一种高产l-亮氨酸菌株及其在发酵法生产l-亮氨酸的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高产L-亮氨酸菌株及其在发酵法生产L-亮氨酸的应用，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002]L-亮氨酸又称白氨酸，即α-氨基-γ -甲基戊酸、α-氨基异己酸，与缬氨酸、异亮氨酸同属于支链氨基酸，是人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八大必需氨基酸之
ο
[0003]L-亮氨酸具有多种生理功能，是临床选用的复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料，对维持危重病人的营养需要、抢救患者生命起着积极作用。另外，L-亮氨酸在食品、化妆品、农业上也具有广泛的应用。
[0004]L-亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法和发酵法。微生物发酵法条件温和、环境友好、产品质量稳定，是L-亮氨酸的主要生产方法。目前棒杆菌属、短杆菌属的L-亮氨酸生物合成途径及其调节机制已弄清，以鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、粘质赛氏杆菌(Serratia marcescens)、乳糖发酉孝短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、纯齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumf lavum)为出发菌株，均有选育出L-亮氨酸高产菌的文献报道。通常用谷氨酸产生菌如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等，诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏，达到过量积累L-亮氨酸的目的。生产L-亮氨酸的日本企业占主导地位，尤以日本味之素公司，其在亮氨酸产量和品质均具有明显优势。
[0005]如何提高L-亮氨酸产量、生产强度等，是目前亟需解决的问题。
【发明内容】
[0006]为了克服上述问题，本发明得到了一株L-亮氨酸高产菌株并利用其发酵法生产L-
亮氨酸。
[0007]本发明提供一种高效发酵法生产L-亮氨酸的方法，所述方法是将L-亮氨酸生产菌的种子液按8?12%的接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为30?35°C，控制pH为6.8?7.0，装液量为3L/7L，搅拌转速为600?700rpm，初始通气量为4.5L/min，培养56?60ho
[0008]所述发酵使用的发酵培养基，每L中含有:葡萄糖130?160g、玉米粉30g、(NH4)2S046.5g、MgS04.7H20 2g、DL_甲硫氨酸0.lg、L_异亮氨酸0.05g、生物素 100yg、维生素Βι 300μg、FeS04 0.02g、ZnS〇4 0.0lg MnS04 0.01g，Na0H调节pH至7.2。
[0009]所述种子液使用的种子培养条件为:取一环保存于斜面培养基中的菌株，接种于种子培养基，培养温度为30?35°C，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养14?18h。
[0010]所述L-亮氨酸生产菌为黄色短杆菌。[0011 ]所述L-亮氨酸生产菌为具有遗传标记的L-亮氨酸生产菌株FMME289，其遗传标记为蛋氨酸缺(MetO、异亮氨酸缺陷(11>)、磺胺胍(SGD、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TADj-羟基亮氨酸抗性(β-ΗΙ/)。
[0012]本发明的有益效果:
[0013]本发明以生产谷氨酸的黄色短杆菌G14(CICC编号20160)为出发菌株，提供了一种通过多重诱变筛选得到具有遗传标记(Met>I 1 eL+SGr+2-TAr+0-HLr)的高产L-亮氨酸的黄色短杆菌FMME289，该菌株生产稳定，重复性良好。
【附图说明】
[0014]图1:黄色短杆菌G14诱变图谱；
[0015]图2:HPLC检测亮氨酸标准样品；
[0016]图3:HPLC检测发酵液中亮氨酸。
【具体实施方式】
[0017]诱变处理和筛选过程中所用的各种培养基的组成:斜面和种子培养基:葡萄糖2g、酵母粉5g、胰蛋白胨10g、CaCl2 5g、琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1L，自然pH。
[0018]完全培养基:葡萄糖10g、酵母粉5g、胰蛋白胨10g、CaCl25g、琼脂粉15g，用蒸馏水定容至lL，pH自然。
[0019]基本培养基(MM):葡萄糖20g、(NH4)2S042.0g、MgS04.7H20 0.2g、CaCl2.2H200.01g、FeS04.7H20 0.001g、Na2HP04.12H20 1.5g，KH2P04l.5g，蒸馏水定容至 1L。
[0020]筛选培养基(CM):在MM培养基加支链氨基酸的结构类似物;在完全培养基的基础上添加抗性物质。
[0021 ]种子发酵条件:取一环保存于斜面培养基中的菌株，接种于种子培养基，培养温度为30?35°C，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养14?18h。
[0022]摇瓶发酵条件:将上述种子液按8?12%的接种量接种于装液量100mL/750mL摇瓶中，培养温度30?35°C，摇床转速200rpm，培养56?60h。
[0023]实施例1:蛋氨酸和异亮氨酸缺陷型菌株的筛选
[0024]将出发菌株黄色短杆菌G14用硫酸二乙酯进行诱变处理、中间培养、淘汰野生型、缺陷型筛选和鉴定等步骤，得到缺陷型菌株(Met—+11>)共计28株，将28株菌株进行摇瓶发酵55?60h，使用高效液量色谱(HPLC)检测，检测标准样样品和发酵样品的结果如图1和图2，L-亮氨酸产量最高的为G14-1-179，产量仅为3.7g/L。
[0025]实施例2:具有磺胺胍抗性突变株的筛选
