专利名称：编码细胞分裂素合成相关蛋白质的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码细胞分裂素生物合成相关蛋白质的基因，以及其利用方法及其获得方法。
背景技术：
细胞分裂素是一种重要的植物激素，具有诱导细胞分裂、形成新芽、打破腋芽的休眠、防止老化、促进果实的肥大等各种各样的作用。细胞分裂素具有在腺嘌呤或腺苷的6位氮原子上连有二甲基烯丙基(异戊烯基)的结构，或者进一步将异戊烯基羟基化的结构作为基本骨架。在植物病原性的细菌中，已知含有细胞分裂素合成酶的细菌。其中，关于土壤杆菌属的细胞分裂素合成酶IPT和TZS，已知具有将二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的二甲基烯丙基转移到腺苷一磷酸(AMP)的6位氮原子上的活性。这步反应被认为是合成细胞分裂素的最重要的步骤。但是，植物具有的细胞分裂素合成酶，以及编码其的基因还没有被确定。
发明的公开本发明将提供编码催化细胞分裂素合成的酶的基因，以及通过其编码的蛋白质及其用途。另外，本发明还将提供确定该基因的方法。
本发明者们发现从鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)获得编码催化细胞分裂素合成的酶的新基因的方法，并得到了编码催化细胞分裂素合成的酶的新基因。
因此，本发明提供编码与细胞分裂素合成相关的蛋白质的基因。具体来说，是在植物中未被报道过的，催化细胞分裂素的导入腺嘌呤的N6位侧链的反应的酶。
更具体来说，本发明提供具有序列编号2、4、6、8、10、12或14记载的氨基酸序列，且编码与细胞分裂素合成相关的蛋白质的基因。本发明还提供具有在序列编号2，4，6，8，10，12，或14中经过1个或多个氨基酸的添加，缺失和/或被其他氨基酸置换而被修饰的氨基酸序列的，且编码与细胞分裂素合成相关的蛋白质的基因。更进一步，本发明提供序列编号1、3、5、7、9、11或13记载的核酸、特别是DNA或能与此部分在严格条件下杂交，并编码与细胞分裂素的合成相关的蛋白质的基因。
本发明还提供含有上述基因的载体。
本发明进一步提供通过上述载体被转化的宿主。该宿主可以是植物细胞，也可以是植物体。
本发明还提供将上述宿主进行培养，栽培，从而制备与细胞分裂素合成相关的蛋白质的方法。
本发明还提供将上述基因导入植物或植物细胞中，通过使该基因表达，从而调节植物或者植物细胞成长的方法。即、通过使该基因表达，来促进不定芽的形成、打破侧芽的休眠、防止花和叶的老化以及果实的成熟、提高花的持久性和维持光合作用、促进果实的肥大，防止落果、控制花成等，调节各种与细胞分裂素相关的生理功能。
附图的简单说明
图1是显示质粒pTK015的结构的图。
图2是通过pHM4-AtIPT5转化的鼠耳芥再生的植物体的照片。
发明的实施形态本发明者推定在细胞分裂素的合成中，催化在腺嘌呤骨架的N6位导入异戊烯基(二甲基烯丙基)的反应是限速步骤。作为编码与细胞分裂素合成有关的异戊烯基转移酶的基因，已知有根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefacients)的T-DNA编码的ipt(gene4)基因和Ti-质粒的vir区域中存在的tzs基因、假单胞菌属(Pseudomonas)的几种中存在的ptz基因、藤黄红球菌(Rhodococcus faciens)的ipt基因、以及草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)的etz基因。这其中，土壤杆菌属(Agrobacterium)的tzs和ipt，假单胞菌属(Pseudomonas)的ptz，红球菌属(Rhodococcus)的ipt基因产物在试管中显示出了DMAPPAMP二甲基烯丙基转移酶的活性。此外，多数生物都具有将异戊烯基从DMAPP转移到tRNA的酶。植物的细胞分裂素如果也是通过腺嘌呤骨架的异戊烯基化被合成的话，那么催化反应的酶也可能具有和上面提到的异戊烯基转移酶相同的序列。因此，我们首先比较了这些基因产物的氨基酸序列，找出了保守氨基酸残基。它的序列为GxTxxGK[ST]xxxxx[VLI]xxxxxxx[VLI][VLI]xxDxxQx[57.60][VLI][VLI]xGG[ST]。其中，x表示任意的氨基酸残基，用[]括起来的氨基酸残基表示其中的氨基酸残基的任意一种，[a，b]表示a或以上，b或以下数量的任意种类的氨基酸残基。
运用TAIR Pattern Matching program，我们检索了鼠耳芥的基因组序列，找出了被认为含有上述氨基酸序列的基因或推定的基因区域。这些基因有如下8个基因AT4g24650(基因组计划推定的基因区域的编号)、T20010_210(基因组计划推定的基因区域的编号)、T16G12(登录号AC068809)基因组克隆的29375-30301bp、MDB19.12(基因组计划推定的基因区域的编号)、MVI11.6(基因组计划推定的基因区域的编号)、T26J14.3(基因组计划推定的基因区域的编号)、F2J7.12(基因组计划推定的基因区域的编号)、AF109376这8个基因及推定基因中，AF109376的cDNA已经被克隆，并注明为tRNA异戊烯基转移酶的mRNA。其余7个基因中，T20010_210、MDB19.12、AT4g24650、MVI11.6、T26J14.3、F2J7.12的全长cDNA还没有分离出来，是推定基因，注明为可能是tRNA异戊烯基转移酶。至于T16G12(登录号AC068809)基因组克隆的29375-30301bp，还没有注明。
与AT4g24650、T20010_210、T16G12(登录号AC068809)基因组克隆的29375-30301bp相对应的cDNA、MDB19.12、MVI11.6、T26J14.3、F2J7.12的基因或推定基因分别被记为AtIPT4、AtIPT3、AtIPT5、AtIPT7、AtIPT8、AtIPT1、AtIPT6。另外，各碱基序列分别在序列编号1，3，5，7，9，11及13中显示，而与其对应的氨基酸序列分别在序列编号2，4，6，8，10，12及14中显示。
通常，在培养基中存在细胞分裂素时，鼠耳芥的愈伤组织会形成叶和芽(以下称为枝芽)，反之，如果不存在细胞分裂素的话，枝芽一点都不会形成，或者，即使形成的话，频率也非常低。因此，如果将基因导入愈伤组织中并使之表达时，如果愈伤组织在没有细胞分裂素存在的条件下，也能很好地形成枝芽的话，可认为导入的基因为细胞分裂素合成酶，或者是编码与细胞分裂素应答相关的蛋白质的基因。
或者，也可以将得到的基因用大肠杆菌或酵母等的基因表达系进行表达，通过测定酶活性，可确认得到的基因为细胞分裂素合成酶，或是编码与细胞分裂素应答相关的蛋白质的基因。
从以上可知，在本发明中，首次可分离·鉴定植物由来的细胞分裂素合成酶，或者编码与细胞分裂素合成相关的蛋白质的基因。
本发明还发现，植物的细胞分裂素合成酶可使DMAPP的DMA基转移到ATP和ADP上。
作为本发明的基因，例如，可列举编码序列编号2，4，6，8，10，12或14中记载的氨基酸序列的基因。但是，众所周知，具有通过多个氨基酸的添加，缺失和/或被其他氨基酸置换而被修饰的氨基酸序列的蛋白质，也可保持与原蛋白质相同的功能。因此，含有对于序列编号2，4，6，8，10，12或14中记载的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的添加，缺失和/或被其他氨基酸置换而被修饰的氨基酸序列的，且编码与细胞分裂素合成酶，或细胞分裂素合成活性相关的蛋白质的被修饰的基因，也同属于本发明的范畴。
这里，修饰的程度是指，通过本专利申请前成为公知技术手段的，例如，位点特异性诱变、PCR等方法，所能达到的可能的程度。在保持细胞分裂素合成酶，或与细胞分裂素合成相关活性的同时，成为修饰对象的氨基酸数目例如为100个或以下，例如为50个或以下，优选25个或以下，例如为10个或以下。
本发明还提供具有序列编号1，3，5，7，9，11或13中记载的碱基序列的核酸，以及能与此部分在严格条件下杂交的，且编码细胞分裂素合成酶或者具有与细胞分裂素合成相关的活性的蛋白质的DNA构成的基因。这里的严格条件是指，例如在5×SSC、50℃的条件下进行杂交的条件。另外，合适的杂交温度根据碱基序列以及碱基序列的长短而不同，可适当选择进行实施。
作为上述杂交对象的基因源，可使用从具有细胞分裂素合成酶，或具有与细胞分裂素合成相关活性的蛋白质的植物、微生物等制备得到的cDNA文库、基因组DNA文库等，例如，作为植物可列举鼠耳芥、玉米、杨树、矮牵牛花、烟草、水稻、番茄、桉树等。
如上得到的编码细胞分裂素合成酶，或者是与细胞分裂素合成相关的蛋白质的基因的碱基序列，与序列编号1，3，5，7，9，11或13中所示的碱基序列有50％或以上，60％或以上，优选70％或以上，或80％或以上，例如90％或以上的同源性。
编码具有序列编号2，4，6，8，10，12或14中所示的氨基酸序列的蛋白质的基因，如实施例中具体描述的一样，作为cDNA和基因组DNA，可以从鼠耳芥得到。
另外，编码具有被修饰过的氨基酸序列的蛋白质的DNA，可以以具有固有的碱基序列的DNA为基础，使用常用的位点特异性诱变或PCR法合成。例如，通过天然的cDNA或基因组DNA的限制性内切酶处理，得到希望修饰的DNA片段，然后以此为模板，用已导入希望变异部分的引物进行位点特异性诱变或PCR，从而得到导入了所希望的修饰后的DNA片段。最后将导入了该变异的DNA片段与编码目的蛋白质其他部分的DNA片段连接上即可。
或者，在要得到编码由缩短的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA时，可以将编码例如比目标氨基酸序列长的氨基酸序列，例如全长氨基酸序列的DNA用希望的限制性内切酶切断，其结果，在得到的DNA片段不编码目标氨基酸序列的全体时，则合成由不足部分的序列构成的DNA片段，然后将二者连接起来即可。
或者也可使用相对于具有序列编号2，4，6，8，10，12或14中记载的氨基酸序列的蛋白质的抗体，来得到细胞分裂素合成酶，以及具有细胞分裂素合成相关活性的蛋白质。也可使用抗体克隆其他生物的细胞分裂素合成酶，或者具有细胞分裂素合成相关活性的蛋白质。
