管疾病的发病率升高有关，是心血管疾病的一个独立危险因素，未经治疗的睡眠呼吸紊乱有较高的心血管病死亡率，因而被看作是影响死亡率的重要原因之一。但因睡眠呼吸紊乱与冠心病有相同的危险因素，如肥胖、年龄等，在临床研究中，这些混淆因素很难被排除，因此利用动物实验来进行睡眠呼吸紊乱与冠心病关系的机制研究十分重要，迫切需要制作一种冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型，据此，可对冠心病及睡眠呼吸暂停综合症的关系、机理从生物化学、分子生物学、组织学、病理、影像学等诸多方面进行研究。
目前，冠心病的动物模型制作通常采用高脂饮食法加导管法，这两种方法是目前国内外较成熟的制作方法，阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型在中国专利03146665.6中也有相关报道，其是通过内部注射的方法在动物口腔内的对侧咽腭弓部位和/或舌根部注入有效量的医用软组织填充剂，以使动物出现阻塞型睡眠呼吸暂停症状。该内部注射医用软组织填充剂的方法得到的动物模型的各项指标与人类重度的睡眠呼吸暂停综合症的表现类似，是目前很好的制作阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型的方法。
但是该方法采用内部注射对动物的刺激较大，而实验动物在被建立了冠心病的模型后，不能再接受较大刺激，因此，也无法将此阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型与冠心病的动物模型简单结合而实现冠心病合并睡眠呼吸暂停综合症的动物模型的制作，因而，到目前为止，只能对冠心病和阻塞型睡眠呼吸暂停综合症分别研究，而不能实现对冠心病及阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的关系、发病机制、病理生理及治疗学等领域的研究进行综合研究。
发明内容
本研究的目的在于提供一种冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的动物模型的制作方法，其在阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的动物模型制作中对实验动物刺激性小，能够克服现有技术的缺点，可实现在冠心病动物模型基础上进一步制作阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的动物模型，该方法稳定、可靠、重复性好、与临床最为接近且符合伦理学观念，能从多层次、多方面进行睡眠呼吸暂停综合症与冠心病发病机制、病理生理及治疗学等领域的研究。
为实现上述目的，本发明提供了一种冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型制作方法，其包括使用导管法制作冠心病动物模型并根据所述动物的体重大小将有效量的医用软组织填充剂注入动物体内，以使动物出现阻塞型睡眠呼吸暂停症状，其中，所述医用软组织填充剂是通过外部注射法注入到动物脖颈内的相应部位。
所述外部注射的进针部位为动物下颌骨最高点内侧1厘米处。
所述的医用软组织填充剂为医用聚丙烯酰胺水凝胶或亲水性类人胶原蛋白。
所述注入动物脖颈内的医用软组织填充剂的用量为10ml。
而且，所述的医用聚丙烯酰胺水凝胶用0.9％生理盐水青霉素液稀释后注入动物脖颈内的相应部位。
所述的亲水性类人胶原蛋白用0.9％生理盐水青霉素液稀释后注入动物脖颈内的相应部分。
所述的医用软组织填充剂可以一次性或分多次注入动物脖颈内的相应部位。
所述用于制作冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型的动物为体型中等的小型猪。
所述用于制作冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型的动物为体型中等的杂种狗。
所述在动物脖颈内注入医用软组织填充剂的过程在多导睡眠仪的检测下进行。
所述多导睡眠仪用于检测动物的脑电图、口鼻气流、鼾声、胸式呼吸、腹式呼吸、血氧饱和度。
本发明所提供的冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的动物模型的制作方法，其采用外部注射法制作阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的动物模型，对实验动物刺激性小，因此，可实现在冠心病动物模型基础上进一步制作阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的动物模型，其稳定、可靠、重复性好、易于操作且符合伦理学观念，所得动物模型病症接近于自然病理状态，能够从多层次、多方面进行睡眠呼吸暂停综合症与冠心病发病机制、病理生理及治疗学等领域的研究。
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。
图1为注入聚丙烯酰胺水凝胶的情况下未经手术的小型猪的多导睡眠图；图2为注入聚丙烯酰胺水凝胶的情况下经手术后一周的实验猪的多导睡眠图；图3为注入聚丙烯酰胺水凝胶的情况下未经手术的猪的电子计算机断面扫描图；图4为注入聚丙烯酰胺水凝胶的情况下经手术后猪的电子计算机断面扫描图；图5为注入亲水性类人胶原蛋白的情况下未经手术的小型猪的多导睡眠图；及图6为注入亲水性类人胶原蛋白的情况下经手术后一周的实验猪的多导睡眠图。
