专利名称：用于评估中国血统的人种发展2型糖尿病危险性的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及参与胰岛素分泌功能的野生型基因的突变基因中的突变和多态性的鉴定和应用，所述突变和多态性与中国人个体发展2型糖尿病危险性的增加相关。本发明通过将在带有2型糖尿病阳性家族史的中国人个体中特异性鉴定到的突变组合起来进行举例说明，这些突变发生在编码肝细胞核因子-1α，葡糖激酶，糊精的基因和线粒体DNA上。突变基因的组合可用于筛选带有发展2型糖尿病危险的中国人个体并用来给医师提供信息以使他们对病人实施不同的特定治疗。
背景技术：
虽然中国血统的人种占了世界人口的＞20％(Chan，等(1997)201785)，但是对于该人群中与发展糖尿病相关的遗传因素却知之甚少。在中国人种中，糖尿病的流行从中国大陆一些偏远地区的＜1％到香港，新加坡和台湾的6-12％(Chan，等(1997)，同上)。香港可被看作是未来中国的范例。
在香港的中国人中，糖尿病的流行正在达到流行病的比例，其中2型糖尿病为该病早发—或晚发病人的主要类型(Chan and Cockram(1997)Diabetes Care 201785)。2型糖尿病是异质性疾病，由遗传和环境两种因素导致。在中国人群中，受年龄调节的糖尿病的流行已经从1990年的7.7％(Cockram，等(1993)Diabetes Res and Clin Practice 2167)增长到了1995年的8.9％(Cockram和Chan(1999)InDiabetes in theNew Millennium，Pot Still Press，Sydney，pp.11-22)。1995年进行的以人口为基础的研究发现，糖尿病的大概流行率为9.6％，从40岁以下的1.7％增长到60岁年龄以上的25％(Janus(1997)Clin Exp PharmacolPhysiol 24987)。在表现急性或早发的中国糖尿病人中，肥胖者(43％)和有糖尿病阳性家族史(50％)者有高的发病率(Chan，等(1993)Postgrad Med J69204；Ko，等(1998)35761)。这些发现指示，除了环境因素，遗传因素在这些人群中是导致糖尿病早发的一个重要因素。
因为2型糖尿病是一种潜伏性疾病，据估计在香港可能患糖尿病的个体中有一半还没有被诊断。大多数病人只有在表现出往往是疾病恶化结果的明显症状时才被确诊。临床上以及以人口总数为基础的研究指示在香港大约17％的糖尿病人在35岁以前被诊断出来(Chan，等(1993)Postgrad Med 69204；Janus(1996)1995-1996年间，香港心血管危险因素流行研究，Dept of Clin Biochem，Queen Mary Hospital of HongKong，Hong Kong，1997)。鉴于疾病可预料的长持续时间，对这些年轻患者糖尿病的特征进行分类和鉴定以助于早期诊断和合适治疗是非常重要的。目前诊断2型糖尿病的方法一般包括表型参数评估，例如通过进行口服葡萄糖耐量测验(OGTT)检测空腹血清葡萄糖的水平，来确定缺损的葡萄糖耐量低减者(IGT)或空腹血糖受损者(IFG)。虽然对被怀疑具有2型糖尿病的人进行表型评估非常重要，但是受限于病人通常只有在表现出明显症状后才接受诊断。此外，因为2型糖尿病的一般症状是多相性的基因和环境因素结合导致的结果，所提供的治疗通常考虑的是疾病而不是考虑单个病人的特殊病因学。已经进行了大量的研究试图将发展2型糖尿病危险性的增加与特定基因的突变关联起来，但是这些研究结果反复指示表明没有一种突变基因能够成为2型糖尿病的主要病因，强调了该病的多相性。此外，在一种人种的个体中与发展2型糖尿病危险性增加相关的特定基因的突变与另一种人种并不相关，其中第二种人种个体中2型糖尿病的危险性可能相关于一个不同的突变或者在完全不同的基因上的突变。
因此，对于指示中国血统的人种发展2型糖尿病危险性增加的其它基因突变和多态性进行鉴定，以及对能够有效实施于预防性鉴定带有2型糖尿病遗传倾向但未表现症状的中国人个体的方法进行改进是很有意义的。
相关文献年轻起病的成年型糖尿病(MODY)是糖尿病的一种单基因形式，其特征在于是常染色体的显性遗传，通常早发(常常在25岁之前)并且表现胰β-细胞功能的主要缺陷(Fajans(1990)Diabetes Care 1349；Chan，等(1990)Diabetic Med 7211；Byrne，等(1996)Diabetes 451503)。这种类型的糖尿病可能由至少5个不同基因的突变导致，这些基因包括编码糖酵解酶葡糖激酶的基因(Froguel，等(1993)New Engl J Med328697)，编码在胰腺β-细胞中表达的肝富含的转录因子肝细胞核因子HNF-1α(Yamagata，等(1996)Nature 384455)，HNF-1α(Horikawa，等(1997)Nature Genet 17384)和HNF-4α(Yamagata，等(1996)Nature 384458)的基因，以及编码胰岛素启动子因子-1(IPF-1)的基因(Stoffers，等(1997)Nature Genet 17138)。