因此，本发明还涉及含有上述基因的重组载体，特别是表达载体、以及被该载体转化的宿主。作为宿主，可以使用原核生物或真核生物。作为原核生物可以使用细菌、例如属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌，例如大肠杆菌(Escherichia Coli)，可以是芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等常用的宿主微生物。作为真核宿主可以是低等真核生物，如酵母或丝状真菌等真核微生物。作为酵母可以列举酵母属(Saccharomyces)微生物，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等，作为丝状真菌可以列举曲霉属(Aspergillus)微生物，如米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)，以及青霉属(Penicillium)微生物。进而，还可以用动物细胞或植物细胞。作为动物细胞可以使用小鼠、大颊鼠、猴、人等的细胞系，具体如COS细胞、Vero细胞、CHO细胞、L细胞、C127细胞、BALB/c3T3细胞、Sp-2/0细胞等。作为植物细胞可以使用烟草、鼠耳芥的培养细胞、杨属、桉属、合欢属等的培养细胞。
进而，昆虫细胞、如家蚕细胞(Bombyx mori)，或者家蚕的成虫本身也可用作宿主。此外，也可使用例如草地夜蛾(Spodopterafrugiprd)细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞。
作为表达载体，可以使用质粒，噬菌体，噬粒、病毒(杆状病毒(baculovirus)(昆虫中发现)、痘苗病毒(vaccinia virus)(动物细胞中发现)等)。
本发明的表达载体，依赖于要将其导入的宿主，含有表达控制区域、如启动子、终止子、复制起点等。作为细菌用表达载体的启动子，可使用1ac启动子，作为酵母用启动子，可以使用如甘油醛3-磷酸脱氢酶激酶启动子、PHO5启动子、adhI启动子、pqk启动子等，作为丝状真菌用启动子，可以使用淀粉酶启动子、trpC启动子等。
另外，作为昆虫用启动子，可以列举杆状病毒多角体蛋白(baculoviruspolyhedrin)启动子等，作为动物细胞用启动子，可以列举猿猴病毒(SimianVirus)40的早期及晚期启动子、CMV启动子、HSV-TK启动子或SRα启动子等。作为植物用启动子，可以列举花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaic virus)的35S启动子、胭脂碱(nopaline)合成酶的启动子，作为诱导型启动子，可以列举谷胱甘肽-S-转移酶II系基因的启动子、hsp80-启动子、二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因的启动子等。
另外，在表达载体中，一个优选的方案是使用除上述外，还含有增强子、拼接信号、poly A添加信号、选择标志(如二氢叶酸还原酶基因(氨基喋呤抗性)、neo基因(G418抗性)等的载体。另外，使用增强子时，在基因的上游或下游插入例如，SV40的增强子等。
通过表达载体进行的宿主转化中，可以使用本领域常用的方法进行，这些方法记载在例如，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley& Sons公司1995年版中。转化体的培养也可按照通常的方法操作。从培养物中纯化细胞分裂素合成相关蛋白质，可按照用于蛋白质分离、纯化的常用方法进行，例如，超滤，各种柱层析，例如使用琼脂糖的柱层析等。
按照现在的技术水平，在组成型或诱导型的启动子的调控下，连接该cDNA或基因，在使用土壤杆菌属的系统或使用基因枪、电穿孔等的系统，将该基因导入植物中使之表达，由此，在即使通过向培养基中加入植物激素来人为调节，个体再生也是困难的植物，如玫瑰等中，可以促进不定芽的形成。更进一步，通过调控编码细胞分裂素的合成相关的蛋白质的基因表达，可以调节细胞分裂素在植物中显示的各种生理功能，如侧芽的伸长、防止老化、开花期、促进果实的肥大、防止落果等。
实施例以下，通过实例，具体阐述本发明。分子生物学的手法，除非特别说明，依照Molecular cloning(Sambrook et al.1989)来操作。
实施例1、编码细胞分裂素合成相关蛋白质的基因的检索和分离将根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefacients)的tzs基因(ACCESSION X03933-1，PROTEIN_ID CAA27572.1)、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefacients)的ipt基因(ACCESSION AB025109-1，PROTEIN#ID BAA76344.1)、丁香假单孢菌(Pseudomonassyringae)的ptz基因(ACCESSION X03679-1，PROTEIN_ID CAA27315.1)、藤黄红球菌(Rhodococcusfascians)的ipt基因(ACCESSION Z29635-4，PROTEIN_ID CAA82744.1)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)的二甲基烯丙基转移酶基因(ACCESSION Z46375-2， PROTEIN_IDCAA86510.1)、以及大肠杆菌(Escherichiacoli)tRNA的δ-2-异戊烯基焦磷酸酯(IPP)转移酶基因(ACCESSION U14003-83，PROTEIN_IDAAA97067.1)的基因产物的氨基酸序列，用氨基酸序列比较软件MacVector 6.5.3的Clustal V来解析后，结果发现了保守序列GxTxxGK[ST]xxxxx[VLI]xxxxxxx[VLI][VLI]xxDxxQx[57，60][VLI][VLI]xGG[ST]。其中，x表示任意的氨基酸残基，用[]括起来的氨基酸残基表示其中的氨基酸残基的任意一种，[a，b]表示a或以上，b或以下数量的任意种类的氨基酸残基。
接着，为了分离被认为含有上述保守氨基酸序列样式的基因或推定基因区域，我们用TAIR Pattern Matching program在鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)的基因组数据库中进行检索。结果发现，由国际基因组计划推定的基因区域编号AT4g24650、T20010_210、MDB19.12、MVI11.6、T26J14.3、F2J7.12、AF109376和T16G12(登录号AC068809)的基因组克隆的29375-30301bp这8个基因是含有上述保守氨基酸序列的基因。
这8个基因中，只有AF109376的cDNA已经被克隆，注明为tRNA异戊烯基转移酶mRNA。但是，AT4g24650、T20010_210、MDB19.12、MVI11.6、T26J14.3、F2J7.12的全长cDNA还没有被分离出来，注明为可能是tRNA异戊烯基转移酶。至于T16G12(登录号AC068809)的基因组克隆的29375-30301bp，连作为推定功能都还没被注明。就是说，对于这8个基因只是在电脑上推测出的功能，实验上还没有进行功能解析，实际功能还不清楚。另外，酶活性也没有测定过，酶底物是什么也不清楚。
与AT4g24650(AtIPT4)、T20010_210(AtIPT3)、T16G12(登录号AC068809)的基因组克隆的29375-30301bp对应的cDNA(AtIPT5)、MDB19.12(AtIPT7)、MVI11.6(AtIPT8)、T26J14.3(AtIPT1)、F2J7.12(AtIPT6)的碱基序列分别在序列编号为1，3，5，7，9，11和13中示出。
另外，包括这些碱基所编码的氨基酸序列(序列编号分别为2，4，6，8，10，12，14)，以及从DNA数据库(如DNA Data Bank of Japan(DDBJ)、(http//www.ddbj.nig.ac.jp)检索得到的有同源性的氨基酸序列，用Clustal W程序(http//www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/clustalw-e.html、Thompson，et al.1994，Nucl.Acids Res.22，4673-4680.)作成分子系统树。其结果，在序列编号2，4，6，8，10，12，14显示的序列，显示出与真核生物或细菌的DMAPPtRNA异戊烯基转移酶，或者土壤杆菌等目标植物病原菌的细胞分裂素合成相关的异戊烯基转移酶形成了家族。而且，在序列编号2，10，12，14中显示的氨基酸序列形成了一个亚组。作为与这个亚组近缘的基因有来自矮牵牛花的AAL883819(DDBJ登录号)和来自水稻的BAB86364(DDBJ登录号)。另外，在序列编号4，6，8中显示的氨基酸序列也形成了一个亚组，这个亚组中有来自百脉根的AW720363(DDBJ登录号)。
实施例2、在植物中编码细胞分裂素合成相关蛋白质的基因的过量表达1)向植物转导的基因载体的构建将pBI35T(WO 01/16332)用EcoRI和HindIII处理，得到含有花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus)35S RNA基因的启动子、多克隆位点、及35S RNA基因的终止子的DNA片段。然后将此片段与pGPTV-KAN(Becker R etal，Plant Molecular Biology 20，1195-97，1992)用HindIII和EcoRI处理后生成的两个片段中较长的片段相连接，得到pTK015(图1)。另外，用同样的方法，将含有花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaic virus)35S RNA基因的启动子、多克隆位点、及35S RNA基因的终止子的DNA片段，与pGPTV-Bar(Becker R etal，Plant MolecularBiology 20，1195-97，1992)用HindIII和EcoRI处理后生成的两个片段中较长的片段相连接，得到pTK016。
