一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法与流程

文档序号:12097966阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)准备好相关实验试剂;

2)野生型小鼠和miR-144/451基因敲除的雄性小鼠各两只,通过繁殖得到大量的野生型小鼠和miR-144/451基因敲除鼠;

3)按照SPF级饲养标准饲养小鼠,湿度控制在40%-70%,温度控制在20-25℃,用已灭菌处理的饲料、垫料和饮水一周更换二到三次;

4)合笼方式为1只miR-144/451基因敲除的雄鼠和1-5只miR-144/451基因敲除的雌鼠交配进行繁殖,发现雌鼠有怀孕表现立即分笼生育,并及时记录生育出的小鼠父母系来源;

5)步骤4)中的小鼠DNA提取:取3周龄的小鼠尾部末端组织,长度为0.5cm,放入1.5ml EP管中,每管加l00μl裂解液,95℃,静置20分钟,冷却后加入l00μl中和液混匀,取以上的含鼠DNA的上清液用于PCR进行小鼠基因型鉴定;

6)小鼠DNA的PCR:下列反应物构成20μl的PCR反应体系:含鼠DNA的上清液2μl、引物1μl、DNA聚合酶混合物10μl、双蒸水7μl;上述材料混匀离心后置于PCR仪设定条件循环扩增:预变性,95℃,5分钟;变性,95℃,40秒;退火,60.5℃,40秒;延伸,72℃,1min;循环,72℃,5分钟;

7)进行琼脂糖凝胶电泳:取琼脂糖粉末0.75g加入50ml的TAE电泳缓冲液中,微波炉中加热至沸腾,将溶解澄清的琼脂物室温冷却至60℃加入Goldview 5μl或EB 3μl混匀,缓缓倒入已置好梳子的胶板中,室温放置30min,待凝胶完全凝固后轻轻拔出梳子;将制备好的1.5%琼脂糖凝胶放入电泳槽,加入1×TAE溶液至高出凝胶表面;取PCR反应终产物10μl加样到胶孔中,电压100V电泳,时间为30min;

8)凝胶成像:电泳结束后,取出凝胶置于凝胶成像分析仪下拍照,小鼠电泳基因型片段为:miR-144/451野生型小鼠为290bp、纯合子190bpheterozygous (-/+)250bp和190bp;

9)喂食:使用带有抗凝剂的玻璃毛细管从miR-144/451野生型小鼠小内眦静脉取血200微升,使用12#灌胃器将野生型小鼠的血液喂食给miR-144/451基因敲除型小鼠;

10)提取样本:在喂食3小时、6小时、12小时、24小时后,分别使用带有抗凝剂的玻璃毛细管从miR-144/451基因敲除型小鼠小内眦静脉取血200微升;

11)提取样本中的RNA:每0.1mL步骤10)得到的全血加入裂解液Trizolreagent 1 ml,大力混匀,静置5到10分钟;加入200μl氯仿,剧烈摇晃15s,静置5分钟;4℃,12000g离心15min;将上清转入新的EP管,加入500μl异丙醇,颠倒混匀后室温沉淀10min; 4℃,12000g离心20min;弃上清,加入1ml75%乙醇;4℃,12000g离心5min;弃上清,室温静置至干燥加入20μlDEPC水溶解;55℃水浴5min;

12)反转录RNA:配置反应液体系:步骤11)中得到的总RNA 1 ng、RTase Mix 1μl、5xReaction Buffer 5μl,使用ddH2O将反应体系补足至25μl;混匀后加温至37℃,而后保温60分钟,再加温至85℃,保温10分钟;

13)全血DNA的PCR:下列反应物构成20μl的PCR反应体系:步骤12)得到的全血DNA 2μl、上游引物2μl、下游引物2μl 、DNA聚合酶混合物10μl、双蒸水7μl;混匀离心后置于PCR仪设定条件循环扩增:预变性,95℃,5分钟;变性,95℃,40秒;退火,60.5℃,40秒;延伸,72℃,1min;循环,72℃,5分钟;

14)使用U6作为内参,判断miR-451的表达水平。

2.根据权利要求1所述的判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法,其特征是,步骤7)中,50ml的TAE电泳缓冲液由57.1ml的冰乙酸、242g的Tris-base、100ml浓度为0.5mol/L 的EDTA配制而成,并由双蒸水定容至1L。

3.根据权利要求1所述的判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法,其特征是,步骤7)中,1×TAE电泳缓冲液由10ml的50xTAE电泳缓冲液加双蒸水定容至500ml。

4.根据权利要求1所述的判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法,其特征是,步骤7)中,所述EB浓度为10mg/ml,由1g的EB、100ml的去离子水混匀溶解后避光保存,室温放置而制成。

5.根据权利要求1所述的判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法,其特征是,步骤5)中,所述裂解液由40μl的0.5M EDTA、25μl的10N NaOH、100ml的蒸馏水制成,并调节 PH 至 8.0。

6.根据权利要求1所述的判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法,其特征是,步骤5)中,所述中和液由4ml的1M Tris-HCl加蒸馏水定容至100ml。

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