与中国人种的个体发展2型糖尿病的遗传倾向相关的葡糖激酶以及HNF-1α基因的突变和多态性最初被鉴定在Ng，等(DiabeticMedicine 1999，16956，此处引作参考)，但是其原稿并没有公开如何利用这些突变和多态性鉴定发展2型糖尿病危险性增加的中国人种的个体。
USPN 5,541,060公开了携带MODY的16个法国家族的筛选结果和对于葡糖激酶基因的一些错义突变的鉴定，但是没有一个鉴定的突变与中国血系的个体相关。USPN 5,800,998公开了人HNF-1α的414位核苷酸的一个点突变，但是这个单独的点突变不与中国人个体发展2型糖尿病的遗传倾向相关。
通过基因组扫描墨西哥裔美国人(Hanis，等(1996)Nature Genet)和芬兰(Mahtani，等(1996)Nature Genet 1490)人群，但不是中国人群的个体已经鉴定了非—胰岛素依赖的糖尿病的主要敏感位点。基因组DNA的特定微卫星区可能与密切相关于中国人发展2型糖尿病危险性增加的主要敏感位点相关。例如，Le Stunff，等(Nature Genet(2000)26444)已经报道胰岛素基因的可变串联重复(VNTR)位点的特定等位基因与肥胖和2型糖尿病相关。并且，侧接于葡糖激酶的微卫星多态性也与台湾人群的2型糖尿病相关(Wu，等(1995)Diabetes Res ClinPract 3021)。
发明概述本发明提供了组合物和方法，其中描述了指示中国人群中的成员发展2型糖尿病遗传倾向的遗传标记的独特组合。本发明通过将来自参与胰岛素分泌功能的野生型基因的突变基因序列结合起来举例说明，这些基因包括编码肝细胞核因子-1α(HNF-1α)，葡糖激酶，糊精的基因和线粒体DNA。代表性突变的组合包括HNF-1α的G20R，A116V，IVS2nt→GA，R203H，S432C和I618M，葡糖激酶的V101M，I110T，A119D，Q239R和G385V；糊精的S20G；和线粒体tRNALeu(UUR)的A3243G。通过将它们吸附到芯片上，目的突变基因的组合可以最有效的用于筛选危险性增加的病人。
用于确定或检测中国人种的个体发展2型糖尿病遗传倾向的方法实施方案包括从中国病人获得含基因组核酸的样品，例如活组织检查样本或血液样本，然后将该样本与至少两种目的突变基因的代表性组合接触，然后将样本DNA和病人的DNA置于足以检测至少一个碱基对的核苷酸差异的严格的杂交条件下。或者，利用PCR引物对和PCR-RFLP技术从危险的中国人个体的基因组DNA中筛选特殊的目的基因以鉴定已知与2型糖尿病相关的突变的存在或缺失。
该方法进一步的包括筛选已被诊断为2型糖尿病或者其一个祖先家庭成员患有2型糖尿病的中国人种的个体的基因组DNA，用于确定已鉴定基因的其它突变，或者确定其它候选基因中与中国人群的成员发展2型糖尿病相关的突变，例如与糖尿病导致的肾病和肥胖相关的候选基因的突变。
本发明进一步提供了具体用于鉴定参与胰岛素分泌的野生型基因突变的核酸引物和探针，例如通过PCR或杂交，该野生型基因突变与中国人发展2型糖尿病的危险性增加相关。另外，从带有至少一个与中国人个体发展2型糖尿病的危险性增加相关的突变的基因翻译而来的蛋白在功能诊断性分析中，和在生产与突变体结合不与野生型蛋白结合的诊断抗体中有使用价值。
指示中国人种个体发展2型糖尿病遗传倾向的突变和多态性的预防性检测对于在明显症状和并发症出现之前给医师提供信息以进行早期诊断和治疗非常有用，而且可以使临床医师实施特殊的目的治疗，其符合个体疾病的病原学。
附图简述
图1A指示带有G20R突变的人核因子1α(HNF-1α)外显子1的核酸序列(SEQ ID NO1)。其野生型序列为GenBankU72612的序列。图1B指示带有A116V突变的人核因子1α(HNF-1α)外显子2的核酸序列(SEQ ID NO2)。其野生型序列为GenBank U72613的序列。
图2指示人核因子1α(HNF-1α)外显子3和4的核酸序列，其中描述了剪接受体点突变IVS2nt-1G→A(SEQ ID NO3)以及错义突变R203H(SEQ ID NO4)。野生型序列为GenBank U72614。
图3A指示了带有S432C突变的HNF-1α外显子5和6的核苷酸序列(SEQ ID NO5)。野生型序列为GenBank U72615。
图3B指示了带有I618M突变的HNF-1α外显子10的核苷酸序列(SEQ ID NO5)。野生型序列为GenBank U72618。
图4A指示人葡糖激酶外显子3的核酸序列，其中描述了突变V101M(SEQ ID NO7)，I110T(SEQ ID NO8)和A119D(SEQ ID NO9)。野生型序列为GenBank AF041016。图4B指示人带有Q239R突变的葡糖激酶外显子7的核酸序列(SEQ ID NO10)。野生型序列为GenBank AF041019。图4C指示人带有G385V突变的葡糖激酶外显子9的核酸序列(SEQ ID NO11)。野生型序列为GenBankAF041021。
图5指示了带有S20G突变的人糊精基因外显子3的核酸序列(SEQ ID NO12)。野生型序列为GenBank X52819。