AF109376的预测开放阅读框架，是将鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的cDNA文库作为PCR反应的模板DNA，作为引物，使用引物398(5’-TCCCCCGGGCG ATGATGATGTTAAACCCTAGC-3’)(序列编号15)和引物-399(5’-TCCCCCG GGTCAATTTACTTCTGCTTCTTGAACTTC)(序列编号16)，pfxDNA聚合酶(GIBCO BRL)，94℃ 2分钟后，(94℃、15秒；53℃、30秒；68℃、2分40秒)×40循环的条件下保温，使DNA扩增。纯化扩增后的DNA后，用SmaI处理，再次纯化DNA后，将其克隆到pTK015的SmaI位点，选择在花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus)35S RNA基因的启动子(35S启动子)的下游按有义方向克隆的产物，作为pTK015-AF109376。
AtIPT4是以鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的基因组DNA为PCR反应模板，以引物421(AAAATGAAGTGTAATGACAAAATGGTTGTG-3’)(序列编号17)和引物407(5’-GTCCAAACTAGTTAAGACTTAAAAATC-3’)(序列编号18)为引物，并使用pfxDNA聚合酶(GIBCO BRL)，在94℃2分钟后，(94℃、15秒；53℃、20秒；68℃、1分)×42循环的条件下保温，使DNA扩增。纯化后克隆到pTK015的SmaI位点。将35S启动子的下游有义方向的克隆产物，作为pTK015-AtIPT4。
AtIPT3是以鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的基因组DNA为PCR反应模板，作为引物使用引物703(5’-CACCAGCAAGTTTATATTGCAAAGCGT-3’)(序列编号19)和引物705(5’-GTTGTAACCACGTAAAAGATAAGGGTG-3’)(序列编号20)，作为耐热性DNA合成酶使用Herculase(商标)(STRATAGENE公司产)使DNA扩增。PCR反应的条件为92℃1分钟后，反复操作35次(92℃、30秒；55℃、30秒；70℃、2分30秒)。DNA纯化后，克隆到pTK016的SmaI位点的平末端。选择AtIPT3在35S启动子的下游有义方向的克隆产物，作为pTK016-AtIPT3。
将pTK015用SmaI和KpnI切断后，用キアゲソ公司的QUIA快速PCR纯化试剂盒纯化。在其中，通过克隆引物852(5’-CTCGAGTTGGCGCGCCACCCGGGATTAATTAAGACTAG TGGGGTAC-3’)(序列编号27)和引物853(5’-CCCACTAGTCTTAATTAATCCCGGGTGGCGCGCCAACTCGAG-3’)(序列编号28)，变更了pTK015的多克隆位点的序列。这里，因为引物852和853是含有互相互补序列的合成DNA，因此，该操作通过将pTK015用SmaI和KpnI切断后的片段，与引物852和引物853在连接酶存在下，在常规条件下保温来进行。将这样得到的质粒命名为pHM4。pHM4与pTK015的不同之处只是多克隆位点不同。pTK015的多克隆位点中独有的位点是XbaI，XhoI，AscI，SmaI，PacI，SpeI，KpnI和SalI。
将4μg的pHM4用20单位的BamHI切断后，通过将其一半量在200μM的脱氧ATP，脱氧TTP，脱氧CTP，脱氧GTP，1单位的pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)存在下，在70℃保温30分钟，形成平末端。然后将其用20单位牛小肠碱性磷酸酶(Calf Intestine Alkaline Phosphatase)(タカラ公司)在37℃处理1小时，再用QUII快速PCR纯化试剂盒(キアゲソ公司)纯化DNA。在其中，克隆从鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的基因组DNA，使用耐热性DNA聚合酶Herculase(Stratagene公司)，引物918(5’-ATG ACA GAA CTC AAC TTC CAC CT-3’)(序列编号29)和引物879(5’-CAAAAAAAAGATCTAATTTTGCACCAAATGCCGCTT-3’)(序列编号30)进行扩增(94℃、20秒；55℃、30秒；72℃、1分的周期，循环35次)得到的DNA片段，然后再次将其克隆，得到pHM4-AtIPT1。
用与构建pHM4-AtIPT1相同的方法，将克隆了从鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的基因组DNA，使用引物533(5’-ATTATGCAAAATCTTACGTCCACATTCGTC-3’)(序列编号31)和引物881(5’-ACAGGATCCTCACACTTTGTCTTTCACCAAG-3’)(序列编号32)作为引物扩增后的DNA片段的产物，再经进一步克隆，得到pHM4-AtIPT8。
将从序列编号5中记载的翻译起始点ATG上游66bps开始，包括序列编号6的全部编码区域的序列，使用引物856(5’-CCGCTCGAGATGAAGCCATGCATGACGGCTC-3’)(序列编号33)和引物857(5’-GGACTAGTCACCGGGAAATCGCCGCCA-3’)(序列编号34)，以从Columbia野生株(宝酒造公司)中提取出来的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。由于这些引物中含有限制性内切酶的切点，因此将PCR产物用XhoI和SpeI处理，再将该DNA片段克隆到在植物中过量表达的载体pHM4中，将其命名为pHM4-AtIPT5。
2)向植物中导入基因使用土壤杆菌属，将pTK015，pTK015-AF109376，pTK015-AtIPT4和pTK016-AtIPT3转导入鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的愈伤组织中。使用土壤杆菌属转导入基因的方法，是依据Akama等的方法(Akama，K.etal.1992 Plant Cell Rep.12，7-11.)。将基因导入后的愈伤组织，在不含细胞分裂素的培养基[在GM培养基(Akama，K.et al.1992 Plant Cell Rep.12，7-11.)中，含有50μg/ml卡那霉素硫酸盐，100μg/ml头孢噻肟，100μg/ml万古霉素和0.3μg/ml吲哚乙酸]和含有细胞分裂素的培养基(在不含细胞分裂素的培养基中加入了0.5μg/ml反式玉米素的培养基)中分别培养。观察2周后发现，用pTK015和pTK015-AF109376转化后的愈伤组织，在不含细胞分裂素的培养基中都没有枝芽形成，而只在含有细胞分裂素的培养基中都形成了枝芽。与此相对，用pTK015-AtIPT4转化后的愈伤组织，在不含细胞分裂素和含有细胞分裂素的培养基中，都有枝芽形成。另外，用pTK016-AtIPT3转化后的愈伤组织也一样，在不含细胞分裂素和含有细胞分裂素的培养基中，都有枝芽形成。
将分别导入了pHM4，pHM4-AtIPT1，pHM4-AtIPT8，pHM4-AtIPT5的鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)愈伤组织，在含有0.2μg/ml吲哚乙酸，50μg/ml卡那霉素，100μg/ml头孢噻肟，但不含有细胞分裂素的培养基中培养，操作方法与在愈伤组织中导入AtIPT4的实施例相同。结果发现，导入pHM4后的愈伤组织没有形成枝芽，而导入pHM4-AtIPT1，pHM4-AtIPT8和pHM4-AtIPT5后的愈伤组织形成了枝芽。
由此表明，在AtIPT4和AtIPT3中，具有枝芽诱导能力和细胞分裂素合成能力。
另外显示，通过AtIPT1，AtIPT5，AtIPT8的过量表达，可以引起细胞分裂素应答。
3)pHM4-AtIPT5在植物中的过量表达将pHM4-AtIPT5使用减压浸润土壤杆菌感染法(荒木崇、秀润社、细胞工学别册、植物细胞工学系列4、模型植物的实验指南、109～113页)在鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)中进行转化，将得到的种子在含有50μg/ml卡那霉素的MS琼脂培养基中栽培，筛选转化体。将这些转化体在加入有1/2浓度MS培养基的蛭石上栽培时，发现在多个体中形成了极多的侧芽(成为浓密状)(图2)。而作为对照栽培的pHM4的转化体，则没有观察到上述表现型。由此可知，如果过剩表达AtIPT5，则缺乏顶端优势，但可促进侧芽形成。
实例3、细胞分裂素合成相关蛋白质的酶活性测定1)酶活性测定用质粒的构建以实例2中构建的pTK015-AtIPT4作为PCR反应的模板，作为引物使用引物480(5’-GGAATTCCATATGAAGTGTAATGACAAAATGGTTG-3’)(序列编号21)和引物481(5’-GAAGATCTGTCCAAACTAGTTAAGACTTAAAAATC-3’)(序列编号22)，使用LA taq(宝酒造)，将编码区域进行扩增。将其纯化后，用NdeI和BglII处理，再次纯化DNA。然后将此DNA片段克隆到pET16b(Novagen公司)的NdeI和BamHI位点之间，做成pET16b-AtIPT4。