[0026]将得到的菌株G14-1-179摇瓶发酵，适当稀释0D600至0.8?1.0，进行ARTP诱变处理，功率为80W，气流量为8SLM，处理时间为60s。然后收集菌体涂布于含有磺胺胍的18?28g/L的完全培养基上，挑取在此培养基上生长的突变株，摇瓶发酵55?65h，检测发酵液中L-亮氨酸产量，产量最高的为菌株G14-2-092，产量为12.9g/L。
[0027]实施例3:具有2-噻唑丙氨酸抗性突变株的筛选
[0028]将G14-2-092菌株摇瓶发酵，适当稀释0D600至0.8?1.0，进行ARTP诱变处理，功率为80W，气流量为8SLM，处理时间为60s。然后收集菌体涂布于含有2-噻唑丙氨酸10?12g/L的完全培养基上，挑取在此培养基上生长的突变株，摇瓶发酵55?65h，检测发酵液中L-亮氨酸产量，产量最高的为菌株G14-3-232，产量为20.6g/L。
[0029]实施例4:具有β-轻基亮氨酸抗性突变株的筛选
[0030]将G14-3-232菌株摇瓶发酵，适当稀释0D600至0.8?1.0，进行ARTP诱变处理，功率为80W，气流量为8SLM，处理时间为60s。然后收集菌体涂布于含有β-羟基亮氨酸10?12g/L的完全培养基上，挑取在此培养基上生长的突变株，摇瓶发酵55?65h，检测发酵液中L-亮氨酸产量，产量最高的为菌株FMME289，产量为27.9g/L。
[0031 ] 实施例5:FMME289菌株发酵生产L-亮氨酸
[0032]取一环保存于斜面培养基中的FMME289菌株，接种于种子培养基，培养温度为32°C，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养14?18h。
[0033]将种子液按12%的接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为30°C，控制pH为6.8?7.0，装液量为3L/7L，搅拌转速为700rpm，初始通气量为4.5L/min，培养60h，L-亮氨酸产量达到38.5g/L，生产强度达0.642g/(L.1ι)，糖酸转化率为28.2%，比发酵培养条件和发酵培养基优化前，产量提高了 24.2 %、转化率提高了 27 %。
[0034]发酵培养基(L):葡萄糖130?160g、玉米粉30g、(NH4)2S04 6.5g、MgS(k.7H20 2g、DL-甲硫氨酸0.1g、L-异亮氨酸0.05g、生物素lOOyg、维生素300yg,FeS04 0.02g,ZnS040.0lg MnS04 0.018，他0!1调节口!1至7.2。
[0035]实施例6:FMME289菌株发酵生产L-亮氨酸
[0036]取一环保存于斜面培养基中的FMME289菌株，活化后得到种子液。将种子液按8%的接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为35°C，控制pH为6.8?7.0，装液量为3L/7L，搅拌转速为600rpm，初始通气量为4.5L/min，培养60h，L-亮氨酸产量达到35.0g/L，糖酸转化率为26.0 %。比发酵培养条件和发酵培养基优化前，产量提高了 12.9 %、转化率提高了22.9%。
[0037]发酵培养基(L):葡萄糖130?160g、玉米粉30g、(NH4)2S04 6.5g、MgS04.7出0 2g、DL-甲硫氨酸0.1g、L-异亮氨酸0.05g、生物素 100yg、维生素300yg,FeS04 0.02g,ZnS040.0lg MnS04 0.018，他0!1调节口!1至7.2。
[0038]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1.一种高效发酵法生产L-亮氨酸的方法，其特征在于，所述方法是将L-亮氨酸生产菌的种子液按8?12%的接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为30?35°C，控制pH为6.8?7.0，装液量为3L/7L，搅拌转速为600?700rpm，初始通气量为4.5L/min，培养56?60ho2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-亮氨酸生产菌为黄色短杆菌。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-亮氨酸生产菌为具有遗传标记的L-亮氨酸生产菌株FMME289，其遗传标记为蛋氨酸缺(MetO、异亮氨酸缺陷(11>)、磺胺胍(SGD、2_噻唑丙氨酸抗性U-TAO、β-羟基亮氨酸抗性(β-ΗΙ/)。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基，每L中含有:葡萄糖 130?160g、玉米粉30g、(NH4)2S〇4 6.5g、MgS04.7H2O 2g、DL_甲硫氨酸0.lg、L_异亮氨酸0.05g、生物素lOOyg、维生素Bi 300yg、FeS〇4 0.02g、ZnS〇4 0.0lg MnS04 0.01g，Na0H调节pH至7.2。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子液使用的种子培养条件为:取一环保存于斜面培养基中的菌株，接种于种子培养基，培养温度为30?35°C，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养14?18h。6.根据权利要求1-5任一所述方法得到的亮氨酸。7.权利要求6所述亮氨酸在食品、化妆品、农业、制备药物方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种高产L-亮氨酸菌株及其在发酵法生产L-亮氨酸的应用，属于生物工程领域。本发明提供了一株具有遗传标记的高产L-亮氨酸的黄色短杆菌FMME289，该菌株为蛋氨酸和异亮氨酸缺陷型，同时具有支链氨基酸和磺胺胍抗性。在7L发酵罐中培养60h，L-亮氨酸产量达到35.0～38.5g/L，糖酸转化率为26.0％～28.2％，该菌株能够高效积累L-亮氨酸，且遗传稳定、重复性良好。
【IPC分类】C12R1/13, C12P13/06
【公开号】CN105441501
【申请号】CN201511020699
【发明人】刘立明, 刘佳, 罗秋玲
【申请人】江南大学, 无锡宸明生物技术有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月30日