图6指示了人线粒体全基因组中3001-3480的核酸序列碱基对，其中描述了A3243G突变(SEQ ID NO13)。野生型序列为GenBankJ01415。
图7指示了带有葡糖激酶(HK84)或HNF-1α基因(HK10和HK54)突变或多态性的家系。带有糖尿病的个体由实心标记表示；带有空腹葡萄糖受损(IGF)或葡萄糖耐受减低(IGT)的个体用灰色标记表示；非糖尿病的个体用空白框的标记表示，未检测的用阴影表示。箭头表示最早患病的人。被测试者现在的年龄，诊断时的年龄以及葡糖激酶或HNF-1α的基因型也被表示出来N表示正常；M表示突变/多态性。
图8指示了带有mt3243突变的家系。带有糖尿病的个体由实心标记表示，IGF用灰色标记表示，非糖尿病的个体用空白框的标记表示，未检测的用阴影表示。箭头表示最早患病的人。被测试者现在的年龄，诊断时的年龄，听力图和基因型也被表示出来。N表示正常；M表示突变体等位基因。
图9A-9J指示带有HNF-1α(9A-9B)，葡糖激酶(9C-9E)，mt3243(9F-9H)或糊精S20G(9I-9J)基因突变/多态性的10个家系图。带有糖尿病的个体由黑色的标记表示，IFG或IGT个体用灰色标记表示，非糖尿病的或未检测的个体用空白框的标记表示。家族成员的基因型表示为N，野生型等位基因；和M，突变的/变异的等位基因。按顺序依次列出现在的年龄，诊断时的年龄，治疗和并发症。箭头表示最早患病的人。缩写Oral，口服给药；Ins，胰岛素；R，视网膜病；K，蛋白尿；U，神经病；H，听力损伤。
图10表示带有HNF-1αIVS2nt-1G→A突变的中国人家系。带有糖尿病的个体用黑色标记表示，带有IGT的个体用灰色标记表示，未测试的用空白框表示。家族成员的基因型表示为N，正常等位基因；M，突变等位基因。最早患病得人用箭头表示。CP，C-肽；GST，高血糖素刺激试验；并发症R，视网膜病；K，肾病；U，神经病。
具体实施方案的描述本发明提供了组合物和方法，其中描述了遗传标记的一种独特组合就指示中国人群中的成员发展2型糖尿病的一种遗传倾向。本发明的组合物包含(1)来自编码对于胰岛素分泌功能重要的蛋白的野生型基因的核酸序列组合，每个核酸序列都有一种特异性相关于中国人个体发展2型糖尿病遗传倾向的突变，(2)编码葡糖激酶和HNF-1α的核酸序列，并且带有以前未报道的指示中国人发展2型糖尿病危险性增加的突变，(3)一种吸附了至少两种目的突变基因的芯片，和(4)用来检测目的基因中特异性突变的核酸探针。该方法包括(1)从一个中国人种的受试者获得基因组DNA，(2)将基因组DNA与突变的目的核酸组合物结合，或者与用来鉴定突变在目的基因中存在或缺失的引物组合物结合，和(3)或者通过利用杂交技术鉴定病人的DNA和野生型或突变核酸序列之间的错配，或者通过用PCR扩增含假定突变的病人DNA区，然后将扩增子用限制性内切酶酶切和/或进行DNA测序来检测突变的存在和缺失。
本发明的优点包括，本发明的筛选方法使用表现出与带有2型糖尿病的中国血系的人共分离的遗传标记来评价一个特定的病人其发展性2型糖尿病的危险性是否增加。用于筛选的突变和多态性特别适于中国血统的个体。另外一个优点，该筛选可以建立在至少两个不同突变或多态性的组合存在或缺失的基础上以提供更准确和可靠的评价，因为发展2型糖尿病的致病因素是多相的。对于一个个体特定突变或多态性的鉴定有很多优点，通过这些信息医生可以对个体病人提供更特殊和更有效的治疗，并且可以指导病人进行生活方式的调整以改善或延迟糖尿病和相关并发症的症状。因为2型糖尿病是一种潜伏性疾病，因此指示中国人个体发展该病倾向的遗传标记的代表性组合物可被用于筛选发展2型糖尿病危险性增加的个体的人群，这样他们可以在意识到明显症状或并发症之前接受合适的治疗。同样的，也可筛选被诊断具有2型糖尿病的个体的家庭成员以寻找感染个体的突变/多态性以迅速鉴定发展2型糖尿病的危险性也增加的家庭成员。
中国人群的成员可以包括中国人血统的任何个体。在特定的情况下，例如如果参与胰岛素分泌的基因中的一个突变对于中国个体发展性2型糖尿病危险性的增加是支配性的，中国人群的成员将包括那些至少父母一方带有中国血统的个体。中国人群的成员可以通过HLA单倍型分型被更特异性的鉴定。例如，在香港中国人群众中HLAI和II类的频率已经被Chang和Hawkins研究(Hum Immunol(1997)56125)。已经进行了大量研究以确定更频繁或甚至独特的出现在一个中国人群的成员中的HLAI和II类的等位基因和具有很强的关联性的等位基因。Shaw等人和Shen等人已经研究了台湾的中国人群的HLA多态性和等位基因的频率以及关联性(Tissue Antigens(1997)50610；Tissue Antigens(1999)5351；J Formos Med Assoc(1999)9811)。中国大陆的中国人个体中发现的等位基因频率和关联性已经被Trejaut等人(Eur J Immunogenet(1996)23437)，Shieh，等人(Transfusion(1996)36818)，Zhao等人(Eur J Immunogenet(1993)20293)，Wang，等人(TissueAntigens(1993)41223；Hum Immunol(1992)33129)，Lee，等人(EurJ.Immunogenet(1999)26275)，和Gao等人(Hum Immunol(1991)32269；Tissue Antigens(1991)3824；Immunogenetics(1991)34401)报道。