另外，以pTK015-AF109376为PCR反应的模板，作为引物使用引物550(5’-GATCCCCGGCATATGA TGATGTTAAACCCTAGC-3’)(序列编号23)和引物551(5’-ACGGTACCCATATGTCAATTTACTTCTGCTTCTTGAAC-3’)(序列编号24)，作为耐热性DNA聚合酶使用Herculase(Stratagene公司)，将编码区域进行扩增。将其用NdeI处理后，克隆到pET16b的NdeI位点，制成pET16b-AF109376。
进一步，以鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的基因组DNA为PCR反应的模板，作为引物使用引物741(5’-TTATACATA TGAAGCCATGCATGACGGCTCTAAG-3’)(序列编号25)和引物742(5’-CGGGATCCTCACCGGGAAATCGCCGCCA-3’)(序列编号26)，作为耐热性酶使用LA taq(宝酒造)，将编码区域进行扩增。将其纯化后，用NdeI和BamHI处理，然后克隆到pET15b(Novagen公司)的NdeI和BamHI之间，做成pET15b-AtIPT5。
2)大肠杆菌提取液的酶活性测定如前所述，AtIPT1，AtIPT4，AtIPT8和AtIPT6形成了一个亚组，AtIPT3，AtIPT5和AtIPT7形成了另一个亚组。分别对于一个基因，在大肠杆菌中测定活性。
将导入了pET16b-AtIPT4，pET16b-AF109376，或者pET15b-AtIPT5的大肠杆菌AD494(DE3)pLysS株在20℃，1mM IPTG存在下培养12小时后，离心收集细菌，向菌体中加入缓冲溶液A(25mM Tris-HCl，50mM KCl，5mM β-巯基乙醇，1mM PMSF，20μg/ml亮肽素)以使OD600＝100后，通过冻融破碎大肠杆菌。然后将其在300000g下离心10分钟，回收上清液。将该上清液10μl，与含有60μM DMAPP、5μM3HAMP(722GBq/mmol)、10mM MgCl2的缓冲溶液A 10μl，25℃下保温30分钟。然后，向该反应液中加入Tris-HCl(pH＝9)使之成为50mM，加入牛小肠碱性磷酸酶至终浓度为2单位/30μl，通过在37℃保温30分钟进行脱磷酸反应。将反应液用C18反相薄层色谱(移动相为50％甲醇)展开，通过放射自显影检测反应产物。结果发现，在加入了含有pET16b-AtIPT4和pET15b-AtIPT5的大肠杆菌的提取液的反应液中，有异戊烯基腺苷的生成。然而，在导入了含有pET16b-AF109376的大肠杆菌的提取液中，未见有异戊烯基腺苷的生成。
3)纯化蛋白质的酶活性测定与实施例3-(1)同样，将AtIPT4克隆到pET32b(Novagen公司)中，与实施例3-(2)同样，调制大肠杆菌提取液，将其称为样品A。向样品A 800μl中加入400μl Ni-NT琼脂糖悬浊液(通过沉淀含有110μlNi-NT琼脂糖，30mM NaH2PO4(pH8)，15mM咪唑，0.9M NaCl，7.5mMβ-巯基乙醇，0.5mM PMSF，30μg/ml亮肽素)。将该悬浊液称为样品B。将样品B离心，分成上清(样品C)和沉淀部分。向沉淀中加入洗液(20mMNaH2PO4(pH8)，10mM咪唑，0.3M NaCl，5mM β-巯基乙醇，0.5mMPMSF，10μg/ml亮肽素)，用通过离心回收的操作将琼脂糖洗涤4次。然后将该Ni-NT琼脂糖悬浮于500μl洗液中，将其称为样品D。将样品D50μl与50μl 2X其中含有0.25μM的3H标记的各种核酸ATP，ADP，AMP、腺苷、腺嘌呤之一的反应液(25mM Tris-HCl(pH7.5)，75mM KCl，10mM MgCl2，10μg/ml亮肽素，1mM PMSF，66μM DMAPP)混合，在在23℃下反应30分钟，向该反应液中加入700μl乙酸乙酯，搅拌，离心后，回收乙酸乙酯层550μl。向其中加入500μl蒸馏水，再次搅拌，离心后，分离乙酸乙酯层350μl，向其中再加入500μl蒸馏水，再次搅拌，离心后，向乙酸乙酯层中的50μl乙酸乙酯中，加入0.5ml的ACSII(フアルマツア)，用液体闪烁计数器测定放射能。结果发现，DMAPP的二甲基烯丙基被高效率的转移到了ATP和ADP上。由此可见，AtIPT4产物具有将二甲基烯丙基转移到ATP和ADP上的活性。
使用纯化过的重组AtIPT4蛋白质(2ng/ml)，在0.4mM DMAPP的存在下，测定相对于ATP的Km为18μM。此数值是比得上tzs相对于AMP的Km 11.1μM的数值(Morris et al.Aust.J.PlantPhysiol.20，621-637，1933)。另外，在200μM ATP存在下，测定相对于DMAPP的Km时，为6.5μM。
同样，AtIPT1也编码具有将二甲基烯丙基转移到ATP和ADP上的活性的蛋白质。
4)反应产物的鉴定将上述的样品D与等量的2X反应液(含有1mM ATP和1mMDMAPP)混合，在25℃使之反应1小时。离心后，将上清分成2等份，将其中一份用牛小肠碱性磷酸酶处理。分别用3倍体积的丙酮稀释后，在-80℃保存30分钟后，在17,000xg下离心30分钟，除去蛋白质。将上清液减压干燥后，溶解于甲醇。将其中一部分用Chemocobond ODS-W柱(Chemco公司)分馏。先用20mM KH2PO4洗脱15分钟后，用含有从20mM KH2PO4到4mM KH2PO4的80％乙腈水溶液进行30分钟线性梯度洗脱。未用牛小肠碱性磷酸酶处理的样品，在Chemocobond ODS-W柱层析主要出现了2个峰，其中先出现的峰的保留时间与ATP一致，后出现的峰(峰A)的保留时间与ATP、腺苷、异戊烯基腺苷中任一个的保留时间都不相同。用牛小肠碱性磷酸酶处理的样品，在Chemocobond ODS-W柱层析也主要出现了2个峰，其中先出现的峰的保留时间与腺苷一致，后出现的峰(峰B)的保留时间与异戊烯基腺苷的保留时间一致。
将峰A和峰B的馏分干燥后，溶解于乙醇中，用快原子轰击质谱(JMS-SX102或JEOL MStation，JEOL DATUM Ltd.)进行解析。结果为，来自峰A的化合物的信号，由于阻碍3磷酸基离子化，所以没有得到。来自峰B的化合物的信号为m/z值为336和204，前者与异戊烯基腺苷相对应，后者与异戊烯基腺苷的分解产物相对应。由此可知，峰A是作为异戊烯基腺苷被磷酸化的化合物异戊烯基ATP(也称为iPTP)。
产业上的可利用性使序列编号2，6所示的基因在大肠杆菌表达时，均显示有细胞分裂素合成活性。另外，在将序列编号2，4，6，10，12所示的基因的酶在植物中过量表达时，可以引起细胞分裂素应答。同时也发现，序列编号2，10，12和14或序列编号4，6和8，分别在分子系统上具有极近的关系。因此，这些都可认为是细胞分裂素合成酶。通过调控本发明的基因以及类似基因的表达，可以调节细胞分裂，分化，腋芽的成长，调节营养成分的分配，抑制老化，生殖成长以及种子的成长等。而且，由于是植物基因，因此在导入了这些基因的植物中表达的蛋白质不太可能出现毒性。
由于作为细胞分裂素合成的基质，可以高效率的利用ATP，因此可以期待，与以AMP为基质的细菌由来的细胞分裂素合成基因相比，本发明的基因应该在植物体内发挥更良好的机能。
序列表<110>三得利株式会社<120>编码细胞分裂素合成相关蛋白质的基因<130>
<160>34<170>Patentln version 3.1<210>1<211>957<212>DNA<213>鼠耳芥<220>
<221>CDS<222>(1)..(957)<223>编码细胞分裂素合成酶样蛋白质的DNA的核苷酸序列(AtIPT4)<400>1atg aag tgt aat gac aaa atg gtt gtg atc atg ggt gcc acc ggt tct48Met Lys Cys Asn Asp Lys Met Val Val Ile Met Gly Ala Thr Gly Ser1 5 10 15ggc aag tca tca ctc tct gtt gat ctc gct tta cat ttt aaa gcc gag96Gly Lys Ser Ser Leu Ser Val Asp Leu Ala Leu His Phe Lys Ala Glu20 25 30atc atc aac tct gac aaa atg cag ttc tac gat ggc ttg aag atc acc144Ile Ile Asn Ser Asp Lys Met Gln Phe Tyr Asp Gly Leu Lys Ile Thr35 40 45acg aat caa tcg acc att gaa gat cga cgt gga gtg cca cat cac ctt 192Thr Asn Gln Ser Thr Ile Glu Asp Arg Arg Gly Val Pro His His Leu50 55 60ctc ggt gaa cta aac ccg gag gct gga gaa gtc aca gcg gca gaa ttt 240Leu Gly Glu Leu Asn Pro Glu Ala Gly Glu Val Thr Ala Ala Glu Phe65 70 75 80cgc gtt atg gcg gct gaa gcc atc tcc gag att act caa cgt aaa aag 288Arg Val Met Ala Ala Glu Ala Ile Ser Glu Ile Thr Gln Arg Lys Lys85 90 95ctc cca atc ctt gcc ggt gga tcc aac tca tac att cat gct ctc ctt 336
