新型氨肽酶及其基因的制作方法

专利名称：新型氨肽酶及其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及氨肽酶以及编码该酶的基因。
背景技术：
在制造酱油、豆酱、其他含有蛋白质水解物的天然调味品中，要使用曲菌。例如，酱油是经过制曲和发酵2个阶段制造的。在制曲阶段，主要通过曲菌(曲霉属(Aspergillus)丝状菌)生产的酶来分解原料。此时，为了使酱油的呈味性更好，重要的是要增加各味中的游离氨基酸的量。
氨基酸是原料蛋白质经过2阶段而生成的。第一阶段是蛋白质通过蛋白酶作用释放肽，第二阶段是肽酶催化的肽的水解，生成氨基酸。
关于曲菌的肽酶，报告了来源于米曲霉(Aspergills oryzae)和酱油曲霉(Aspergills sojae)的肽酶(特开平11-346777号、DE95-1952648、WO9851163、WO9628542、WO9615504、WO9851803、WO9814599)。其中显示了酱油制造过程中亮氨酸氨肽酶的重要性。但是，至今已知的亮氨酸氨肽酶中并未见报告具有耐盐性。另外，关于曲霉属的亮氨酸氨肽酶的基因，虽然有海附等(特开平11-346777号)的酱油曲霉的报告，但关于该酶的耐盐性并没有报告。
另外报告了芽孢杆菌属(Bacillus)中有具耐盐性的亮氨酸氨肽酶(Lee，G.D.等、J.Appl.Microbiol.(1988)，85(3))。
浅野等注意到，在大豆发芽过程中，可在非常短的时间内将种子中的贮藏蛋白分解为氨基酸，从大豆子叶中发现了肽酶类(有效分解含有酸性氨基酸的肽的氨肽酶GX和亮氨酸氨肽酶类)，成功地进行了大豆蛋白质的有效水解(特开平9-294583号)。
大豆的氨肽酶GX从其酶学各特性来看，是至今尚未见报告的新型的氨肽酶，除发芽大豆以外，尚不知其存在。大豆氨肽酶GX具有从在N末端具有谷氨酸等酸性氨基酸的肽中，有效地释放N末端的酸性氨基酸的活性。因此通过该酶的作用，可以制造游离谷氨酸含量高、呈味性优异的酱油。
二宫等采用基因重组技术，成功地大量生产了大豆的氨肽酶GX(特开2000-325090)，但将通过该方法生产的大豆氨肽酶GX用于酱油酿造，则有GMO问题、成本问题等困难。
发明的公开本发明的目的在于提供来源于曲菌的氨肽酶及编码该氨肽酶的基因，所述氨肽酶对制造游离氨基酸含量高、呈味性优异的酱油或蛋白质分解物有效。
本研究人为了解决上述课题，进行了深入的研究，以与来源于大豆的氨肽酶GX基因具有同源性的构巢曲霉(A.nidulans)EST作为探针，对构巢曲霉的基因组DNA文库进行筛选，成功地获得了编码来源于构巢曲霉的新型氨肽酶的DNA，从而完成了本发明。
即，本发明是下述(A)～(D)的任一项表示的蛋白质(A)具有序列表SEQ ID NO2氨基酸编号1～519所表示的氨基酸序列的蛋白质；(B)具有序列表SEQ ID NO4氨基酸编号1～510所表示的氨基酸序列的蛋白质；(C)由序列表SEQ ID NO2氨基酸编号1-519所表示的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列构成，且具有催化从肽的N末端释放氨基酸的反应的活性的蛋白质；(D)由序列表SEQ ID NO4氨基酸编号1～510所表示的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列构成，且具有催化从肽的N末端释放氨基酸的反应的活性的蛋白质。
另外本发明是关于编码上述(A)～(D)任一项的核酸分子、包含该核酸分子的重组核酸分子、转化微生物宿主以及使用该转化微生物宿主的氨肽酶的制备方法。本发明特别包括作为转化微生物宿主的转化丝状菌，即转化曲菌。
另外，本发明是具有下述1)～8)的性质的氨肽酶。
1)分解N末端含有亮氨酸、甲硫氨酸的肽或蛋白质，释放亮氨酸或甲硫氨酸。
2)最适pH为约7.0～7.5。
3)最适温度为约37～45℃。
4)以在不存在食盐条件下的活性为100％时，在3M食盐浓度下也显示80％以上的残存活性。
5)以在0℃、食盐不存在、保存24小时的条件下的活性为100％时，在0℃、3M食盐存在、保存24小时的条件下显示80％以上的残存活性。
6)以pH7.5、0℃、保存24小时条件下的活性为100％时，在pH5.8～9.5范围、0℃、保存24小时的条件下显示60％以上的残存活性。
7)通过非变性PAGE显示分子量约550kD，通过还原、加热SDS-PAGE显示分子量为22、33kD的。
8)活化时需要钴离子或锌离子。
附图简要说明

图1是显示PepE活性的温度依赖性的图。横轴是温度，纵轴是假设37℃时的活性值为100，亮氨酸氨肽酶活性的相对值。
图2是显示反应液中的食盐浓度对PepE的影响的图。横轴是NaCl浓度(M)，纵轴是假设未添加NaCl时的活性值为100，各NaCl浓度下的亮氨酸氨肽酶活性的相对值。
图3是显示PepE活性的pH依赖性的图。横轴是pH，纵轴是假设磷酸钾缓冲液(pH7.5)中的活性值为100的亮氨酸氨肽酶活性的相对值。
实施发明的最佳形式如上所述，本发明是氨肽酶的制备方法，其特征在于使用来源于曲菌的氨肽酶、编码该氨肽酶的核酸分子以及包含上述核酸分子的重组DNA转化的微生物宿主，并培养该转化微生物宿主。在本说明书中，将本发明来源于曲菌的氨肽酶蛋白质记为PepE，将编码PepE的基因记为pepE。另外，在本说明书中，“氨肽酶”是指具有催化从肽的N末端依次释放氨基酸的反应的活性的蛋白质。
编码本发明氨肽酶的核酸分子可以从构巢曲霉的染色体DNA或cDNA获得。具体地说，可以从构巢曲霉，例如构巢曲霉A26菌株的染色体DNA文库获得。可以参考来源于发芽大豆的氨肽酶GX(特开2000-325090)的基因序列和构巢曲霉EST数据库中同源性高的EST片段的核苷酸序列，制备PCR(聚合酶链式反应)引物，以构巢曲霉染色体DNA文库为模板，通过PCR法获得含有本发明的核酸分子的克隆。PCR引物可以例举具有SEQ ID NO6和7所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
另外，本发明的核酸分子可以通过例如以具有SEQ ID NO8和9所示的核苷酸序列的寡核苷酸为引物的PCR，再通过以具有SEQ IDNO10和11所示的寡核苷酸为引物的5’-RACE，由构巢曲霉的聚合(A)RNA构建的cDNA文库获得。如上所述得到的含有编码来源于构巢曲霉A26的PepE的基因的基因组DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO1中。另外，cDNA的核苷酸序列和氨基酸序列示于SEQ ID NO2中，单独的氨基酸序列示于SEQ ID NO3。比较基因组DNA与cDNA的核苷酸序列，结果在基因组DNA中未发现有内含子。
本发明的核酸分子只要编码本发明的氨肽酶即可，除具有由SEQID NO2所示的核苷酸序列中核苷酸编号72～1628构成的核苷酸序列的DNA之外，也包含除去了5’末端不需要部分的核酸分子。“核酸分子”中也包括DNA、RNA和它们的类似物。根据使用的目的，也可以是只编码成熟蛋白质的核酸分子。另外，在编码区，将编码各氨基酸的密码子置换为编码同一氨基酸的其他的等同的密码子，这也包含在本发明的核酸分子中。并且，只要是无损所编码的氨肽酶的活性，本发明的核酸分子也可以编码在1个或多个位置上包含1个或多个氨基酸置换、缺失、插入、添加或倒位的氨肽酶。这里，“多个”根据肽酶蛋白质的立体结构中氨基酸残基的位置和种类不同而不同，通常为2～300个，优选2～170个，进一步优选2～50个，最优选2～10个。