此外，一个中国人个体也可通过本领域技术人员公知的“DNA指纹”技术进行客观的限定，其鉴定了特异于中国血系的个体的微卫星区，短串联重复区(STR)和可变数目的串联重复区(VNTR)。这种人种基因型研究的大量实施例已经被报道(Meng，等(1999)J ForensicSci 441273；Yoshimoto，等(1999)Int J Legal Med 11315；Wu，等(1999)J Forensic Sci 441039；Evett，等(1996)Am J Hum Genet 58398；Gill and Evett(1995)Genetica 9669；Balazs(1993)EXS 67193；Lan，等(1992)Arch Knminol 189169；and Hwu，等(1992)J FonnosMed Assoc 91839)。上述的所有参考文献在此引入作为参考。
虽然胰岛素抗性是显示2型糖尿病的有力指标，但是其不足以证明该病(So，等(2000)Hong Kong J.Med 669-76)。胰岛素的相对不足对于高血糖的发展很重要，建立了一个恶性循环，其中葡萄糖水平的提高对于胰β-细胞是有毒的，因此诱导了胰岛素抗性并降低了β-细胞分泌功能。基于胰岛素分泌和活性之间的内在关联，本发明通过将参与胰岛素分泌功能的野生型基因的突变基因组合起来进行例证，这些野生型基因包括肝细胞核因子1α(HNF-1α)，葡糖激酶，糊精和线粒体DNA。“参与胰岛素分泌功能的基因”和“参与胰岛素分泌的基因”是其多相突变对于正常胰β-细胞分泌功能有显性-负影响的目的基因。本发明主要考虑基因标记的典型排列，其组合特异性指示中国人群成员发展2型糖尿病的遗传倾向(下文是指“目的基因”)。典型排列的组合通过HNF-1α的G20R，A116V，IVS2nt→GA，R203H，S432C和I618M；葡糖激酶的V101M，I110T，A119D，Q239R和G385V；糊精的S20G；以及线粒体tRNALEU(UUR)的A3243G进行例证。突变IVS2nt→GA代表剪接受体点突变，其可能来自一个截短的翻译产物。
目的突变基因的代表性组合在预防性的筛选中有特定的应用，其可用于筛选(i)年轻起病的成年型糖尿病(MODY)的中国人个体以确定他们的病因，(ii)具有2型糖尿病阳性家族史的中国人个体以确定他们发展糖尿病症状的可能性，和(iii)因为相关的表型特征，确信有发展糖尿病症状较大危险的中国人个体(即肥胖个体)。
通过将目的突变基因的组合吸附到芯片或其它固相支持物可以最有效的用于筛选危险性增加的个体。一种特殊种类的芯片是没有界限的，除了其必须能够呈现至少两种不同的核酸序列的典型排列以外，每个核酸序列必须带有一个指示中国人个体发展2型糖尿病危险性增加的突变或多态性。此外，将代表性野生型核酸序列吸附到芯片上作为对照是非常有用的。芯片通常包括大量的不同核酸序列，通常至少10个，更一般至少20个，经常至少50个，但是可能达到100个或更多。用于本发明的芯片是本领域公知的(例如，参见USPN5,741,644，5,837,832和6,183,970)。此外，其它的固相基质也可用于共价吸附目的突变核酸序列的代表性组合，包括珠子和载玻片。固体支撑物可以由玻璃或氧化硅或其他的材料制成，这些材料可以通过导入与寡核苷酸反应的功能基团以适应性的共价吸附到寡核苷酸序列。
可用多种方法将核酸结合到固相基质上。通过使用化学上起反应的固相基质，可以将化学反应活跃的基团连接到核酸上，其将与化学反应活跃的固相基质表面反应。例如，通过在表面上使用硅酸酯，卤化物或其它的活性硅，核酸可以被修饰和硅元件反应。可以形成硅酯将核酸共价连接到表面上。除了硅功能基团，人们可以使用有机添加聚合物，例如，苯乙烯，丙烯酸树脂和异丁烯酸树脂，乙烯醚和酯，等，功能基团一旦出现就会与核酸上出现的功能基团反应。例如，氨基，活性卤化物，羧基，巯基，环氧化物等可以用传统的方式被提供。连接键可以是酰胺，脒，酯，醚，硫醚，二硫醚，等。形成这些共价键的方法可以在USPN 5,565,324和USPN 6,156,501中找到。
本发明也考虑了微检测系统和试剂盒，其包括吸附了典型核酸序列排列的固相支撑物，每个核酸序列都带有一种与中国个体发展2型糖尿病遗传倾向相关联的突变或多态性。微检测系统或试剂盒可包括，例如，芯片或珠粒，吸附来自编码参与胰岛素分泌功能蛋白的基因的野生型或突变核酸序列，优选的野生型和突变序列来自HNF-1α，葡糖激酶，糊精和线粒体DNA。另外，在严格条件下已知与固定在支持物上的那些序列杂交和不杂交的突变和野生型序列应该分别包括阳性和阴性对照。带有核酸序列固定在固相支持物上的微检测系统或试剂盒将包括通过杂交检测(荧光或放射性信号的双重形式)的筛选。可选择的另外的微检测系统或试剂盒将包括退火后与编码参与胰岛素分泌的核酸序列结合的引物对。特异性退火后与公认的含有与2型糖尿病相关的突变的基因的侧翼区结合，因此用这样的引物进行的PCR扩增将指示相关目的突变的存在。这样的试剂盒或微检测系统也包括典型突变或野生型的序列作为对照，并且利用PCR测序或通过PCR限制性片段长度多态性分析(RFLP)和电泳进行筛选。