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290 295 300tat tat tac ttt tat tta cta aaa aga ttt tta agt ctt aac tag957Tyr Tyr Tyr Phe Tyr Leu Leu Lys Arg Phe Leu Ser Leu Asn305 310 315<210>2<211>318<212>PRT<213>鼠耳芥<400>2Met Lys Cys Asn Asp Lys Met Val Val lle Met Gly Ala Thr Gly Ser1 5 10 15Gly Lys Ser Ser Leu Ser Val Asp Leu Ala Leu His Phe Lys Ala Glu20 25 30Ile Ile Asn Ser Asp Lys Met Gln Phe Tyr Asp Gly Leu Lys Ile Thr35 40 45Thr Asn Gln Ser Thr Ile Glu Asp Arg Arg Gly Val Pro His His Leu50 55 60Leu Gly Glu Leu Asn Pro Glu Ala Gly Glu Val Thr Ala Ala Glu Phe65 70 75 80Arg Val Met Ala Ala Glu Ala Ile Ser Glu Ile Thr Gln Arg Lys Lys85 90 95Leu Pro Ile Leu Ala Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ile His Ala Leu Leu100 105 110Ala Lys Ser Tyr Asp Pro Glu Asn Tyr Pro Phe Ser Asp His Lys Gly115 120 125Ser Ile Cys Ser Glu Leu Lys Tyr Asp Cys Cys Phe Ile Trp Ile Asp130 135 140
Val Asp Gln Ser Val Leu Phe Glu Tyr Leu Ser Leu Arg Leu Asp Leu145 150 155 160Met Met Lys Ser Gly Met Phe Glu Glu Ile Ala Glu Phe His Arg Ser165 170 175Lys Lys Ala Pro Lys Glu Pro Leu Gly Ile Trp Lys Ala Ile Gly Val180 185 190Gln Glu Phe Asp Asp Tyr Leu Lys Met Tyr Lys Trp Asp Asn Asp Met195 200 205Asp Lys Trp Asp Pro Met Arg Lys Glu Ala Tyr Glu Lys Ala Val Arg210 215 220Ala Ile Lys Glu Asn Thr Phe Gln Leu Thr Lys Asp Gln Ile Thr Lys225 230 235 240Ile Asn Lys Leu Arg Asn Ala Gly Trp Asp Ile Lys Lys Val Asp Ala245 250 255Thr Ala Ser Phe Arg Glu Ala Ile Arg Ala Ala Lys Glu Gly Glu Gly260 265 270Val Ala Glu Met Gln Arg Lys Ile Trp Asn Lys Glu Val Leu Glu Pro275 280 285Cys Val Lys Ile Val Arg Ser His Leu Asp Gln Pro Ile Asn Tyr Tyr290 295 300Tyr Tyr Tyr Phe Tyr Leu Leu Lys Arg Phe Leu Ser Leu Asn305 310 315<210>3<211>1011<212>DNA<213>鼠耳芥
<220>
<221>CDS<222>(1)..(1011)<223>编码细胞分裂素合成酶样蛋白质的DNA的核苷酸序列(AtIPT3)<400>3atg atc atg aag ata tct atg gct atg tgc aaa caa cca ttg cct cct48Met Ile Met Lys Ile Ser Met Ala Met Cys Lys Gln Pro Leu Pro Pro1 5 10 15tcg ccg act tta gac ttc cct cca gcg aga ttt ggt ccc aat atg cta96Ser Pro Thr Leu Asp Phe Pro Pro Ala Arg Phe Gly Pro Asn Met Leu20 25 30act cta aac cca tac ggt cca aag gac aaa gtt gtg gtc atc atg ggt144Thr Leu Asn Pro Tyr Gly Pro Lys Asp Lys Val Val Val Ile Met Gly35 40 45gct acc ggg aca ggc aag tca cga ctc tcc gtg gat ata gcc aca cgt192Ala Thr Gly Thr Gly Lys Ser Arg Leu Ser Val Asp Ile Ala Thr Arg50 55 60ttt cgg gct gag atc ata aac tca gac aag ata caa gtc cac caa ggt240Phe Arg Ala Glu Ile Ile Asn Ser Asp Lys Ile Gln Val His Gln Gly65 70 75 80cta gac att gta acc aac aag atc acg agc gag gag agc tgc ggg gta288Leu Asp Ile Val Thr Asn Lys Ile Thr Ser Glu Glu Ser Cys Gly Val85 90 95ccg cac cat ctc ctc ggc gtc ttg ccg cct gaa gcc gac tta acc gcc336Pro His His Leu Leu Gly Val Leu Pro Pro Glu Ala Asp Leu Thr Ala100 105 110gcg aat tac tgt cac atg gcg aat ctc tcc att gaa tcc gtc cta aac384Ala Asn Tyr Cys His Met Ala Asn Leu Ser Ile Glu Ser Val Leu Asn115 120 125cgt gga aag ctt cca atc atc gtt gga ggt tcc aac tct tac gtg gag432Arg Gly Lys Leu Pro Ile Ile Val Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Val Glu130 135 140gct cta gtg gat gac aaa gaa aac aag ttc agg tcg aga tac gac tgt480Ala Leu Val Asp Asp Lys Glu Asn Lys Phe Arg Ser Arg Tyr Asp Cys145 150 155 160tgt ttt cta tgg gtg gac gtg gca ctt ccc gtt ttg cac ggg ttc gtg528
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<213>鼠耳芥<400>4Met Ile Met Lys Ile Ser Met Ala Met Cys Lys Gln Pro Leu Pro Pro1 5 10 15Ser Pro Thr Leu Asp Phe Pro Pro Ala Arg Phe Gly Pro Asn Met Leu20 25 30Thr Leu Asn Pro Tyr Gly Pro Lys Asp Lys Val Val Val Ile Met Gly35 40 45Ala Thr Gly Thr Gly Lys Ser Arg Leu Ser Val Asp Ile Ala Thr Arg50 55 60Phe Arg Ala Glu Ile Ile Asn Ser Asp Lys Ile Gln Val His Gln Gly65 70 75 80Leu Asp Ile Val Thr Asn Lys Ile Thr Ser Glu Glu Ser Cys Gly Val85 90 95Pro His His Leu Leu Gly Val Leu Pro Pro Glu Ala Asp Leu Thr Ala100 105 110Ala Asn Tyr Cys His Met Ala Asn Leu Ser Ile Glu Ser Val Leu Asn115 120 125Arg Gly Lys Leu Pro Ile Ile Val Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Val Glu130 135 140Ala Leu Val Asp Asp Lys Glu Asn Lys Phe Arg Ser Arg Tyr Asp Cys145 150 155 160Cys Phe Leu Trp Val Asp Val Ala Leu Pro Val Leu His Gly Phe Val165 170 175Ser Glu Arg Val Asp Lys Met Val Glu Ser Gly Met Val Glu Glu Val
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<221>CDS<222>(1)..(990)<223>编码细胞分裂素合成酶样蛋白质的DNA的核苷酸序列(AtIPT5)