编码与上述的氨肽酶实质上相同的蛋白质的核酸分子，可以通过例如定点诱变法，改变pepE的核苷酸序列，使特定部位的氨基酸发生置换、缺失、插入、添加而获得。另外，上述改变了的核酸分子也可以通过已知的诱变处理而获得。诱变处理可以例举用羟胺等对编码PepE的DNA进行体外处理的方法；将带有编码PepE的DNA的埃希氏菌属(Escherichia)细菌通过紫外线照射、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸等常规人工诱变所使用的诱变剂进行处理的方法。
另外，上述核苷酸的置换、缺失、插入、添加或倒位等中，也包括因曲菌的菌种或菌株的差异等而天然发生的变异。通过将具有上述变异的核酸分子在适当的细胞中表达，并研究表达产物的PepE活性，可以获得编码与PepE实质上相同的蛋白质的核酸分子。另外，通过从编码具有变异的PepE的核酸分子或带有该核酸分子的细胞中，分离与例如序列表SEQ ID NO2中记载的核苷酸序列中由核苷酸编号72～1628构成的核苷酸序列的核酸分子在严谨条件下杂交、且编码具有PepE活性的蛋白质的核酸分子，可以获得编码与PepE实质相同的蛋白质的核酸分子。这里所说的“严谨性条件”是指形成所述特异性杂合体的条件。该条件与每个序列的GC含量和重复序列的有无等相关，因而难以明确地确定数值，但可以以一例说明同源性高的核酸分子，例如具有65％以上同源性的核酸分子彼此杂交、而同源性低的核酸分子彼此不杂交的条件；或者可以例举通常的DNA印迹杂交的洗涤条件60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选在相当于0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度下杂交的条件。在这样的条件下杂交的基因中，可能会包含中途存在终止密码子、由于活性中心的突变而失活的基因，不过，这些基团可以通过与市售的活性表达载体连接，用后面描述的方法测定PepE活性而简单地除去。
另外，本发明的核酸分子也可以从曲霉属的其他种的微生物，例如米曲霉的染色体DNA或cDNA获得。具体地说，可以通过PCR法，从米曲霉例如米曲霉RIB40(ATCC42149)的cDNA文库获得。可以根据上述构巢曲霉的PepE核苷酸序列，合成PCR用的寡核苷酸引物，通过以米曲霉例如米曲霉RIB40的菌体构建的cDNA文库为模板的PCR法进行制备。作为PCR的引物，例如包括具有用于5’-RACE法的SEQ ID NO12和13所示的核苷酸序列、用于3’-RACE法的SEQ IDNO14和15所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
将对应于如上得到的米曲霉RIB40的pepE的基因cDNA的核苷酸序列和氨基酸序列示于SEQ ID NO4，单独的氨基酸序列示于SEQ IDNO5。SEQ ID NO2所示的构巢曲霉的PepE的氨基酸序列与SEQ IDNO4所示的米曲霉所对应的氨肽酶的氨基酸序列具有约77％的同源性，在成熟蛋白质部位，约有120个氨基酸残基不同。在编码区，米曲霉的pepE对应基因与构巢曲霉的pepE的同源性为约71％。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的核酸分子包括编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质由序列表的SEQ ID NO4中氨基酸编号1～510所表示的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸构成、且具有催化从肽中释放氨基酸的反应的活性。另外，本发明的另一实施方案中，本发明的核酸分子包括与具有由序列表的SEQ ID NO4所示的核苷酸序列中核苷酸编号73～1602构成的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交、且编码具有催化从肽释放氨基酸的反应的活性的蛋白质的核酸分子。
在以下所示的实施例中，本发明的核酸分子是如上所述得到的DNA。其核苷酸序列已清楚，因此可以通过PCR或杂交等方法，从构巢曲霉A26或米曲霉RIB40，或者构巢曲霉或米曲霉的其他菌株的基因组DNA中容易地克隆编码这些菌株所对应的氨肽酶的核酸分子。因此，这样的核酸分子也在本发明的范围。
本发明的核酸分子可以应用于本发明的氨肽酶的制备。
本发明的核酸分子可以应用于曲菌等丝状菌的育种或氨肽酶PepE的制备。例如，在本发明的一个实施方案中，通过优选以多拷贝方式将编码本发明的氨肽酶的DNA引入丝状菌(例如米曲霉)细胞内，可以增加PepE的活性。另外，通过使本发明的核酸分子在适当的宿主中表达，可以制备PepE。可以将这样得到的曲菌等丝状菌或由此得到的PepE应用于酱油、豆酱及其他含有蛋白质水解物的调味品等的制造。
引入本发明的核酸分子的丝状菌有米曲霉、黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉等曲霉属；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)等链孢霉属；曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)等根毛霉属(Rhizomucor)的丝状菌。特别优选曲霉属丝状菌。
对于用于将本发明的核酸分子引入上述丝状菌的载体并无特别限定，可以使用丝状菌育种等通常使用的载体。例如，用于米曲霉的载体有pUNG(Lee，B.R.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，44，425-431(1995))、pMARG(Tsuchiya，K.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，40，327-332(1993))、pUSC(Gomi，K.等，Agric.Biol.Chem.51，2549-2555(1987))等。pUNG具有互补米曲霉niaD300(Minetoki，T.等，Curr.Genet.30，432-438(1996))的niaD-(硝酸同化缺损型)的标记，pMARG具有互补米曲霉M2-3(Gomi，K.等，Agric.Biol.Chem.，51(9)，2549-2555(1987))的argB-(精氨酸需求)的标记，pUSC具有互补米曲霉NS4(Yamada，O.等，Biosci.Biotech.Biochem.，61(8)，1367-1369(1997))的sC-(ATP硫酸化酶缺损型)的标记。
在这些载体中，pUNG和pMARG具有葡糖淀粉酶基因(glaA)的启动子和α-淀粉酶基因(amyB的终止子)，通过在该启动子的下游符合可读框地插入本发明的DNA(例如含有SEQ ID NO2中核苷酸编号72～1628的区)，可以在该启动子控制下表达PepE。另外，pUSC不含启动子，因此使用该载体时，通过用插入了本发明DNA的pUC19等质粒与pUSC共转化来引入丝状菌宿主，从而可表达PepE。
另外，可以根据丝状菌宿主的不同，分别使用下述表1所示文献中记载的载体、启动子和标记。表1中，以启动子天然控制下的基因所编码的酶名称来表示启动子。
表1文献 启动子 标记丝状菌宿主特表平4-503450号中性α-淀粉酶 黑曲霉argB黑曲霉argB构巢曲霉trpC构巢曲霉amdS构巢曲霉pyr4粗糙链孢霉DHFR粗糙链孢霉特开昭62-272988TaKa-淀粉酶米曲霉天冬氨酸蛋白酶 曼赫根毛霉脂酶 曼赫根毛霉葡糖淀粉酶、脂酶 黑曲霉淀粉酶、葡糖淀粉酶、纤维素酶蛋白酶、糖酵解酶特开平7-51067 TaKa-淀粉酶曲霉属特开平7-115976 记载了新型启动子序列 米曲霉特开平7-59571 记载了新型启动子序列 米曲霉日本农艺学会志 α-淀粉酶(anyB)米曲霉Vol.71，No.10(1997)