2型糖尿病是一种多相性疾病，没有一种单独的突变或单独的突变基因完全负责其症状表现。因此，将至少两种编码与中国血系的个体发展2型糖尿病危险性增加密切相关的突变体或多态性的不同核酸序列组合在一起吸附到芯片上或者单独筛选。“至少两种不同的核酸序列”是指来自相同野生型基因的具有不同突变的两种不同核酸序列，或者来自两种不同野生型基因的两种不同的突变核酸序列。优选的，至少一种突变序列，HNF-1α的A116V(SEQ ID NO2)，V101M(SEQID NO7)或Q239R(SEQ ID NO10)被吸附到芯片或者固相支持物上。野生型基因是指与2型糖尿病不相关的基因，包括野生型基因的任何等位变异型，以任何频率，编码不诱导病理特征以预期的形式发挥功能的蛋白的基因。突变基因是指，其序列已经通过插入，缺失或者取代至少一个核酸碱基队而被修饰，其中这种修饰与野生型基因产物相比可能在突变基因的产物的表达或功能上产生可以检测到的变化。在本发明的目的基因中，突变基因与2型糖尿病相关。核酸序列可能来自基因组DNA，互补DNA(cDNA)或来自信使RNA(mRNA)。它们可以是合成的或者分离自人体组织或者体液的。突变优选发生在，但不是必须发生在，核酸序列的翻译区，该核酸序列编码以野生型形式参与葡萄糖代谢或胰岛素分泌的蛋白。
在翻译的核酸序列中，突变可以是错义突变，一个氨基酸被另外一个氨基酸代替，或者无义突变，用终止子代替了一个氨基酸。突变也可以是在编码或非编码区插入或缺失至少一个核酸，例如控制基因转录的区域，包括启动子，增强子，反应元件，信号序列和聚腺苷酸化信号，等。单核苷酸多态性(SNPs)，优选的但不必须发生在编码参与葡萄糖代谢或胰岛素分泌并且与2型糖尿病危险性增加相关的核酸序列的翻译区，也是本发明考虑的范围。这种SNPs的鉴定可以通过将已知的家庭成员的2型糖尿病共分离的基因的突变与疾病的显性史相关联来进行。另外，也可通过基因组范围的扫描和家族血系的关联性分析鉴定发生在翻译区和非翻译区的SNPs。微阵列技术也可被方便的用于鉴定目的SNPs。
用于鉴定和检测中国人个体发展2型糖尿病遗传倾向的方法实施方案包括从中国人病人获得含有基因组核酸的样品，例如来自尸检组织或活组织，或血液样品，然后将样品与至少两个目的突变基因的典型组合物接触，再将样品DNA和病人的DNA一起置于严格的至少能检测到一个碱基对的核苷酸区别的杂交条件下。可选择的，将来自处于危险的中国人个体基因组DNA的特殊目的基因进行限制性片段酶切，然后用PCR引物对和PCR-RFLP技术进行筛选以鉴定已知与2型糖尿病相关的突变的存在或缺失。本方法进一步的包括筛选被诊断为2型糖尿病或有一个祖先家族成员有2型糖尿病的中国人个体的基因组DNA，用于在鉴定的基因中寻找其它的相关突变，或者在其它的候选基因中例如糖尿病引起的肾病或肥胖相关的基因中寻找与中国人群的成员发展2型糖尿病的倾向相关的突变。在具有发展性2型糖尿病阳性家族史的中国家族(即，具有发展MODY成员的家族)中突变被最有效的鉴定到。但是，鉴定到的相关突变可用于鉴定中国人群中的任何成员的危险性的增加。
在实施鉴定与发展性2型糖尿病危险性增加的中国个体的基因型相关的突变的方法时，通过使用常规的诊断标准和面谈程序进行临床试验，家系分析以及关联性分析鉴定具有(i)确诊为2型糖尿病(ii)2型糖尿病阳性家族史或(iii)表型被确定为增加的危险因素(例如肥胖)的中国人受验者，并且DNA或RNA样品获得自受试者。
基因组DNA的样品获得自任何成核细胞或体液。适于临床试验的细胞来源的例子包括血细胞，口腔细胞，宫颈细胞，来自尿的上皮细胞，胚胎细胞，和任何在获得的活体组织中出现的细胞。体液包括血液，尿，脑脊髓液，羊水，和感染或发炎位点的组织渗出液。DNA的提取采用任何本领域的多种方法从细胞源或组织液获得。可以理解，用来提取DNA的特定方法将依赖于来源的特点。
因此采用多种技术以鉴定新的或已知突变序列的存在和缺失。首先，采用本领域技术人员熟知的方法，将已知参与胰岛素分泌功能的基因序列直接进行DNA测序。可以采用PCR-RFLP检测突变，其中寡核苷酸对被用作引物进行扩增，并且将扩增产物，用限制性内切酶切割或没切割的产物的大小与对照产物进行比较。其它有用的技术包括单链构象多态性分析(SSCP)，变性梯度凝胶电泳，和双向凝胶电泳，EMC等。可以选择性的利用含有目的突变的核酸探针在足够严格的杂交条件下检测已知突变的，例如本发明列举的突变。
用于鉴定参与胰岛素分泌基因的突变序列中至少一个碱基对突变的适宜严格条件，例如，在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)溶液中，至少42℃，优选的在大约43，44或45℃，然后用2×SSC50℃洗涤，是本领域技术人员公知的或者可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)找到。为了优化条件，盐和温度都可以改变，或者温度或盐浓度在其它可变化的条件改变的情况下保持恒定。例如，清洗步骤中的盐浓度可以选自较低严格条件的大约2×SSC，50℃到较高严格条件的大约0.2×SSC，50℃。清洗步骤中的温度可以从低严格条件的室温，大约22℃到高严格条件的大约65℃。另外优化的条件还依赖于使用的核酸探针的长度，以及杂交发生的比例。使用核苷酸吸附到芯片上的高严格杂交条件可能需要较低的温度。人们可以进行一系列常规热平衡试验以确定野生型和目的突变基因序列之间的最佳杂交区别，通过起始于低严格条件的20℃然后以连续的5℃的温度间隔提高温度进行。
