吡啶并吡嗪类化合物、其制备方法及医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物化学领域，具体涉及一系列吡啶并吡嗪化合物，这些化合物通过 激活细胞内的核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路，介导细胞内的应激系统对外来的氧化 和亲电刺激进行抵御，使细胞损伤的修复成为可能，可用于炎性疾病及相关疾病的治疗和 癌症化学预防。
【背景技术】
[0002] 核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)属 于碱性亮氨酸拉链转录因子，相对分子量为66kD，可通过调控关键的细胞保护型蛋白实现 对体内防御系统和细胞稳态的精确调控，在细胞防御外界的氧化和亲电刺激中扮演着重要 的作用。在正常的生理情况下，Nrf2在胞浆内被持续的Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1 (Kelch-1 ike ECH-associated protein-1，Keapl)介导的泛素化降解，保持着低水平。当受 到氧化或亲电刺激时，Keapl上的半胱氨酸被氧化或烷基化，其构象发生改变，从而不利于 Nrf2的泛素化降解，Nrf2胞浆含量得到累计，进而转入细胞核内，引发抗氧应激元件 (antioxidant response element，ARE)基因的表达，进而表达下游细胞保护型蛋白，常见 的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)、NAD(P)H醌氧化还原酶 1 (NAD (P)H: quinone oxidoreductase-l，NQ01)、血红素氧合酶-1 (hemo oxygenase-1，H0_1)等。 因此，激活Keapl-Nrf2-ARE信号通路具有抗氧化应激、抗炎等多种功能，使细胞损伤的修复 成为可能，已被认为是一种重要的炎性疾病、癌症化学预防的策略。癌症的化学预防是指用 天然、合成或生物学试剂来逆转、抑制或阻止初级癌变以及肿瘤细胞在癌症中的发展，包括 促进致癌物的排除、抑制炎症和癌细胞的细胞增殖、侵袭、血管生成等。
[0003] 针对Keapl-Nrf2-ARE信号通路，目前研究最为成熟的当属亲电型Nrf2激活剂，它 们通过共价修饰Keap 1上的半胱氨酸的巯基，使得Nrf 2得以激活。以两个最有名的药物富马 酸二甲酯和⑶D〇-Me为例，富马酸二甲酯，2013年被Π )Α批准为治疗成人多发性硬化症的一 线药物，它和它的代谢产物富马酸单甲酯已被证明可在体内和体外有效激活Nrf2,使得神 经元细胞和星型胶质细胞可以抵抗氧化应激所引起的细胞损伤和死亡。CDDO-Me，开始被用 于治疗2型糖尿病引起的慢性肾病，但是由于增加了病人的心血管意外的风险而终止于临 床3期，后来又发现其具有治疗肺动脉高压的作用，新的临床2期试验已经启动。这两个药物 有一个共同的特点:含有α，β-不饱和酮结构，这种迈克尔受体结构可以与Keapl的的半胱氨 酸发生共价反应，使得Keap 1发生变构，抑制了Nrf2的泛素化降解，进而激活Nrf2。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一类Nrf2激活剂，其具有α，β-不饱和酮结构，首次构建了吡啶并吡 嗪类的化合物骨架，并引入一系列侧链，合成了一系列衍生物。药理学实验表明本发明化合 物在ARE荧光素酶报告基因实验中可以激活Nrf2下游基因 ARE的活性，可以上调细胞保护型 蛋白H0-1和NQ01，且没有细胞毒性，理化性质测试表明本发明化合物的透膜性和溶解度良 好，因此，本发明的化合物有望开发成治疗炎性疾病及相关疾病和癌症化学预防药物。
[0005] 本发明的吡啶并吡嗪类化合物具有通式I所示的结构：
[0006]