1018-1023葡糖淀粉酶(glaA) 米曲霉葡糖苷酶(agdA) 米曲霉丝状菌的转化除了上述文献所记载的方法之外，还可以采用任何公知的方法。例如米曲霉可以如下进行的转化。
将菌体(分生孢子)接种于DPY培养基(2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％酵母膏、pH5.0)，在30℃剧烈振荡培养24小时左右。将培养液用Myracloth(CALBIO CHEM公司制造)或灭菌的纱布等过滤，回收菌体，用灭菌水洗净，充分沥干水分。将该菌体移入试管，加入酶液(1.0％Yatalase、(宝酒造(株)制造)、或0.5％NovoZyme(Novo Nordisk公司制造)和0.5％纤维素酶(例如Cellulase Onozuka、Yakuit公司制造)、0.6M(NH4)2SO4、50mM苹果酸、pH5.5)，在30℃平缓振荡3小时左右。在显微镜下观察原生质体形成的程度，如果良好则在冰中保存。
将上述酶反应液用Myracloth过滤，除去菌体残渣，向含有原生质体的滤液中加入等量的缓冲液A(1.2M山梨糖醇、50mM CaCl2、35mMNaCl2、10mM Tris-HCl、pH7.5)，置于冰中。在0℃以1,500～2,500rpm将其离心5～10分钟，然后缓慢停止，用缓冲液A清洗沉淀，使其悬浮于适量的缓冲液A中。向100～200μl的原生质体悬浮液中加入20μl以下的DNA溶液(5～10μg)，置于冰中20～30分钟。加入250μl缓冲液B(60％聚乙二醇6000、50mM CaCl2、10mM Tris-HCl、pH7.5)，使其缓慢混合，再加入250μl缓冲液B，缓慢混合，然后再次加入850μl缓冲液B，缓慢混合，在室温下静置20分钟。之后，加入10ml缓冲液A，颠倒试管，在0℃以1,500～2,500rpm离心5分钟～10分钟，将沉淀悬浮于500μl缓冲液A中。
将适量的上述悬浮液加入事先分装并保温的5ml上层琼脂中，铺在底层培养基(含有1.2M山梨糖醇，根据标记不同而配制的选择性培养基)之上，在30℃下培养。将生长的菌体继代接种于选择性培养基，检查是否为转化体。更优选从菌体中制备重组DNA，通过限制酶分析或DNA印迹分析，确认已引入本发明的DNA。
通过将上述得到的转化体在适合所使用的启动子的条件下培养，使pepE表达，得到PepE。例如，将米曲霉作为宿主，使用葡糖淀粉酶启动子作为启动子时，将转化米曲霉孢子悬浮于含有麦麸、磷酸钾等的培养基中，在约30℃下培养3天左右，可以产生PepE。根据需要，用蒸馏水等稀释培养物，用ストマツカ-等进行处理，可得到含有PepE的酶粗提液。得到的粗提液使用凝胶过滤、各种层析等，可以进一步纯化PepE。得到的PepE再通过盐析、等电沉淀、凝胶过滤、离子层析、反相层析等纯化，可以用于蛋白质的分解。不过，将因引入本发明的核酸分子而PepE活性得到提高的转化微生物的培养物与蛋白质分解酶一起，直接与蛋白质原料混合，作用于蛋白质或其混合物，可以得到游离氨基酸含量高、呈味性强的蛋白质水解物。所作用的蛋白质原料可以有例如大豆、小麦、小麦谷蛋白等，还可以是脱脂大豆或进行了溶胀、增溶等加工的各种蛋白质、或从这些原料中分离的蛋白质。
可以通过测定吸光度来测定PepE活性，例如向0.75ml 1mM Leu-pNA(50mM磷酸钠缓冲液、pH7.5)中加入0.02ml酶粗提液、0.015ml100mM氯化锌，37℃反应10分钟，加入40％乙酸0.25ml，使反应终止，然后测定反应液在405nm的吸光度。各种制备物中的活性可以以每分钟生成1μmol对硝基苯胺的酶活性作为1单位(U)进行比较。
将转化微生物的培养物或粗制酶作用于蛋白质的实际应用条件可以是例如在蛋白质分解酶存在的条件下，将转化微生物的培养物混合到0.2～50％浓度的蛋白质原料中，在5～60℃下反应4小时～10天。
反应结束后，未反应的蛋白质原料、菌体等不溶物质可以用离心或过滤等传统的分离方法除去。另外，也可以根据需要通过减压浓缩、反渗透法等进行浓缩，浓缩物可以通过冷冻干燥、减压干燥、喷雾干燥等干燥处理制成粉末或颗粒。从而可获得游离氨基酸含量高、呈味性强的蛋白质水解物。
实施例实施例1.构巢曲霉pepE基因组DNA的克隆根据来源于发芽大豆的氨肽酶GX的序列，使用构巢曲霉的EST数据库(http//www.genome.ou.edu/fungal.html)进行同源搜索时，发现了同源性高的EST obd03al.fl。
如下所述，在该信息的基础上，从构巢曲霉基因组文库进行构巢曲霉pepE的克隆。
构巢曲霉基因组文库由Fungal Genetics Stock Center(Kansas City，USA)购入。该文库是用限制酶将构巢曲霉的基因组DNA切断，然后连接到粘粒载体，引入大肠杆菌(Escherichia coli)而成。文库的筛选如下进行。即，以含有粘粒载体的大肠杆菌作为模板DNA源，通过使用根据EST obd03al.fl的核苷酸序列合成具有下述序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR，筛选包含靶基因的大肠杆菌克隆。
(5’末端用引物)CTC AAA CGG CCA CAT GAC TAC (SEQ ID NO6)(3’末端用引物)GTC T GT TCA AGT GCA TAG CCT G(SEQ ID NO7)<序列表独立文本>
SEQ ID NO6、7PCR引物PCR反应是94℃3分钟热变性后，将94℃30秒、52℃10秒、72℃30秒的反应进行25个循环。结果，在4个克隆中含有靶基因。由这些克隆中回收粘粒载体，测定核苷酸序列。将该核苷酸序列以及由该核苷酸序列编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO2中，单独的氨基酸序列示于SEQ ID NO3。
将该基因插入质粒pUC19，用得到的质粒转化的大肠杆菌JM109菌株以专用编号AJ13856，于2001年3月19日保藏于经济产业省产业技术综合研究所生命工学工业技术研究所(现在的独立行政法人 产业技术综合研究所特许生物寄托中心、日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6、邮政编码305-8566)，保藏号为FERM P-18263，于平成14年(2002年)3月11日，在该中心移交为国际保藏，保藏编号FERM BP-7949。
实施例2、构巢曲霉的pepE cDNA的克隆将构巢曲霉A26用50ml YG培养基(0.5％酵母膏、2.5％葡萄糖、0.1％微量元素*、pH6.5)，30℃振荡培养48小时(微量元素*0.1％FeSO4·7H2O，0.88％ZnSO4·7H2O，0.04％CuSO4·5H2O，0.015％MnSO4·4H2O，0.01％Na2B4O7·10H2O，0.005％(NH4)6MoO24·4H2O)。
回收菌体，用液氮冷冻后用研钵粉碎。用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司制造)，从粉碎物中进行总RNA的制备，用Micro FASTTrack Kit(Invitorogen公司制造)进行mRNA的制备。用cDNA合成试剂盒(Promega公司制造)由该mRNA合成cDNA，用cDNA PCR LibraryKit(TaKaRa公司制造)进行cDNA文库的构建。