本发明的核酸探针是来自目的突变基因的核酸序列。至少8，12，15或20碱基对长，但是可以是50，80或100碱基对长，甚至250或500碱基对长，并且包括至少包括一个相关突变，但可能包括多个突变，可能象转录的基因那么长。探针长度的选择优选的依赖于较短探针的较好碱基对错配差别以及较长探针的较好双重稳定性(参见USPN 6,156,601和USPN 6,197,506，此处引作参考)。使用的探针的长度应该满足能够区分突变和野生型之间至少一个碱基对的突变。
为了检测杂交的探针，虽然其它的检测方法也可实施光检测手段是优选的，，例如放射性，原子光谱，等。对于光检测手段，可以使用荧光，磷光，吸收，化学发光，等。最方便的是荧光，其可以有很多形式。可以使用单独的荧光素或成对的荧光素，尤其是当需要大量的带有Stokes位移的发射波长时。有用荧光素的例子包括荧光素，蓝光硷性蕊香红，德克萨斯红，菁染料，藻红素，噻唑橙和蓝，等等。当使用染料对的时候，可以使一种染料染一种分子，另外一种染料染与第一种分子结合的分子。例如，用一种染料染第一种或结合的组分，另外一种染料染第二种或络合组分。重要的因素是当两种组分结合的时候，两种染料彼此接近到满足足够高效的能量传递(参见USPN5,992,617)。
已知突变存在和缺失的鉴定也可用PCR以及限制性分析和/或用本领域公知的测序技术很方便的检测。PCR分析进一步提供了有效的技术，用于鉴定在已知含有与中国人个体发展2型糖尿病的倾向相关的突变的基因中新的突变，或者在其它候选基因中鉴定相关突变。PCR引物的长度应该至少12碱基对，优选15-18碱基对，且可能25-30碱基对。他们可被设计退火到侧接于目的基因的突变区的野生型基因序列，这样从引物的延伸扩增了一个能够检测目的突变的存在或缺失的区域。引物也可被设计为，象预期的那样只有在野生型或突变基因存在的情况下其延伸才可以产生扩增的序列。可以通过设计在3′末端有至少一个核苷酸与野生型序列错配，但是与突变序列相配的引物来完成。本发明采用被用来筛选HNF-1α，葡糖激酶，糊精，和人线粒体DNA突变的引物对作为例子。特别感兴趣的是能被用来筛选HNF-1α和葡糖激酶突变但尚未报道的核酸引物(例如参见SEQ ID Nos34-36)。在芯片上也可以同时进行多个核酸样品的测序(参见USPN6,197,506)。
对于SSCP，引物被设计以扩增大约250-300bp长的DNA产物跨越目的基因的非重复片段。对于每个扩增产物，使用一个凝胶系统和两个电泳条件。每个扩增产物被加到到含10％甘油的10％的聚丙烯酰胺凝胶上。每个扩增产物的等分在8W室温条件下电泳16小时和在30W 4℃下电泳5.4小时。这些条件从前指示鉴定了CFTR基因的98％的已知突变(Ravnik-Glavac等(1994)Hum Mol Genet3801)。
如同相关目的突变的鉴定，与中国人个体发展2型糖尿病危险性增加相关的相关SNPs的鉴定可以通过目的基因组或互补DNA区的核酸测序来进行。使用微阵列技术筛选SNPs是最有效的，即将吸附到例如芯片的固体支持物上核酸序列处于杂交条件下使得在只有一个核苷酸区别的两个核酸序列之间进行区别(例如参见Wang，等(1998)Science 2801077；和Hacia，等(1998)Nature Genet 18155)。或者，分子量分光光度计可被用来鉴定具有单核苷酸多态性的PCR产物的小分子量的区别(参见Kirpekar等(1998)Nucleic Acids Res 262554)。分析遗传信息的另一种方法是“动态等位基因特异性杂交”(DASH)。该技术利用多孔板上标记的寡核苷酸，当双链存在时发荧光，单链存在时不发荧光。加入被检测的单链DNA可使链杂交。链变性温度下可以鉴定SNP上的碱基。DASH技术的优点是技术简单，不需要昂贵的设备。其它用于筛选与中国人发展2型糖尿病的遗传倾向相关的SNPs的技术包括核酸外切酶抗性，微量测序，ddNTP的液相或固相延伸，以及寡核苷酸连接检测(描述在USPN 5,952,174，此处引作参考)))))))))))))))。
利用上述的任何技术检测SNP相关突变的存在后，通过直接DNA序列分析或限制性分析或二者结合鉴定包含突变的特殊核酸的改变。在这种情况下，编码参与胰岛素分泌的蛋白的基因中，或与肥胖或糖尿病导致的肾病相关的基因中从前没有被鉴定的突变可以被鉴定。例如，其它的已知与中国受试者的家族性2型糖尿病密切相关的基因的新突变也可被鉴定(例如其它的MODY基因)。其它MODY基因的例子包括肝细胞核因子4α(HNF-4α)，肝细胞核因子1β(HNF-1β)，和胰岛素启动子因子1(IPF-1)。因为野生型基因的突变或多态性显性相关于中国人个体的2型糖尿病和肾病，特别用于筛选的其它候选基因包括那些编码血管紧张素转化酶(ACE)/血管紧张肽原，(AGT)，(Tomino，等(1999)Nephron 82139；Hsieh，等(2000)Nephrol Dial Transplant 151008；Thomas，等(2001)Diabetes Care 24；356)，醛糖还原酶(Ko，等(1995)Diabetes 44727；Moczulski，等(1999)Diabetologia 4294)，和血纤维蛋白溶酶原激活抑制剂-I(PAI-1)，(Wong，等(2000)Kidney Int57632)的基因。