[0007] 其中R代表&-C6直链烷基、C3-C7环烷基、含有1个双键的C3-C7环烯基、Y取代的含有 1-2个选自N、0、S的五元或六元杂环、Y取代的含有1-2个选自N、0、S的苯并杂环、萘基或Z取 代的苯基，其中，Y取代基选自Η、&-C4烷基、&-C4烷氧基、氨基、&-C4烷氨基或卤素;Z取代基 选自H、&-C4烷基、&-C4烷氧基、卤素、硝基、氨基、Q-C4烷氨基、酰胺基、羟基、苯基、吗啉基 或哌啶基；
[0008] 其中Ar存在或者不存在，Ar代表0
[0009] R优选代表正丙基、叔丁基、环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环己-1-烯-1-基、呋 喃-2-基、噻吩-2-基、噻唑-2-基、吡啶-3-基、吡嗪-2-基、1H-吲哚-3-基、喹啉-3-基、5-氯噻 吩-2-基、5-甲基呋喃-2-基、苯并呋喃-2-基、苯基、萘-2-基、甲氧基取代的苯基、卤素取代 的苯基、硝基取代的苯基、[1，1'_二苯]-4-基、4-吗啉基苯基或苯并[d][l，3]二氧戊环-5- 基。
[0010] 本发明的化合物可以用下列制备方法得到：
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[0012] 其中R定义同前。
[0013] 原料II与草酸二乙酯发生缩合反应得到中间体III，反应中还应加入甲醇钠，反应 溶剂为甲醇，反应温度优选70~90°C，反应时间优选3.5~4.5h。
[0014] 接着，目标化合物由中间体III和商业购买或自己合成的原料IV发生环合反应得 到，反应中还应加入醋酸，反应溶剂为乙醇，反应温度优选80~90°C，反应时间优选1.5~ 2.5h〇
[0015] 通式I的化合物可以采用常见的分离方法进行纯化，如重结晶、柱层析等。
[0016] 本发明也包括通式I化合物的水合物、立体异构体、溶剂化物和药学上可接受的盐 等。它们具有与通式I化合物同样的药理活性。
[0017] 本发明所述的化合物可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片 剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂、针剂，可以加入香料、甜味剂、液体或固体填料或稀释剂 等常用药用辅料。
[0018] 本发明所述的化合物在临床上的给药方式可以采用口服、注射等方式。
[0019]本发明的化合物临床所用剂量为O.Olmg~lOOOmg/天，也可根据病情的轻重或剂 型的不同偏离此范围。
[0020] 本发明的化合物对Nrf2下游ARE基因具有激活活性;不存在细胞毒性作用，可以安 全用于肿瘤的化学预防阶段;对细胞保护型蛋白H0-UNQ01具有诱导作用；具有较好的成药 性参数，如透膜性等。
[0021] 下面是本发明化合物的药理学实验和理化性质测试实验及结果，该部分的化合物 代号所对应的结构式等同于实施例部分的代号所对应的结构式。
[0022] 一、ARE荧光素酶报告基因诱导性评价
[0023] ARE荧光素酶报告基因实验方法:该实验使用HepG2-ARE-C8细胞，这是一个在ARE (Nrf2调节的二相酶启动子处有一段共有的序列ARE)下游稳转入一段荧光素酶报告基因的 细胞株，只要化合物对细胞内的ARE有激活作用，那么它也将激活荧光素酶，荧光素酶催化 荧光素底物氧化反应产生光能从而被机器捕捉到，通过检测光强度来检测化合物的诱导性 强弱。具体的实验方法为:在96孔板中以4 X 105/mL接种细胞，每孔100yL，培养过夜，本发明 的化合物和阳性参照化合物分别配制相应浓度，加入96孔板，每孔100yL，设三复孔，作用 12h后，吸出培养基并用roS漂洗细胞，每孔加入30yL IX裂解缓冲液，冰上裂解15min，吸取 20yL上清液，使用luminoskan ascent(Thermo scientific，USA)检测，检测时每孔加入 100 yL荧光素酶检测试剂，立即读数，最后测得的数据与影响参照DMS0组相除得到比值，比值越 大，说明诱导性越好。实验中以tBHQ组和SFN组为阳性对照，DMS0组为阴性对照，细胞培养裂 解试剂作为背景值。