以cDNA文库作为模板，以根据构巢曲霉基因组DNA序列设计的具有下述序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR和5’-RACE，进行pepEcDNA的克隆。
(5’末端用引物)CAC CAC CAT GAG TCT AAC TTG G(SEQ ID NO8)(3’末端用引物)GTC TGT TCAAGT GCA TAG CCT G (SEQ ID NO9)(5’-RACE用的5’末端引物)CGT GGT ACC ATG GTC TAG AGT (SEQ ID NO10)(5’-RACE用的3’末端引物)ATT CGC AGT AAG CCT GCG AG (SEQ ID NO11)<序列表独立文本>
SEQ ID NO8～11PCR引物PCR的反应条件是94℃9分钟的热变性后，将94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的反应进行30个循环，再进行72℃5分钟的反应。结果，由使用SEQ ID NO8和9的引物的PCR得到约1800bp的DNA片段，由使用SEQ ID NO10和11的引物的5’-RACE得到约250bp的扩增片段。这些DNA片段的核苷酸序列和由核苷酸序列推断的氨基酸序列示于SEQ ID NO2。
将上述构巢曲霉pepE cDNA片段插入pBluescript，用得到的质粒转化的大肠杆菌JM109菌株以专用编号AJ13857，于2001年3月19日保藏于经济产业省产业技术综合研究所生命工学工业技术研究所(现在的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心、日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6、邮政编码305-8566)，保藏号为FERMP-18264，于平成14年(2002年)3月11日，在该中心移交为国际保藏，保藏编号FERM BP-7950。
实施例3.米曲霉的pepE同源cDNA的克隆(1)米曲霉cDNA文库的构建将米曲霉RIB40(ATCC42149)用50ml DPY培养基，在30℃培养64小时。过滤并收集菌体，共回收1g。将该菌体立即用液氮冷冻，用研钵粉碎，然后用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司制造)得到总RNA。用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia公司制造)从该RNA中纯化mRNA，通过cDNA PCR文库试剂盒(TaKaRa公司制造)或用于cDNA末端快速扩增的3’-RACE系统(GIBCO BRL)构建cDNA文库。
(2)米曲霉cDNA文库的筛选参考实施例2中得到的构巢曲霉的PepE序列，通过以SEQ IDNO12和13表示的寡核苷酸作为引物的5’-RACE，和使用SEQ IDNO14和15的3’-RACE，对米曲霉的pepE进行同源cDNA克隆。
(5’-RACE用的5’末端引物)CGT GGT ACC ATG GTC TAG AGT(SEQ ID NO12)(5’-RACE用的3’末端引物)CAT GGG CCC AAT GGT TCC GC (SEQ ID NO13)
(3’-RACE用的5’末端引物)CCA GAT TCG TAA TGA CTC CCG (SEQ ID NO14)(3’-RACE用的3’末端引物)CTA CTA CTA CTA GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC(SEQ IDNO15)<序列表独立文本>
SEQ ID NO12～15PCR引物5’-RACE的PCR反应是94℃9分钟的热变性后，将94℃30秒、53℃30秒、72℃1分钟的反应进行35个循环。由此得到约1400bp的米曲霉pepE片段。3’-RACE的PCR反应是95℃9分钟的热变性后，将94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟的反应进行35个循环。由此得到约300b的米曲霉pepE同源基因片段。
测定了上述基因片段的核苷酸序列，发现含有全长pepE同源序列。将该核苷酸序列和由该核苷酸序列编码的氨基酸序列示于SEQ IDNO4。另外，单独的氨基酸序列示于SEQ ID NO5。
将该基因序列插入质粒pBluescript，用得到的质粒转化的大肠杆菌DH5α菌株以专用编号AJ13858，于2001年3月19日保藏于经济产业省产业技术综合研究所生命工学工业技术研究所(现在的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心、日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6、邮政编码305-8566)，保藏号为FERM P-18265，于平成14年(2002年)3月11日，在该中心移交为国际保藏，保藏编号FERMBP-7951。
实施例4、米曲霉中pepE的表达(1)转化米曲霉的制备将实施例3中得到的米曲霉pepE cDNA连接到pBluescript的SmaI位点，制成质粒pBSAopepE。用EcoRI、XbaI从该质粒中切出pepEcDNA，连接到含有标记基因niaD的载体pUNG1(Lee，B.R.等，AppliedMicrobiology Biotechnology，44，425-431(1995))的葡糖淀粉酶启动子的下游，制成转化用质粒pNGAPE。用10μg该质粒DNA进行转化。
将米曲霉niaD300菌株的分生孢子接种于DPY培养基，在30℃振荡培养24小时。用灭菌的纱布过滤培养液，回收菌体，用灭菌水洗涤。将该菌体移入试管，加入20ml酶液(1.0％Yatalase、(宝酒造(株)制造))，在30℃平缓振荡3小时。在显微镜下观察原生质体形成的程度，在冰中保存。
将上述酶反应液用Myracloth过滤，除去菌体残余物，向含有原生质体的滤液中加入等量的缓冲液A(1.2M山梨糖醇、50mM CaCl2、35mMNaCl、10mM Tris-HCl、pH7.5)，置于冰中。在0℃以1,500rpm离心5分钟，然后缓慢停止，用10ml的缓冲液A清洗沉淀2次，使其悬浮于1ml的缓冲液A中。
向100μl原生质体悬浮液中加入10μl DNA溶液(10μg)，置于冰中30分钟。加入250μl缓冲液B(60％PEG(聚乙二醇)6000、50mM CaCl2、10mM Tris-HCl、pH7.5)，使其缓慢混合，再加入250μl缓冲液B，缓慢混合，然后再次加入850μl缓冲液B，缓慢混合，在室温下静置20分钟。之后，加入10ml缓冲液A，颠倒试管，在0℃以1,500rpm离心5分钟，将沉淀悬浮于500μl的缓冲液A中。
将上述悬浮液加入事先分装并保温的5ml上层琼脂中，覆盖在Czapek Dox培养基(1.2M山梨糖醇、0.3％硝酸钠、0.2％氯化钾、0.1％磷酸钾、0.05％硫酸镁7水合物、0.002％硫酸亚铁7水合物、2％葡萄糖、pH5.5)之上，在30℃下培养。将生长的10株菌体继代接种于Czapek Dox培养基，得到稳定的转化体。
(2)pepE的产生将如上所述得到的转化体在麦麸中培养，对其提取液进行氨肽酶活性测定。
将20g麦麸、0.3g磷酸钾、14ml蒸馏水充分搅拌，然后装入三角烧瓶，在120℃下高压灭菌30分钟，制备培养基。向充分形成了孢子的培养皿中注入8ml灭菌水，搅拌，配制孢子悬浮液，将其散布于上述培养基上。将接种了孢子的培养基充分混合，在30℃培养3天。向上述制备的麸曲中加入10倍量的蒸馏水，用ストマツカ-处理5分钟，得到酶粗提液。