编码参与葡萄糖代谢，胰岛素抗性，肥胖和糖尿病导致的肾病的基因的核酸序列也可被筛选出来，来鉴定例如影响胰岛素与其受体结合的蛋白，参与胰岛素信号传导的蛋白，影响葡萄糖吸收和细胞代谢的蛋白中的突变。特定的例子包括在胰岛素受体α和β链，胰岛素受体底物蛋白(IRS-1和IRS-2)，葡萄糖运输蛋白GLUT2和GLUT4，和转录因子HNF-3β和Neuro D/Beta2以及相关的任何鉴定到的指示2型糖尿病达的突变和/或多态性中的相关突变。其他人群中，其突变或多态性指示与2型糖尿病和肥胖相关的候选基因包括基因编码转运GLUT4(Abel，等(2001)Nature 409729)，β-3-肾上腺素受体(Oeverenvanybicz，等(2001)Diabetes Obes Metab 347)，激素抵抗素(Steppan，等2001)Nature 409307)，过氧物酶体增殖激活受体γ2(PPARγ)(Hasstedt，等(2001)J Clin Endocrinol Metab 86536)，解偶合蛋白-1(UCP-1)(Heilbronn，等(2000)Diabetologia 43242)，肥胖蛋白(Ohshiro，等2000)J Mol Med 78516)，G蛋白质β3亚基和胰岛素受体基质-1(osskopf，等(2000)5484)，和多巴胺D2受体(Jenkinson，等(2000)Int Obes Relat Metab Disord 241233)。此外，在其他人群中表现出与2型糖尿病和肾病密切相关的突变或多态性包括编码G蛋白β3亚基(Beige，等(2000)Nephrol Dial Transplant 151384；Zychma，等(2000)Am J Nephrol 20305)，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)(Shpichinetsky，等(2000)J Nutr 1302493，葡萄糖运输GLUT1(Grzeszczak，等(2001)Kidney Int 59631)，和对氧磷酶(PON1)(Inoue，等(2000)Metabolism 491400)的基因。
此外，携带至少一个与中国人个体发展2型糖尿病危险性增加相关的突变的基因翻译而来的蛋白也是本发明考虑的范围，这些蛋白在功能性诊断化验以及生产与突变而非野生型蛋白结合的抗体中有应用价值。多肽可能是整个突变基因的翻译产物，也可能是其含有至少一个目的突变的12个或更多个氨基酸的肽。多肽可从人的活体或尸体体组织中分离而来，或者通过本领域技术人员公知的重组DNA的方法在异源细胞中产生(公开于Molecular Cloning，A LaboratoryManual(第二版，Sambrook，Fritsch and Maniatis，Cold Spring Harbor，1989)，或Current Protocols in Molecular Biology(Eds.Aufubel，Brent，Kingston，More，Feidman，Smith和Stuhl，Greene Publ.Assoc.，Wiley-Interscience，NY，N.Y.，1992)，这两篇参考文献此处引作参考)。含有HNF-1α-，葡糖激酶-，或糊精的特异性序列的肽可以来自上述分离的较大多肽，其采用本领域技术人员公知的蛋白酶例如胰岛素的蛋白裂解技术以及例如溴化氰的化学处理进行。或者，60个残基长度的肽可采用市售的肽合成仪以毫克量常规合成。
重组翻译产物从含有编码参与胰岛素分泌的野生型核酸序列的突变核酸序列的载体表达。突变的目的核酸的例子包括那些编码带有一个氨基酸残基改变的HNF-1α，葡糖激酶或糊精的核酸序列见SEQ IDNos1-13，尤其是SEQ ID NO2，SEQ ID NO7以及SEQ ID NO10。包括质粒和真菌载体的大量载体已经被描述用于在多种原核和真核宿主中的表达，也可被用于基因治疗或单个蛋白表达。用于表达的载体也包括操作性连接到编码部分突变蛋白的启动子，其优选为编码至少12个氨基酸残基的目的突变基因的cDNA序列或其一部分。编码肽的表达可通过采用任何市售合适的载体，以及任何合适的宿主，通过此处公开或引述的本相关领域技术人员公知的方法进行。载体/宿主的特定选择对于本发明的操作并不重要。
