一株表达赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建及表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明一株表达赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建及表达方法，属于生物工程 技术及酶学特征研宄领域。具体涉及两个方面：1. 一种产赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母及 其构建方法；2.重组赖氨酸氨肽酶酶学性质研宄。
【背景技术】
[0002] 赖氨酸氨肽酶作为一种外切型蛋白酶，在食品、医药和化工等多种领域都有很重 要的应用。可用于去除蛋白水解液中的苦味、蛋白质的深度水解、生物活性肽的制备及重组 蛋白固定剂或蛋白序列测定所需的工具酶等，在食品、医药保健与化工行业应用前景广阔。
[0003] 毕赤酵母，作为一种被广泛应用的宿主，已经成功的表达了上百种外源蛋白。它作 为一种真核表达宿主与原核相比有许多的优点：高密度发酵，遗传稳定性高，不易染菌，诱 导剂便宜，分泌表达等。毕赤酵母会对所表达的蛋白进行翻译后修饰，而这往往会使所表达 的蛋白酶的温度稳定性和酶催化效率有所提升。
[0004] 因此，实现铜绿假单胞菌赖氨酸氨肽酶在毕赤酵母中的表达将具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供将来源于铜绿假单胞菌的赖氨酸氨肽酶基因导入到毕赤酵母 中得到的基因工程菌的构建方法和基本酶学性质研宄。
[0006] 本发明的技术方案：一种胞外分泌表达来源于铜绿假单胞菌NJ-814 (CGMCC No. 7638)赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建方法，是将来源于铜绿假单胞菌NJ-814的 赖氨酸氨肽酶基因 PLAP导入到毕赤酵母GS115中得到的基因工程菌，简称为重组毕赤酵母 GS115/pPIC9K-PLAP。利用构建好的基因工程菌发酵制备重组赖氨酸氨肽酶，并研宄重组赖 氨酸氨肽酶的基本酶学性质。
[0007] 步骤为： (1) 用赖氨酸氨肽酶基因序列设计一对引物PU P2,以铜绿假单胞菌NJ-814基因组为 模板，P1、P2为引物扩增目的基因； 上游引物 Pl :5 ' -CCGGAATTCA TGGGCAAACC CTAACCC- 3 '，下划线表示 酶切 位点； 下游引物 P2 :5 ' -TCCCCTAGGT TACTTGATGA AGTCGTGACC CC- 3 '，下划线表示 JktII 酶切位点； (2) 将目的基因连接到表达载体pPIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-PLAP，转化万. JM109,涂布于含氨苄抗性的LB固体平板上，菌落PCR扩增目的基因、双酶切进行验证阳性 转化子，验证正确的重组载体PPIC9K-PLAP送去测序； (3) 测序正确的重组载体？？扣91(-?^^用你'/11进行单酶切，经酶切线性化之后，同毕 赤酵母感受态细胞混匀，进行电击转化，参数设置1500 V，400 Ω，25/50 μ F，4-6 ms;将电 转液涂布于MD平板，待菌长出来以后分别点接于丽及MD平板，获取重组毕赤酵母GS115/ PPIC9K-PLAP ； (4)筛选获得重组菌，进行表达验证。
[0008] 用所述的方法构建的重组毕赤酵母分泌表达赖氨酸氨肽酶的方法，所述分泌表达 方法如下： (1) 挑取MD平板上的单菌落于25 mL BMGY培养基中，30°C、230 rpm培养18h; (2) 将培养液置于提前灭过菌的离心管中离心收集沉淀，将沉淀重溶于25 mL BMMY培 养基中25°C培养120 h，每隔24 h向培养液中添加终浓度1. 5%的甲醇进行甲醇诱导； (3) 将获得的发酵液，10000 rpm离心5 min，即得赖氨酸氨肽酶粗酶液。
[0009] 所述赖氨酸氨肽酶基因 PLAP来源于铜绿假单胞菌NJ-814基因组，赖氨酸氨肽酶 基因 PLAP序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母菌株GS115。
[0011] 根据所述的重组毕赤酵母分泌表达赖氨酸氨肽酶的方法，将所得赖氨酸氨肽酶粗 酶液进行30%-40%的硫酸铵盐析，pH9. 0的Tris-HCl缓冲液透析过夜，之后进行特性研宄； 特性如下：其最适反应温度为80°C;在50-60°C条件下保温120min后，相对酶活仍高于80%， 具有良好的热稳定性；最适pH为9. 0,在pH 7. 0-9. 5之间相对稳定。