如上所述制备的酶粗提液中的氨肽酶活性如下测定。即，向0.75ml1mM Leu-pNA(50mM磷酸钠缓冲液、pH7.5)中加入0.02ml酶粗提液、0.015ml 100mM氯化锌，在37℃反应10分钟，然后加入0.25ml 40％乙酸，使反应终止。通过测定反应液在405nm的吸光度，测定活性。活性是以每分钟生成1μmol的对硝基苯胺的酶活性作为1个单位(U)。作为对照，对用只含标记基因的载体DNA进行转化得到的转化体，也同样地制备酶粗提液，按照上述方法测定氨肽酶活性。
结果可见，在引入本发明基因的菌株中，氨肽酶活性显著上升(表2)。因而显示了引入的氨肽酶基因可实际表达，产生了氨肽酶。
表2酶粗提液中的氨肽酶活性

实施例5.PepE的特性分析(1)pepE的纯化将20g麦麸培养基装入300ml烧瓶，在120℃高温灭菌20分钟，制备培养基。
配制实施例4中制备的PepE高表达转化菌株的孢子悬浮液，将其接种于上述培养基。将接种了孢子的培养基充分混合，在30℃培养5天。中途培养48小时后需搅拌培养基。
将如上所述制备的麸曲浸泡于10倍量(w/w)的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)、1mM EDTA、1mM PMSF(苯甲磺酰氟)，在4℃静置16小时，然后用纱布过滤和离心(4℃、10分钟、7,500rpm)，得到的上清液作为酶粗提液。
向该酶粗提液中加入硫酸铵，得到40％-60％硫酸铵沉淀部分。将该沉淀溶解于20mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)中。用0.45μm孔径的过滤器过滤。预先用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)、150mM NaCl平衡脱盐柱(Amersham Pharmacia制造HiTrap Desalting(25ml))，将上述滤液过柱，用同一缓冲液洗脱。将得到的活性部分进行超滤浓缩。
接着，预先用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)平衡阴离子交换柱(Amersham Pharmacia制造HiTrap Q-sepharose HP(25ml))，将上述得到的试样吸附于柱上，用3倍量柱体积的同一缓冲液洗涤。洗净后，从0M至1M线性增加缓冲液NaCl的浓度，以柱体积的20倍量进行洗脱。将在洗出液中回收的活性部分进行超滤浓缩。
用HiLoad 26/60 Superdex 200pg(Amersham Pharmacia制造)，通过凝胶过滤层析来分组分离所得到的试样。预先用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)、150mM NaCl平衡该柱，将试样过柱，用同一缓冲液洗脱，回收活性部分。通过以上操作得到纯化PepE。
(2)PepE活性的测定该酶液的氨肽酶活性测定如下进行。即，向0.73ml底物溶液(1mMLeu-pNA、50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)、2mM氯化钴)中加入0.02ml酶粗提液，在37℃反应10分钟，加入0.25ml 40％乙酸，使反应停止。测定该反应液在405nm的吸光值，计算活性值。另外，活性是以每分钟生成1μmol的对硝基苯胺的酶活性作为1个单位(U)。
以下显示该酶的酶学各特性。
(i)底物特异性在上述活性测定法中，用X-pNA代替Leu-pNA，测定各种X-pNA的分解活性。以Leu-pNA的分解活性为100，相对活性显示在下表(表3)中。可知该酶有效分解N末端含有Leu的肽。
表3PepE的底物特异性

(ii)最适温度在上述活性测定方法中，在各种温度下测定LAP活性。以37℃的活性值为100，相对活性显示在图1中。
(iii)反应液中食盐浓度的影响在上述活性测定方法中，测定添加各种浓度NaCl时的LAP活性。以NaCl未添加组的活性值为100，相对活性显示在图2中。可知该酶在高浓度的食盐条件下保持充分的活性。
(iv)最适pH在上述活性测定方法中，将各种pH缓冲液加入反应液中，使最终浓度为50mM，以此来代替50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)。以磷酸钾缓冲液(pH7.5)中的LAP活性为100。各pH中的活性显示在图3中。
(v)pH稳定性将纯化酶在50mM各种pH缓冲液中，0℃保存24小时，然后用上述活性测定方法(pH7.5)测定LAP活性。以在pH7.5磷酸缓冲液中保存时的活性值为100，相对活性值显示在表4中。
表4PepE的pH稳定性

(vi)在食盐溶液中的稳定性将纯化酶在0℃、0-4M NaCl、20mM磷酸缓冲液(pH7.5)中保存24小时，然后测定在与保存盐浓度相同的盐浓度的反应液中的活性。结果显示在表5中。
表5PepE在食盐溶液中的稳定性

(vii)金属离子的影响在上述活性测定方法中，用各种2价金属盐代替氯化钴，测定各种X-pNA的分解活性。以加入氯化钴时的Leu-pNA的分解活性为100，相对活性显示在表6中。
表6金属离子对PepE活性的影响

根据本发明，提供获得游离氨基酸含量高、呈味性强的蛋白质水解物的方法。特别提供在含有大量食盐的酱油酿造过程中，有效分解肽的氨肽酶以及编码该酶的核酸分子，由此可进一步提高酱油或蛋白质水解物的呈味性。
以可表达的形式引入本发明核酸分子的宿主，可以用于生产本发明的蛋白质。
序列表<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>新型氨肽酶和编码所述肽酶的基因<130>Y1J0140<150>JP2001-78930<151>2001-03-19<150>JP2001-293348<151>2001-09-26<160>15<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3383<212>DNA<213>Aspergillus nidulans<400>1gggagaagtg tcgcaggatc gagtgtttgt cagtgtgctg gtcacggagc cgagccaggt 60gcatattcag attgggcctg cagcatctag agtcttgatt gcaaaggagt ccggagtaaa 120tcactattcc gtgcctttcg acggacattc agggccggtg aggattgcga ttgtccgaca 180tggtagagaa gttaagaccg caacagggcc tgctataacg gaagagtgca cggacggtaa 240agtaaattgg aatgcatttg taggatcaag ttaatcgata taaaattgta ctagacacta 300aaagcgttgg gataaatggt atctagataa cttgtatgat gtttgcaata tcggggcctg 360ttatcgccag gcccggcctc ccagccactg ataagcgtca ctcctcagtt ctccgcatga 420ccgcatcttc cttcgctctt ctccaactct cctctctgtc gatgtcctct tcaccatctc 480tcttgtttcc atatccttag cctttctatt gcatttttat ttatcttttg aatatggcca 540agaaaattct gtctgacatc caccaccatg agtctaactt ggcttaccgc cagtatgccc 600agctgcctga aaccctccac ctcaactacc agcctcctac tgctactgca acccccgccg 660