<400>5atg aag cca tgc atg acg gct cta aga caa gtg att caa cca ttg tcg48Met Lys Pro Cys Met Thr Ala Leu Arg Gln Val Ile Gln Pro Leu Ser1 5 10 15ttg aac ttc caa gga aac atg gtg gac gtt ccg ttt ttc cgg cga aaa96Leu Asn Phe Gln Gly Asn Met Val Asp Val Pro Phe Phe Arg Arg Lys20 25 30gac aag gtt gtt ttc gtc atg gga gcc acc gga acc ggc aaa tct cgt144Asp Lys Val Val Phe Val Met Gly Ala Thr Gly Thr Gly Lys Ser Arg35 40 45cta gcc att gac cta gcc act cgt ttt ccg gcg gag att gta aac tcc192Leu Ala Ile Asp Leu Ala Thr Arg Phe Pro Ala Glu Ile Val Asn Ser50 55 60gac aag atc cag gtc tat aaa ggt cta gac att gtg act aac aaa gtc240Asp Lys Ile Gln Val Tyr Lys Gly Leu Asp Ile Val Thr Asn Lys Val65 70 75 80act cct gag gaa agc ctt ggc gtt cct cac cac ctt ctc ggc acc gtc288Thr Pro Glu Glu Ser Leu Gly Val Pro His His Leu Leu Gly Thr Val85 90 95cac gac act tac gaa gat ttc acg gcg gag gat ttt cag cgt gaa gca336His Asp Thr Tyr Glu Asp Phe Thr Ala Glu Asp Phe Gln Arg Glu Ala100 105 110atc agg gcc gtc gag tca atc gtc cag aga gac cgt gtc ccg atc ata384Ile Arg Ala Val Glu Ser Ile Val Gln Arg Asp Arg Val Pro Ile Ile115 120 125gcc ggt ggt tcc aat tct tac atc gag gct ctg gtc aac gat tgc gtt432Ala Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ile Glu Ala Leu Val Asn Asp Cys Val130 135 140gac ttc cgg tta agg tat aat tgt tgc ttc ttg tgg gtc gac gtc tct480Asp Phe Arg Leu Arg Tyr Asn Cys Cys Phe Leu Trp Val Asp Val Ser145 150 155 160aga ccg gtt tta cac tcg ttt gtc tcg gag cga gtt gat aag atg gtt528Arg Pro Val Leu His Ser Phe Val Ser Glu Arg Val Asp Lys Met Val165 170 175gat atg ggt ctc gtc gac gag gtt cgc cgc atc ttc gat ccg tct tcg576Asp Met Gly Leu Val Asp Glu Val Arg Arg Ile Phe Asp Pro Ser Ser180 185 190
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Leu Asn Phe Gln Gly Asn Met Val Asp Val Pro Phe Phe Arg Arg Lys20 25 30Asp Lys Val Val Phe Val Met Gly Ala Thr Gly Thr Gly Lys Ser Arg35 40 45Leu Ala Ile Asp Leu Ala Thr Arg Phe Pro Ala Glu Ile Val Asn Ser50 55 60Asp Lys Ile Gln Val Tyr Lys Gly Leu Asp Ile Val Thr Asn Lys Val65 70 75 80Thr Pro Glu Glu Ser Leu Gly Val Pro His His Leu Leu Gly Thr Val85 90 95His Asp Thr Tyr Glu Asp Phe Thr Ala Glu Asp Phe Gln Arg Glu Ala100 105 110Ile Arg Ala Val Glu Ser Ile Val Gln Arg Asp Arg Val Pro Ile Ile115 l20 125Ala Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ile Glu Ala Leu Val Asn Asp Cys Val130 135 140Asp Phe Arg Leu Arg Tyr Asn Cys Cys Phe Leu Trp Val Asp Val Ser145 150 155 160Arg Pro Val Leu His Ser Phe Val Ser Glu Arg Val Asp Lys Met Val165 170 175Asp Met Gly Leu Val Asp Glu Val Arg Arg Ile Phe Asp Pro Ser Ser180 l85 190Ser Asp Tyr Ser Ala Gly Ile Arg Arg Ala Ile Gly Val Pro Glu Leu195 200 205Asp Glu Phe Leu Arg Ser Glu Met Arg Asn Tyr Pro Ala Glu Thr Thr
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<221>CDS<222>(1)..(990)<223>编码细胞分裂素合成酶样蛋白质的DNA的核苷酸序列(AtIPT7)<400>7atg aag ttc tca atc tca tca ctg aag cag gta caa cca atc ttg tgc48Met Lys Phe Ser Ile Ser Ser Leu Lys Gln Val Gln Pro Ile Leu Cys1 5 10 15ttc aag aac aag cta tct aag gtc aac gtc aac tct ttt ctc cat ccc96Phe Lys Asn Lys Leu Ser Lys Val Asn Val Asn Ser Phe Leu His Pro
20 25 30aaa gaa aaa gtc atc ttt gtg atg gga gct acc gga tcg ggt aag tct144Lys Glu Lys Val Ile Phe Val Met Gly Ala Thr Gly Ser Gly Lys Ser35 40 45cgt ctc gcc atc gac cta gca act cgt ttt caa gga gag atc ata aac192Arg Leu Ala Ile Asp Leu Ala Thr Arg Phe Gln Gly Glu Ile Ile Asn50 55 60tcc gac aag att caa ctt tac aag ggc cta gac gtc cta aca aac aaa240Ser Asp Lys Ile Gln Leu Tyr Lys Gly Leu Asp Val Leu Thr Asn Lys65 70 75 80gtc acc cct aaa gaa tgc cga ggc gtg cct cac cac ttg ctt gga gta288Val Thr Pro Lys Glu Cys Arg Gly Val Pro His His Leu Leu Gly Val85 90 95ttc gac tcc gaa gcc gga aac cta acg gcc acc cag tat agc cgc ctt336Phe Asp Ser Glu Ala Gly Asn Leu Thr Ala Thr Gln Tyr Ser Arg Leu100 105 110gcg tca caa gca atc tcg aaa ctc tca gcg aac aac aag ctt ccc ata384Ala Ser Gln Ala Ile Ser Lys Leu Ser Ala Asn Asn Lys Leu Pro Ile115 120 125gta gcc ggt gga tca aac tct tac atc gaa gca ctt gtt aat cat tcc432Val Ala Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ile Glu Ala Leu Val Asn His Ser130 135 140tcg ggg ttt tta tta aac aac tac gat tgt tgt ttc att tgg gtc gac480Ser Gly Phe Leu Leu Asn Asn Tyr Asp Cys Cys Phe Ile Trp Val Asp145 150 155 160gtt tcc tta ccc gta ctt aac tcc ttt gtc tca aaa cgt gtc gac cgc528Val Ser Leu Pro Val Leu Asn Ser Phe Val Ser Lys Arg Val Asp Arg165 170 175atg atg gaa gca gga tta ctc gaa gaa gta aga gaa gtg ttc aat cca576Met Met Glu Ala Gly Leu Leu Glu Glu Val Arg Glu Val Phe Asn Pro180 185 190aaa gcg aat tac tcc gta ggg ata cga cga gct atc gga gtc ccc gag624Lys Ala Asn Tyr Ser Val Gly Ile Arg Arg Ala Ile Gly Val Pro Glu195 200 205ctc cat gaa tat tta cgt aac gaa tct cta gtg gac cgt gcc aca aaa672Leu His Glu Tyr Leu Arg Asn Glu Ser Leu Val Asp Arg Ala Thr Lys210 215 220