[0024]其中，tBHQ是特丁基对苯二酚，其在体内可被氧化为含有α，β-不饱和酮的结构，进 而发挥Nrf2激活作用。SFN是异硫氰酸酯类Nrf2激活剂的代表。它们是目前针对Nrf2靶点最 常用的温和的ARE荧光素酶基因的阳性参照。各个化合物对ARE基因的诱导情况如表1所示。
[0025 ]表1本发明代表化合物对ARE焚光素酶报告基因的诱导情况 [0026]
[0027] 由表1可以看出本发明化合物可以显著激活Nrf2下游的ARE基因，在1 ΟμΜ浓度下， 对ARE基因的诱导倍数几乎均高于常见的Nrf2激活剂的对照物tBHQ。
[0028] 二、细胞毒性评价
[0029] 细胞毒性实验方法:MTT染色法，噻唑兰(Me thy lthiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide，MTT)，也称作溴化噻唑蓝四氮唑，是一种可接受氢离子的化合物染料，带正电荷， 具有细胞膜渗透性。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源进入的MTT还原成为水不 溶性的深蓝色MTT-甲臜结晶，而死细胞不具有此功能。甲臜结晶是不能穿透细胞膜，因此 沉积在处于增殖且未受损伤的细胞内。甲臜结晶可用DMS0溶解出来，酶标仪下测定562nm的 吸光度反映甲臜的生成量，而甲臜的生成量与活细胞数目成正比，用以评估细胞存活状况， 因此检测光密度值(0D值)越大，细胞活性越强。具体的实验方法为:在96孔板中以8X10 4/ mL接种，每孔100yL，培养过夜，本发明的化合物配制相应浓度，每孔100yL，设六个浓度梯 度，每个浓度设三个复孔，作用24h后，每孔加入20yL PBS配置的5mg/mL的MTT溶液，37°C孵 箱放置4h，除去所有液体，每孔加入150yL DMS0，在震荡仪上震荡10min，用酶标仪在波长 562nm下检测光密度值(0D)。以含细胞和DMS0的孔为阴性对照，以只含培养基的孔为空白对 照。各个化合物的细胞毒性结果如表2所示。
[0030] %抑制率=1 -(化合物孔0D值-空白孔0D值)/ (阴性孔0D值-空白孔0D值）
[0031 ] 用Graphpad Prism 5软件处理，计算化合物的IC50。
[0032]表2本发明代表化合物的细胞毒性评价
[0033]
[0034]
[0035] 由表2可以看出本发明部分化合物IC5Q几乎都在100μΜ以上，无细胞毒性，可以安全 用于肿瘤的的预防阶段，而且也可以用于佐证上述的荧光素酶报告基因实验的活性没有受 到细胞损伤所造成的影响。
[0036] 三、Western Blot检测化合物对目的蛋白的影响
[0037]实验方法:蛋白免疫印迹Western Blot，将细胞接种于细胞瓶内，孵育过夜，将不 同浓度的化合物加入的细胞瓶中，作用8h或者24h后，收集细胞，使用细胞裂解液进行细胞 破碎提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，制作实验所需蛋白样品，依次进行SDS-PAGE凝胶电泳， 转膜，封闭，分别对目的条带进行一抗4°C孵育过夜，TBS缓冲液洗涤，二抗室温孵育2h，应用 Odyssey Infrared Imaging System进行目的条带检测。H0-1和NQ01是Nrf2下游研究最多 的细胞保护蛋白，作为本次实验的目的蛋白进行检测。
[0038]化合物对H0-1和NQ01表达水平的影响情况见图1.
[0039]由图1可以看出化合物3 g可以明显的上调H0-1和NQ01的表达水平，对NQ01的影响 比HO-1明显，在50μΜ时，对HO-1的上调作用开始显现，在10 ΟμΜ时，对NQO1的上调作用优于阳 性参照tBHQ;化合物2c也可以上调NQ01的表达水平，50μΜ时，NQ01的上调效果明显。
[0040]四、化合物的理化性质测试
[0041 ]化合物的解离常数(pKa)、脂水分布系数(LogD，pH = 7.4)是根据经典的Avdeef-Bucher电位滴定的方法在