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<221>CDS<222>(72)..(1628)<400>2tgtcctcttc accatctctc ttgtttccat atccttagcc tttctattgc atttttattt 60atcttttgaa t atg gcc aag aaa att ctg tct gac atc cac cac cat gag 110Met Ala Lys Lys Ile Leu Ser Asp Ile His His His Glu1 5 10tct aac ttg gct tac cgc cag tat gcc cag ctg cct gaa acc ctc cac 158Ser Asn Leu Ala Tyr Arg Gln Tyr Ala Gln Leu Pro Glu Thr Leu His15 20 25ctc aac tac cag cct cct act gct act gca acc ccc gcc gca cac acc 206Leu Asn Tyr Gln Pro Pro Thr Ala Thr Ala Thr Pro Ala Ala His Thr30 35 40 45agc ccg atc cca gag gca atc aac ccc gac gat tac tcg cag gct tac 254Ser Pro Ile Pro Glu Ala Ile Asn Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Ala Tyr
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<221>CDS<222>(73)..(1602)<400>4caggcttaaa ccgcattccg acaagatatc tagcctttaa actaagaaat tttccaactc 60ctagccttcg ac atg acc aaa agg agt gtc ctt gat ctc cgt gat tct gcc 111Met Thr Lys Arg Ser Val Leu Asp Leu Arg Asp Ser Ala1 5 10atg gct tat cgc ctg tcg gcc cag ctt cct gag ccc tcc cca gcc acc159Met Ala Tyr Arg Leu Ser Ala Gln Leu Pro Glu Pro Ser Pro Ala Thr15 20 25att gca acc cca gtg gcg agg agt ggc ccc ttc gcc ccg gaa gat tac207Ile Ala Thr Pro Val Ala Arg Ser Gly Pro Phe Ala Pro Glu Asp Tyr30 35 40 45
acg aaa cca tac tgc gaa ttc atg aca gca aac ccc aca atc ttt cac 255Thr Lys Pro Tyr Cys Glu Phe Met Thr Ala Asn Pro Thr Ile Phe His50 55 60gcc gtt gat ggt ttc acc agg cag ctc gaa agc cag gga tac aag cgc 303Ala Val Asp Gly Phe Thr Arg Gln Leu Glu Ser Gln Gly Tyr Lys Arg65 70 75ctt ccc gag cgc gag acg tgg aac tcc aag tta gag aag ggt ggg aag 351Leu Pro Glu Arg Glu Thr Trp Asn Ser Lys Leu Glu Lys Gly Gly Lys80 85 90tac tac gtc act cgg aat ggt agt gct ttc atc tca ttc tca att gga 399Tyr Tyr Val Thr Arg Asn Gly Ser Ala Phe Ile Ser Phe Ser Ile Gly95 100 105aga gat tat aaa agt ggc aat gga atg gcc att gtt gca ggt cat atc 447Arg Asp Tyr Lys Ser Gly Asn Gly Met Ala Ile Val Ala Gly His Ile110 115 120 125gat gca ctc acc gcc aaa ttg aag ccc gtg tcc aag ctg ccc aac aag 495Asp Ala Leu Thr Ala Lys Leu Lys Pro Val Ser Lys Leu Pro Asn Lys130 135 140gct ggc ttt tcc cag ctc gga gtt gcg ccc tac gca ggc gct ctg agt 543Ala Gly Phe Ser Gln Leu Gly Val Ala Pro Tyr Ala Gly Ala Leu Ser145 150 155gac aca tgg tgg gac cgc gat ctc tca ata ggt ggc cgt gtt ctg gtc 591Asp Thr Trp Trp Asp Arg Asp Leu Ser Ile Gly Gly Arg Val Leu Val160 165 170caa gac tcc aac acc ggg aaa gtc gag tcc aaa tta gtc aaa ttg gac 639Gln Asp Ser Asn Thr Gly Lys Val Glu Ser Lys Leu Val Lys Leu Asp175 180 185
tgg ccc att gct cgg atc cca acc ctg gca cct cat ttc ggg gct ccc 687Trp Pro Ile Ala Arg Ile Pro Thr Leu Ala Pro His Phe Gly Ala Pro190 195 200 205tcg caa ggc ccc ttc aac aaa gag act cag atg gtg cct ata att ggc 735Ser Gln Gly Pro Phe Asn Lys Glu Thr Gln Met Val Pro Ile Ile Gly210 215 220gtt gat aac tcc gat ctt ttc cag cag caa gcc cca tcc aag ata gat 783Val Asp Asn Ser Asp Leu Phe Gln Gln Gln Ala Pro Ser Lys Ile Asp225 230 235caa gac aac ggg atc aaa cct ggt aca ttt gca gcc acg caa ccg gaa 831Gln Asp Asn Gly Ile Lys Pro Gly Thr Phe Ala Ala Thr Gln Pro Glu240 245 250aag ctt gtc aaa gtc ata tcc aag gag ctt ggt atc aca gac tac agc 879Lys Leu Val