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245 250 255Trp Lys Met Ser Met His Arg Val Asp Ala Thr Glu Val Phe Leu Lys260 265 270Arg Asn Val Glu Glu Gln Asp Glu Ala Trp Glu Asn Leu Val Ala Arg275 280 285Pro Ser Glu Arg Ile Val Asp Lys Phe Tyr Asn Asn Asn Asn Gln Leu290 295 300Lys Asn Asp Asp Val Glu His Cys Leu Ala Ala Ser Tyr Gly Gly Gly305 310 315 320Ser Gly Ser Arg Ala His Asn Met Ile325<210>9<211>993<212>DNA<213>鼠耳芥<220>
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85 90 95gat aaa atc caa gtc tac gaa gga tta gag atc aca acg aat cag att336Asp Lys Ile Gln Val Tyr Glu Gly Leu Glu Ile Thr Thr Asn Gln Ile100 105 110acg tta caa gac cgt cgc ggc gtt cct cac cat ctc ctc ggc gtc atc384Thr Leu Gln Asp Arg Arg Gly Val Pro His His Leu Leu Gly Val Ile115 120 125aac ccc gaa cac ggc gaa cta acc gcc gga gag ttt cgc tcc gcc gct432Asn Pro Glu His Gly Glu Leu Thr Ala Gly Glu Phe Arg Ser Ala Ala130 135 140tca aac gtc gtc aaa gag ata act tct cgt caa aag gtt ccg att atc480Ser Asn Val Val Lys Glu IIe Thr Ser Arg Gln Lys Val Pro Ile Ile145 150 155 160gcc ggt gga tct aac tct ttc gtc cac gca ctc tta gct caa cga ttc528Ala Gly Gly Ser Asn Ser Phe Val His Ala Leu Leu Ala Gln Arg Phe165 170 175gac cca aag ttc gat cct ttt tca tcc ggg tcg tgt tta atc agc tcc576Asp Pro Lys Phe Asp Pro Phe Ser Ser Gly Ser Cys Leu Ile Ser Ser180 185 190gat ttg cgt tac gag tgt tgt ttc atc tgg gtc gat gta tcg gag act624Asp Leu Arg Tyr Glu Cys Cys Phe Ile Trp Val Asp Val Ser Glu Thr195 200 205gtt ctc tac gag tat ctt ctc aga aga gtc gac gaa atg atg gat tca672Val Leu Tyr Glu Tyr Leu Leu Arg Arg Val Asp Glu Met Met Asp Ser210 215 220ggt atg ttc gaa gag ctg tct aga ttc tac gac ccg gtt aaa tcc ggt720Gly Met Phe Glu Glu Leu Ser Arg Phe Tyr Asp Pro Val Lys Ser Gly225 230 235 240tta gaa acc cgg ttt ggg att agg aaa gct ata ggt gta ccg gag ttt768Leu Glu Thr Arg Phe Gly Ile Arg Lys Ala Ile Gly Val Pro Glu Phe245 250 255gac ggt tac ttc aaa gag tat cca ccg gag aag aag atg ata aag tgg816Asp Gly Tyr Phe Lys Glu Tyr Pro Pro Glu Lys Lys Met Ile Lys Trp260 265 270gac gct tta aga aaa gcg gcg tac gat aag gcg gtt gat gat atc aaa864Asp Ala Leu Arg Lys Ala Ala Tyr Asp Lys Ala Val Asp Asp Ile Lys275 280 285
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50 55 60ctt gcc acc cgt ttt ttt ccc gcc gag atc ata aac tcg gac aaa atg240Leu Ala Thr Arg Phe Phe Pro Ala Glu Ile Ile Asn Ser Asp Lys Met65 70 75 80caa atc tac aag gga ttc gag att gtc aca aat cta atc cca ctg cat288Gln Ile Tyr Lys Gly Phe Glu Ile Val Thr Asn Leu Ile Pro Leu His85 90 95gag caa gga gga gtc ccg cac cat ctt cta ggt cag ttc cac cca caa336Glu Gln Gly Gly Val Pro His His Leu Leu Gly Gln Phe His Pro Gln100 105 110gac ggt gaa ctc acc cct gca gag ttc cgt tct ttg gcg aca ctg tcc384Asp Gly Glu Leu Thr Pro Ala Glu Phe Arg Ser Leu Ala Thr Leu Ser115 120 125atc tct aaa cta att tct agc aag aaa ctc ccg att gta gtt ggt gga432Ile Ser Lys Leu Ile Ser Ser Lys Lys Leu Pro Ile Val Val Gly Gly130 135 140tcc aac tcc ttc aat cac gct cta ctc gcc gag cgt ttt gac ccg gat480Ser Asn Ser Phe Asn His Ala Leu Leu Ala Glu Arg Phe Asp Pro Asp145 150 155 160att gat cca ttc tct ccc gga tcg agt ctt tca acg atc tgc tct gac528Ile Asp Pro Phe Ser Pro Gly Ser Ser Leu Ser Thr Ile Cys Ser Asp165 170 175cta agg tac aaa tgt tgc atc tta tgg gtt gat gtt tta gag ccg gtt576Leu Arg Tyr Lys Cys Cys Ile Leu Trp Val Asp Val Leu Glu Pro Val180 185 190ctg ttc caa cac ttg tgc aat cgt gtc gac caa atg atc gag tcg gga624Leu Phe Gln His Leu Cys Asn Arg Val Asp Gln Met Ile Glu Ser Gly195 200 205ttg gtc gag cag ctt gcc gaa ttg tac gac cct gtt gta gat tcg ggt672Leu Val Glu Gln Leu Ala Glu Leu Tyr Asp Pro Val Val Asp Ser Gly210 215 220cga cga cta ggg gtt cgg aag acg ata gga gta gag gag ttc gac cga720Arg Arg Leu Gly Val Arg Lys Thr Ile Gly Val Glu Glu Phe Asp Arg225 230 235 240tac ttt aga gta tac cct aag gag atg gac aag gga att tgg gac tta768Tyr Phe Arg Val Tyr Pro Lys Glu Met Asp Lys Gly Ile Trp Asp Leu245 250 255