[0012] 根据所述的重组毕赤酵母分泌表达赖氨酸氨肽酶的方法，对重组赖氨酸氨肽酶的 底物特异性研宄表明：该酶对Lys-ρΝΑ水解能力最强，为Leu-pNA的1. 7倍。
[0013] 所述的铜绿假单胞菌NJ-814 (CGMCC No. 7638)，由本研宄室筛选并保存。该菌株 在已授权的专利"一株耐热氨肽酶的产生菌及该酶的纯化方法" ZL 201310253385. 8公开。
[0014] 所述编码赖氨酸氨肽酶基因的基因 PLAP序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0015] 赖氨酸氨肽酶酶活测定方法： 以L-亮氨酸-对硝基苯胺为底物，加入2 mL pH 9. 0的Tris-HCl缓冲液，I mL稀释 适当倍数的酶液和I mL底物（2 mM)，80°C反应10 min，在405 nm处测定吸光值，计算酶活 力。
[0016] 赖氨酸氨肽酶酶活定义： 在一定条件下，每分钟分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1 μΜ的对硝基苯胺所需要的 酶量，即为一个酶活单位。
[0017] 计算公式：
（其中Abs为405 nm处吸光值） 本发明的有益效果：本发明提供了一种产赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母及其构建方 法，该方法简单有效，构建的重组毕赤酵母能表达赖氨酸氨肽酶，能为后期研宄赖氨酸氨肽 酶的特性、结构等提供所需蛋白。
[0018] 本发明所构建的赖氨酸氨肽酶在重组毕赤酵母中的整合表达，不仅具有很好的遗 传稳定性，且表达的重组氨肽酶具有良好的温度稳定性，为氨肽酶的产业化和在食品领域 中的应用奠定了优良的基础。
【附图说明】
[0019] 图1赖氨酸氨肽酶（PLAP)的扩增结果（M !Marker，1、2 :目的基因） 图2重组质粒pPIC9K-PLAP的双酶切验证。
[0020] 图3重组毕赤酵母的筛选（MD及丽平板)。
[0021] 图4重组毕赤酵母表达SDS-PAGE (M !Marker ;1 :GS115原始菌；2 :重组毕赤酵母 上清液其中目的蛋白在55KD附近)。
[0022] 图5重组赖氨酸氨肽酶的最适pH。
[0023] 图6重组赖氨酸氨肽酶pH稳定性。
[0024] 图7重组赖氨酸氨肽酶最适反应温度。
[0025] 图8重组赖氨酸氨肽酶的热稳定性（以赖氨酸对硝基苯胺为底物)。
[0026] 图9重组赖氨酸氨肽酶底物特异性。
【具体实施方式】
[0027] 所用培养基： LB (g/L):胰蛋白胨 10,酵母膏 5, NaCl 10, pH 7.0; YPD (g/L):蛋白胨20,葡萄糖20,琼脂20; MD (g/L):葡萄糖 20,琼脂 20, YNB 13. 4,生物素 0.4; 丽（8/1):甲醇5 111171，琼脂20，￥他13.4，生物素0.4; BMGY (g/L):蛋白胨20,甘油10,酵母膏10, YNB 13. 4,生物素0.4,100 mM磷酸盐缓 冲液pH 6. 0 : BMMY (g/L):蛋白胨20,甲醇10,酵母膏10，YNB 13. 4,生物素0.4,100 mM磷酸盐缓 冲液pH 6. 0 ; 大肠杆菌万.co/iJM109、毕赤酵母GS115和pPIC9K载体由本研宄室保藏 T4 DNA连接酶、限制性内切酶feoR I和JktII以及共用Buffer购自宝生物工程(大 连）有限公司。
[0028] 实施例1胞外分泌表达赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建方法。
[0029] 为实现赖氨酸氨肽酶基因在毕赤酵母中的表达，以赖氨酸氨肽酶基因设计两对基 因引物。
[0030] 上游引物 Pl :5' -CCGGAATTCA TGGGCAAACC CTAACCC- 3 '(下划线表示 酶切位点）； 下游引物 P2 :5 ' -TCCCCTAGGT TACTTGATGA AGTCGTGACC CC- 3 '(下划线表示 JktII 酶切位点）； 以铜绿假单胞菌基因组为模板，Pl及P2为引物扩增目的基因。PCR体系为（50 μ L): PrimerSTAR酶 25 yL;基因组 IyL ;P1 IyL ;P2 lyL;ddH20 22 yL。PCR条件为：95 °C 预变性5 1^11;95°0变性15 8,55°0退火3〇8,72°0延伸9〇8;72°0后延伸5 1^11;35个循 环。
[0031] 将扩增获得的目的