Lys Val Ile Ser Lys Glu Leu Gly Ile Thr Asp Tyr Ser255 260 265tcg att ata agc tgg gag ctg gag ctg tat gac agt caa cca gca caa 927Ser Ile Ile Ser Trp Glu Leu Glu Leu Tyr Asp Ser Gln Pro Ala Gln270 275 280 285gtt ggt ggc ctg gac aag gac ctg att ttt gct ggt cgc att gac gat 975Val Gly Gly Leu Asp Lys Asp Leu Ile Phe Ala Gly Arg Ile Asp Asp290 295 300aag ctc tgc tgc tat gcc gct cag gaa gct ctg ctt gcc tca tcc gac 1023Lys Leu Cys Cys Tyr Ala Ala Gln Glu Ala Leu Leu Ala Ser Ser Asp305 310 315agt act tca act agc tct atc aag atg gtc ggt atg ttt gat gac gag 1071Ser Thr Ser Thr Ser Ser Ile Lys Met Val Gly Met Phe Asp Asp Glu320 325 330gaa att gga agc ctg ctt cgc cag gga gct cga tcc aac ttc atg agc 1119
Glu Ile Gly Ser Leu Leu Arg Gln Gly Ala Arg Ser Asn Phe Met Ser335 340 345agt gtc ata gag cgt att acg gaa gcc ttc tca ccc aat tac ggt cct 1167Ser Val Ile Glu Arg Ile Thr Glu Ala Phe Ser Pro Asn Tyr Gly Pro350 355 360 365aac gtg ctg tct caa act gtg gcg aac agc ttc ttc gtg tct tcg gac 1215Asn Val Leu Ser Gln Thr Val Ala Asn Ser Phe Phe Val Ser Ser Asp370 375 380gtc atc cat gcg gtc aat ccg aac ttc ctt ggt gtc tat ctt gag aac 1263Val Ile His Ala Val Asn Pro Asn Phe Leu Gly Val Tyr Leu Glu Asn385 390 395cat gct ccc cgt ctg aac gtc ggt gtg gcc gtc tcg gct gac tct aac 1311His Ala Pro Arg Leu Asn Val Gly Val Ala Val Ser Ala Asp Ser Asn400 405 410ggc cat atg aca aca gac agt gtg agc tac gga ttc atc aag cgt gtc 1359Gly His Met Thr Thr Asp Ser Val Ser Tyr Gly Phe Ile Lys Arg Val415 420 425gct gat cga tgt ggc tcg acc ttg cag gtc ttc cag att cgt aat gac 1407Ala Asp Arg Cys Gly Ser Thr Leu Gln Val Phe Gln Ile Arg Asn Asp430 435 440 445tcc cgt agt ggc ggg act att gga ccc atg acc agt tct cgc att ggc 1455Ser Arg Ser Gly Gly Thr Ile Gly Pro Met Thr Ser Ser Arg Ile Gly450 455 460atg agg gcc att gac gtg ggg atc ccg cag ttg agt atg cac agt atc 1503Met Arg Ala Ile Asp Val Gly Ile Pro Gln Leu Ser Met His Ser Ile465 470 475cgt gcg act acc ggt agt ttg gat ccg gga ttg ggt gtg aag ctg ttc 1551Arg Ala Thr Thr Gly Ser Leu Asp Pro Gly Leu Gly Val Lys Leu Phe
480 485 490aag ggc ttt ttc gac tat ttc gag gag gtg gac aag gaa ttt gca gat1599Lys Gly Phe Phe Asp Tyr Phe Glu Glu Val Asp Lys Glu Phe Ala Asp495 500 505ttc tgatgcgctc ctctggaata ctaggaaatg tttccatcga taagtatgca 1652Phe510ctatctggga ttccgatgtt ggatctg 1679<210>5<211>510<212>PRT<213>Aspergillus oryzae<400>5Met Thr Lys Arg Ser Val Leu Asp Leu Arg Asp Ser Ala Met Ala Tyr1 5 10 15Arg Leu Ser Ala Gln Leu Pro Glu Pro Ser Pro Ala Thr Ile Ala Thr20 25 30Pro Val Ala Arg Ser Gly Pro Phe Ala Pro Glu Asp Tyr Thr Lys Pro35 40 45Tyr Cys Glu Phe Met Thr Ala Asn Pro Thr Ile Phe His Ala Val Asp50 55 60Gly Phe Thr Arg Gln Leu Glu Ser Gln Gly Tyr Lys Arg Leu Pro Glu65 70 75 80Arg Glu Thr Trp Asn Ser Lys Leu Glu Lys Gly Gly Lys Tyr Tyr Val85 90 95
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290 295 300Cys Tyr Ala Ala Gln Glu Ala Leu Leu Ala Ser Ser Asp Ser Thr Ser305 310 315 320Thr Ser Ser Ile Lys Met Val Gly Met Phe Asp Asp Glu Glu Ile Gly325 330 335Ser Leu Leu Arg Gln Gly Ala Arg Ser Asn Phe Met Ser Ser Val Ile340 345 350Glu Arg Ile Thr Glu Ala Phe Ser Pro Asn Tyr Gly Pro Asn Val Leu355 360 365Ser Gln Thr Val Ala Asn Ser Phe Phe Val Ser Ser Asp Val Ile His370 375 380Ala Val Asn Pro Asn Phe Leu Gly Val Tyr Leu Glu Asn His Ala Pro385 390 395 400Arg Leu Asn Val Gly Val Ala Val Ser Ala Asp Ser Asn Gly His Met405 410 415Thr Thr Asp Ser Val Ser Tyr Gly Phe Ile Lys Arg Val Ala Asp Arg420 425 430Cys Gly Ser Thr Leu Gln Val Phe Gln Ile Arg Asn Asp Ser Arg Ser435 440 445Gly Gly Thr Ile Gly Pro Met Thr Ser Ser Arg Ile Gly Met Arg Ala450 455 460Ile Asp Val Gly Ile Pro Gln Leu Ser Met His Ser Ile Arg Ala Thr465 470 475 480Thr Gly Ser Leu Asp Pro Gly Leu Gly Val Lys Leu Phe Lys Gly Phe485 490 495