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Leu Ala Thr Arg Phe Phe Pro Ala Glu Ile Ile Asn Ser Asp Lys Met65 70 75 80Gln Ile Tyr Lys Gly Phe Glu Ile Val Thr Asn Leu Ile Pro Leu His85 90 95Glu Gln Gly Gly Val Pro His His Leu Leu Gly Gln Phe His Pro Gln100 105 110Asp Gly Glu Leu Thr Pro Ala Glu Phe Arg Ser Leu Ala Thr Leu Ser115 120 125Ile Ser Lys Leu Ile Ser Ser Lys Lys Leu Pro Ile Val Val Gly Gly130 135 140Ser Asn Ser Phe Asn His Ala Leu Leu Ala Glu Arg Phe Asp Pro Asp145 150 155 160Ile Asp Pro Phe Ser Pro Gly Ser Ser Leu Ser Thr Ile Cys Ser Asp165 170 175Leu Arg Tyr Lys Cys Cys Ile Leu Trp Val Asp Val Leu Glu Pro Val180 185 190Leu Phe Gln His Leu Cys Asn Arg Val Asp Gln Met Ile Glu Ser Gly195 200 205Leu Val Glu Gln Leu Ala Glu Leu Tyr Asp Pro Val Val Asp Ser Gly210 215 220Arg Arg Leu Gly Val Arg Lys Thr Ile Gly Val Glu Glu Phe Asp Arg225 230 235 240Tyr Phe Arg Val Tyr Pro Lys Glu Met Asp Lys Gly Ile Trp Asp Leu245 250 255Ala Arg Lys Ala Ala Tyr Glu Glu Thr Val Lys Gly Met Lys Glu Arg
260 265 270Thr Cys Arg Leu Val Lys Lys Gln Lys Glu Lys Ile Met Lys Leu Ile275 280 285Arg Gly Gly Trp Glu Ile Lys Arg Leu Asp Ala Thr Ala Ala Ile Met290 295 300Ala Glu Leu Asn Gln Ser Thr Ala Lys Gly Glu Gly Lys Asn Gly Arg305 310 315 320Glu Ile Trp Glu Lys His Ile Val Asp Glu Ser Val Glu Ile Val Lys325 330 335Lys Phe Leu Leu Glu Val340<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物398<400>15tcccccgggc gatgatgatg ttaaacccta gc 32<210>16<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物399<400>16tcccccgggt caatttactt ctgcttcttg aacttc 36<210>17<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物421<400>17aaaatgaagt gtaatgacaa aatggttgtg 30<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物407<400>18gtccaaacta gttaagactt aaaaatc 27<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物703<400>19caccagcaag tttatattgc aaagcgt27<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物705<400>20gttgtaacca cgtaaaagat aagggtg 27<210>21<211>35<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物480<400>21ggaattccat atgaagtgta atgacaaaat ggttg35<210>22<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物481<400>22gaagatctgt ccaaactagt taagacttaa aaatc35<210>23<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物550<400>23gatccccggc atatgatgat gttaaaccct agc 33<210>24<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物551<400>24acggtaccca tatgtcaat ttacttctgct tcttgaac 38<210>25<211>34<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物741<400>25ttatacatat gaagccatgc atgacggctc taag 34<210>26<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物742<400>26cgggatcctc accgggaaat cgccgcca 28<210>27<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物852<400>27ctcgagttgg cgcgccaccc gggattaatt aagactagtg gggtac 46<210>28<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物853<400>28cccactagtc ttaattaatc ccgggtggcg cgccaactcg ag 42<210>29<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物918<400>29atgacagaac tcaacttcca cct23<210>30<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物879<400>30caaaaaaaag atctaatttt gcaccaaatg ccgctt 36<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物533<400>31attatgcaaa atcttacgtc cacattcgtc 30<210>32<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物881<400>32acaggatcct cacactttgt ctttcaccaa g 31<210>33<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物856<400>33ccgctcgaga tgaagccatg catgacggct c 31<210>34<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物857<400>34ggactagtca ccgggaaatc gccgcca 2权利要求
1.一种基因，具有序列编号2，4，6，8，10，12或14任一者中记载的氨基酸序列，编码具有细胞分裂素合成活性的蛋白质。
2.一种基因，具有相对于序列编号2，4，6，8，10，12或14任一者中记载的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸的添加，缺失和/或被其他氨基酸置换而被修饰的氨基酸序列，且编码具有细胞分裂素合成活性的蛋白质。
3.一种基因，具有序列编号1，3，5，7，9，11或13任一者中记载的碱基序列的核酸，或在严格条件下与该部分进行杂交，且编码具有细胞分裂素合成活性的蛋白质。
4.通过权利要求1～3任一项中记载的基因编码的蛋白质。
5.含有权利要求1～3任一项中记载的基因构成的载体。
6.通过权利要求5中记载的载体转化的宿主。
7.权利要求6中记载的宿主，被转化的宿主为植物或植物细胞。
8.一种细胞分裂素合成酶的制备方法，其特征在于，培养权利要求6或7中记载的宿主，或使之繁殖，然后从该宿主中获得细胞分裂素合成酶。
9.被导入了权利要求1～3任一项中记载的基因的植物或植物细胞。
10.一种调节植物或植物细胞成长的方法，将权利要求1～3任一项中记载的基因导入植物或植物细胞后，使该基因表达。
11.诱导植物或植物细胞的不定芽形成的方法，将权利要求1～3任一项中记载的基因导入植物或植物细胞后，使该基因表达。
12.基于与氨基酸序列GxTxxGK[ST]xxxxx[VLI]xxxxxxx[VLI][VLI]xxDxxQx[57，60][VLI][VLI]xGG[ST](这里，x表示任意的氨基酸残基，用[]括起来的氨基酸残基表示其中的氨基酸残基的任意一种，[a，b]表示a或以上，b或以下数量的任意种类的氨基酸残基)的同源性，检索编码异戊烯基转移酶的植物由来的基因的方法。
13.权利要求12所述的方法，编码异戊烯基转移酶的植物由来的基因是来源于鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的基因。
14.权利要求12或13所述的方法，编码异戊烯基转移酶的植物由来的基因是编码细胞分裂素合成酶的基因。
全文摘要
本发明提供例如鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)由来的编码序列编号2，4，6，8，10，12或14中所示的氨基酸序列的基因。
文档编号C12N9/10GK1496401SQ0280644
公开日2004年5月12日 申请日期2002年3月12日 优先权日2001年3月12日
发明者柿本辰男, 榊原均 申请人:三得利株式会社