具体实施例方式
本发明的关键是制作一种冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的动物模型，即该动物模型能够同时患有冠心病和阻塞型睡眠呼吸暂停综合症，从而可以利用动物实验来进行睡眠呼吸紊乱与冠心病关系、发病机制、病理生理及治疗学等领域的综合研究。
因此，本发明包括两个步骤，步骤1制作冠心病动物模型；步骤2在冠心病动物模型基础上制作阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的动物模型。
步骤1制作冠心病动物模型选用体重为10-15kg的中国小型猪(以下称实验猪)，基础饲料按30g/kg/日分上、下午两次给予，自由饮水，根据体重变化调整饲料量。在基础饲料中添加高脂饲料(配方见表1)。
表1高脂饲料配方成份*
动物先经一周的饲养和观察，使之能适应实验环境。手术当天禁食、禁水，测量体重。然后，用戊巴比妥钠(20mg/kg体重)耳静脉麻醉，制作静脉信道以便补液及给药，在液体中加入利多卡因(5mg/kg)预防室颤，必要时可给予适量呼吸兴奋剂。连接监护仪。动物呈仰卧位，四肢固定，用剪刀剪去颈前毛发，碘酒、酒精消毒皮肤，铺无菌有孔手术单，在气管旁一指，平行切开一侧颈部皮肤，分离该侧颈总动脉，用20-30mg肝素(常州生化千红制药有限公司，批号20020316)溶于200ml生理盐水中冲洗动脉鞘管、导管、导丝及球囊，动脉穿刺插入7F鞘管，通过鞘管注入肝素(200u/kg)体重抗凝，采用左前斜位，在造影机透视下经鞘管将右冠导管送入主动脉升段，快速推入76％泛影葡胺(上海淮海制药厂，批号0108022)15-20ml造影定位，使导管开口与冠状动脉开口同轴，将导丝送入冠状动脉左前降支，再沿导丝送入7F球囊导管至左前降支中下1/3处，将球囊用压力泵充至6-10个大气压，观察心电监护仪上ST-T改变，以出现明显ST段下降为标准，持续30s，松开球囊压力60s，然后再将球囊充至2-3个大气压，来回抽拉球囊5次，松开球囊，依次退出导丝、球囊、导管及鞘管，结扎动脉，缝合颈部伤口，适当补液，液体中加入青霉素160万单位，输完后送回笼内，注意保温。
步骤2在冠心病动物模型基础上制作阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的动物模型该步骤是利用已制作成功的冠心病小型猪为实验猪，选用医用软组织填充剂聚丙烯酰胺水凝胶注入实验猪软腭部位的组织内，使上气道狭窄，极其类似于人类睡眠呼吸暂停的解剖学病因，但对上气道周围的组织不会有任何的损害，对实验猪的生命也不会有任何的威胁，实验猪可长期存活，上气道狭窄的效应长期稳定地存在，有利于研究者对睡眠呼吸暂停综合症的并发症及预后进行观察研究。所使用的医用聚丙烯酰胺水凝胶已广泛应用于整形医学领域，它是多孔的无色聚合物，具有弹性、亲水性、耐热性、抗酸冷性，对机体无刺激性，无复杂反应及全身性中毒反应，是治疗和体内修复用的一种惰性高分子材料，是一种安全有效的软组织填充剂。
手术当天早晨禁食、禁水，测量体重，麻醉采用戊巴比妥钠20mg/kg体重耳静脉注射。麻醉后动物使呈仰卧位，四肢固定。手术在多导睡眠仪检测下进行，由于实验小猪已经被建立了冠心病模型，因而不能受到较大刺激，而内部注射医用聚丙烯酰胺水凝胶会给动物带来较大程度的刺激，因此，为避免所述情况，本发明采用外部注射法，将10ml奥美定(B型)用0.9％生理盐水青霉素液(内含青霉素80万u)2ml稀释后混匀，抽取在带螺口的20ml金属注射器中，针头为15号，在猪下颌骨最高点内侧1厘米处进针，深度约3cm，缓慢推进，注射过程中稍微向四周移动针头，直至凝胶全部注入，另外一侧同样操作。术中密切观察实验动物的状态，防止窒息。
手术完毕后，用多导睡眠仪检测脑电图、口鼻气流、鼾声、胸式呼吸、腹式呼吸、血氧饱和度，监测两小时，醒后送回笼中。一周后复查多导睡眠图，检测前肌注安定2ml/kg体重，检测指标同上，监测两小时后送回笼中。
手术后二周再次用戊巴比妥钠静脉麻醉，行电子计算机断层扫描，部位为咽腭弓平面上下5cm。
手术过程中监测鼾声、口鼻气流、胸腹呼吸及耳动脉血氧饱和度，实验猪逐渐出现鼾声，手术结束后动物呼吸暂停或低通气及血氧饱和度下降，一周后复查上述指标，呼吸暂停时间、呼吸暂停指数均较术后当天明显增加，血氧饱和度明显下降，这种现象正是人类重度睡眠呼吸暂停综合症患者的特征。
图1为注入聚丙烯酰胺水凝胶的情况下未经手术的小型猪的多导睡眠图，图2为注入聚丙烯酰胺水凝胶的情况下经手术后一周的实验猪的多导睡眠图，比较图1和图2可以看出，经手术后实验猪的呼吸明显紊乱，出现了典型的睡眠呼吸暂停现象。
图3注入聚丙烯酰胺水凝胶的情况下未经手术的猪的电子计算机断面扫描图，图4注入聚丙烯酰胺水凝胶的情况下手术后猪的电子计算机断面扫描图，比较图3和图4可以看出，经手术后在实用小猪的咽腔周围软组织中可见到大小不等的团状阴影，呈不规则形状，密度较均匀，咽腔结构变形，咽腔有狭窄。
因此，通过上述两个步骤可以获得冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型，手术过程中动物没有较大刺激，手术可以正常进行，术后动物同时患有冠心病和阻塞型睡眠呼吸暂停综合症，其病症与人类自然病理状态表现相似。