Phe Asp Tyr Phe Glu Glu Val Asp Lys Glu Phe Ala Asp Phe500 505 510<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>6ctcaaacggc cacatgacta c 21<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>7gtctgttcaa gtgcatagcc tg 22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物
<400>8caccaccatg agtctaactt gg22<210>9<211>22<212>DNA倱<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>9gtctgttcaa gtgcatagcc tg22<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>10cgtggtacca tggtctagag t 21<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物
<400>11aatcgcagta agcctgcgag 20<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>12cgtggtacca tggtctagag t 21<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>13catgggccca atggttccgc 20<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>14
ccagattcgt aatgactccc g 21<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>15ctactactac taggccacgc gtcgactagt ac 3权利要求
1.下述(A)～(D)的任一项所示的蛋白质(A)具有序列表SEQ ID NO2氨基酸编号1～519所示的氨基酸序列的蛋白质；(B)具有序列表SEQ ID NO4氨基酸编号1～510所示的氨基酸序列的蛋白质；(C)由在序列表SEQ ID NO2氨基酸编号1～519所示的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列构成，且具有催化从肽的N末端释放氨基酸的反应的活性的蛋白质；(D)由在序列表SEQ ID NO4氨基酸编号1～510所示的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列构成，且具有催化从肽的N末端释放氨基酸的反应的活性的蛋白质。
2.编码下述(A)～(D)任一项所示的蛋白质的核酸分子(A)具有序列表SEQ ID NO2氨基酸编号1～519所示的氨基酸序列的蛋白质；(B)具有序列表SEQ ID NO4氨基酸编号1～510所示的氨基酸序列的蛋白质；(C)由在序列表SEQ ID NO2氨基酸编号1～519所示的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列构成，且具有催化从肽的N末端释放氨基酸的反应的活性的蛋白质；(D)由在序列表SEQ ID NO4氨基酸编号1～510所示的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列构成，且具有催化从肽的N末端释放氨基酸的反应的活性的蛋白质。
3.权利要求2的核酸分子，所述核酸分子是下述(a)～(d)的任一项所示的DNA(a)含有由序列表SEQ ID NO2中记载的核苷酸序列中核苷酸编号72～1628构成的核苷酸序列的DNA；(b)含有由序列表SEQ ID NO4中记载的核苷酸序列中核苷酸编号73～1602构成的核苷酸序列的DNA；(c)与上述(a)的DNA在严谨性条件下杂交，且编码具有催化从肽的N末端释放氨基酸的反应的活性的蛋白质的DNA；(d)与上述(b)的DNA在严谨性条件下杂交，且编码具有催化从肽的N末端释放氨基酸的反应的活性的蛋白质的DNA。
4.权利要求3的核酸分子，所述核酸分子具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
5.一种重组核酸分子，所述核酸分子含有权利要求2的核酸分子。
6.一种转化微生物宿主，其中权利要求2的核酸分子以可表达的形式引入到所述转化微生物宿主中。
7.权利要求6的转化微生物宿主，所述转化微生物宿主是丝状菌或酵母或埃希氏菌属(Escherichia)细菌。
8.一种氨肽酶的制备方法，其特征在于培养权利要求7的转化微生物宿主，使引入到所述转化微生物宿主中的核酸分子表达，回收所产生的蛋白质。
9.具有下述1)～8)的性质的氨肽酶1)分解在N末端含有亮氨酸、甲硫氨酸的肽或蛋白质，释放出亮氨酸或甲硫氨酸；2)最适pH为7.0～7.5；3)最适温度为37～45℃；4)以在不存在食盐的条件下的活性为100％时，在3M食盐浓度下显示80％以上的残存活性；5)以在0℃、食盐不存在、保存24小时的条件下的活性为100％时，在0℃、3M食盐存在下、保存24小时的条件下显示80％以上的残存活性；6)以在pH7.5、0℃、24小时保存条件下的活性为100％时，在pH5.8～9.5范围、0℃、保存24小时的条件下显示60％以上的残存活性；7)在非变性聚丙烯酰胺凝胶上显示550kD的分子量，在变性聚丙烯酰胺凝胶上显示22、33kD的分子量；8)活化时需要钴离子或锌离子。
全文摘要
本发明的目的是提供来源于曲菌的可有效分解难分解的肽氨肽酶，以及编码该氨肽酶的基因。本发明提供来源于构巢曲霉的氨肽酶及编码该酶的核酸分子。本发明特别提供具有序列表SEQ ID NO2氨基酸编号1～519表示的氨基酸序列的蛋白质；或由在该氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列构成，且具有催化从肽的N末端释放氨基酸的反应的活性的蛋白质；以及编码上述蛋白质的核酸分子。
文档编号C12N9/62GK1501975SQ0280672
公开日2004年6月2日 申请日期2002年3月15日 优先权日2001年3月19日
发明者鲤渕恭子, 二宫大记, 小岛麻里, 上田要一, 丸山润一, 北本胜彦, 一, 彦, 记, 里, 鲤 恭子 申请人:味之素株式会社