另外，在制作阻塞型睡眠呼吸暂停模型时，所注入的医用软组织填充剂可以为亲水性类人胶原蛋白，将该亲水性类人胶原蛋白10ml用0.9％生理盐水青霉素液稀释后通过外部注射在动物下颌骨最高点内侧1厘米处进针将其注入实施猪的脖颈内。手术完毕后，同样用多导睡眠仪检测脑电图、口鼻气流、鼾声、胸式呼吸、腹式呼吸、血氧饱和度，监测两小时，醒后送回笼中。一周后复查，监测两小时后送回笼中。图5为注入亲水性类人胶原蛋白的情况下未经手术的小型猪的多导睡眠图，图6为注入亲水性类人胶原蛋白的情况下经手术后一周的实验猪的多导睡眠图，比较图5和图6可以看出，经手术后实验猪的呼吸明显紊乱，出现了典型的睡眠呼吸暂停现象。
而且，本发明用于制作冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型的动物可以为体型中等的杂种狗。
本发明采用外部注射法制作阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的动物模型，对实验动物刺激性小，可实现在冠心病动物模型基础上进一步制作阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的动物模型，从而得到冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症的动物模型，因此，可以利用动物实验来进行阻塞型睡眠呼吸暂停与冠心病关系的机制研究，并能从生物化学、分子生物学、组织学、病理、影像学等诸多方面对睡眠呼吸暂停综合症与冠心病发病机制、病理生理及治疗学等领域的研究，为冠心病及睡眠呼吸暂停综合症的综合研究提供了一个强有力的工具。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型的制作方法，其包括使用导管法制作冠心病动物模型并根据所述动物的体重大小将有效量的医用软组织填充剂注入动物体内，以使动物出现阻塞型睡眠呼吸暂停症状，其中，所述医用软组织填充剂是通过外部注射法-注入到动物脖颈内的相应部位。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外部注射的进针部位为动物下颌骨最高点内侧1厘米处。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的医用软组织填充剂为医用聚丙烯酰胺水凝胶。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的医用软组织填充剂为亲水性类人胶原蛋白。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述注入动物脖颈内的医用软组织填充剂的用量为10ml。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的医用聚丙烯酰胺水凝胶用0.9％生理盐水青霉素液稀释后注入动物脖颈内的相应部位。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的亲水性类人胶原蛋白用0.9％生理盐水青霉素液稀释后注入动物脖颈内的相应部分。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的医用软组织填充剂可以一次性或分多次注入动物脖颈内的相应部位。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于制作冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型的动物为体型中等的小型猪。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于制作冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型的动物为体型中等的杂种狗。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在动物脖颈内注入医用软组织填充剂的过程在多导睡眠仪的检测下进行。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述多导睡眠仪用于检测动物的脑电图、口鼻气流、鼾声、胸式呼吸、腹式呼吸、血氧饱和度。
全文摘要
本发明公开一种冠心病合并阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型制作方法，包括用导管法制作冠心病动物模型的步骤及根据动物的体重大小将有效量的医用软组织填充剂注入动物体内，以使动物出现阻塞型睡眠呼吸暂停症状的步骤，所述注入医用软组织填充剂的步骤是通过外部注射法将其注入到动物脖颈内的相应部位。所述外部注射的进针部位为动物下颌骨最高点内侧1厘米处，所述医用软组织填充剂为医用聚丙烯酰胺水凝胶，用量为10ml。该方法在制作阻塞型睡眠呼吸暂停综合症动物模型时刺激性小，其稳定、重复性好、易于操作，所得动物模型病症接近于自然病理状态，能够从多层次、多方面进行睡眠呼吸暂停综合症与冠心病发病机制、病理生理及治疗学等领域的研究。
文档编号G09B23/00GK1979593SQ2005101262
公开日2007年6月13日 申请日期2005年11月30日 优先权日2005年11月30日
发明者张文莉, 王士雯, 赵玉生, 卢才义, 徐斌 申请人:中国人民解放军总医院