合适的宿主包括细菌，古细菌，真菌，特别是酵母，和植物和动物细胞，特别是哺乳动物细胞。特别感兴趣的是大肠杆菌，枯草杆菌，酿酒酵甲，SF9细胞，C129细胞，293细胞，脉孢菌，和CHO细胞，COS细胞，HeLa细胞，和无限增殖哺乳动物骨髓和淋巴样细胞系。优选的复制系统包括M13，ColEl，SV40，杆状病毒，λ噬菌体，腺病毒，等等。大量转录终止和调节区已经被分离，并且已经表现出在多种宿主中对于异源蛋白转录和翻译的有效性。这些区域的实例，分离方法，操作方式，等是本领域公知的。在合适的表达条件下，宿主细胞可作为重组产生目的突变多肽的来源。
突变HNF-1α，葡糖激酶或糊精，和/或其部分片段的翻译产物可用来产生特异性抗体。抗体可以是多克隆或单克隆的，可以相应于完全翻译的多肽或上述合成的肽产生。这些抗体可以采用公开于Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988，或其它此处引用的参考文献的方法和组合物，以及本领域技术人员公知的免疫和杂交瘤技术方便的制备。重要的是，来自携带至少一个与2型糖尿病相关的突变的核酸序列的翻译产物相抗的抗体应该区分突变氨基酸序列以及野生型氨基酸序列。尤其是，抗体对于野生型序列有很少的或者根本没有交叉反应。优选的，抗-突变蛋白抗体与突变多肽的亲和力应该较野生型多肽高，与突变多肽的结合水平为500∶1更优选的为1,000∶1，大于与野生型多肽的结合。
根据常规的方法，根据常规的途径可利用对应于含有一个目的突变的全长突变多肽或至少12个氨基酸长的分离的肽免疫哺乳动物(例如，小鼠或高等哺乳动物，灵长类，或嵌合或转基因动物产生人免疫球蛋白)。参见US专利4,172,124；4,350,683；4,361,549；以及4,464,465。杂交瘤的制备通过将合适的骨髓瘤细胞系，例如NS/1，Ag8.6.5.3，等与外周血淋巴细胞，脾细胞或其它的免疫宿主的淋巴细胞融合产生无限增殖的B-淋巴细胞(例如杂交瘤，异源骨髓瘤，EBV转化细胞，等)，选择，克隆，筛选用于结合参与胰岛素分泌或葡萄糖代谢的野生型蛋白的突变多肽。抗目的突变多肽序列的单克隆抗体可以是任一免疫球蛋白例如IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，优选为IgG或IgM，还可能是这些种类的亚种。可采用整个抗体，或其保持结合活性的部分例如，Fab，F(ab′)2，等等。一旦有与突变多肽特异性结合的合适抗体，这些抗体可用于筛选。区分HNF-1α，葡糖激酶，糊精，或其它参与胰岛素分泌功能的突变/野生型蛋白对正常或突变的抗体可被用于实施ELISA，EMIT，CEDIA，SLIFA等的诊断检测。
为了评估发展性疾病的所有危险性或者设计被诊断病人的个人治疗方案，被鉴定到的指示中国人个体发展2型糖尿病的突变以及多态性与被筛选病人的表型参数相关并通过考虑疾病的阳性和阴性家族史进行解释。遗传研究和显示激素水平(生长激素，肾上腺素，皮质激素，去甲肾上腺素，胰岛素)，人体测量数(体重指标，腰围臀围比例)，血液动力学(血压)，心血管危险指数(HDL，LDL，胆固醇，甘油三酸酯)和自身免疫性(抗谷氨酸脱羧酶抗体)的个体参数相关。例如，在葡糖激酶基因中有一个突变的病人不可能发展症状，但是在葡糖激酶基因以及HNF-1α基因中均有一个突变的病人或者在葡糖激酶基因中有一个突变并且有发展明显2型糖尿病肥胖表型特征的病人发展症状的可能性就相对较高。疾病的阳性家族史将大大提高预测的倾向性。虽然病人没有表现发展疾病的征兆，或者虽然表现初步的征兆例如葡萄糖耐量低减(IGT)，但是获得的遗传性评估能够使医生开始治疗或者建议病人生活方式改变以阻止明显症状的出现或者进一步发展。例如，被鉴定在HNF-1α基因和ITG有一个突变的病人可以及早进行饮食和/或口服药品和/或胰岛素治疗以防止或改善胰腺β-细胞的高血糖毒性以及由于胰腺β-细胞死亡导致的胰岛素分泌功能的进一步紊乱。通过这种方式，与发展性2型糖尿病相关的严重并发症例如，肾病，视网膜病以及感觉神经能力的下降可被更加普遍的避免。
除了使临床医生更好的调整传统治疗2型糖尿病的方案，例如饮食，口服给药和胰岛素，相关突变的鉴定能够使临床医生设计调整治疗方案，例如给病人导入野生型基因替换编码功能失调蛋白的突变基因。采用基因治疗的方法，通过将治疗用转录或表达载体，以裸DNA，与脂质载体联合，特别是阴离子脂质载体，或者插入到病毒载体，例如重组腺病毒的形式导入到哺乳动物宿主获得体内转染。可以以多种途径导入哺乳动物宿主，包括静脉内或腹膜内注射，气管，鞘内，关节内，胃肠外，鼻内，肌内，局部，经皮肤，实施到任何黏膜表面，角膜等。尤其是将治疗表达载体导入循环体液或体孔或体腔，例如心脏。因此，静脉内注射或鞘内注射尤其需要，因为随着这种给药的方式，载体可以广泛分布，气雾剂给药在导入到体孔或体腔时有用。依据给药的路线以及给药的部位，可以以特定的细胞和组织作为靶点。例如，在血流方向靠近注射位点的组织可以在缺少任何特殊靶点的情况下被转染。可以使用动脉管将表达载体导入器官中例如，心脏或肾脏。可通过使用眼滴剂或注射到眼睛直接进入眼睛。为了达到神经，可通过注射到神经或注射到池体区。如果使用脂质载体，可通过使用位点指示分子修饰脂质载体指引复合物到特殊的细胞类型。因此，特定受体的抗体或配基或其它的细胞表面蛋白可与和特定表面蛋白相关的靶细胞一起被使用。将氨基末端线粒体靶序列与核酸结合可用来追踪线粒体核酸。参见See Taylor等，Nature Genetics 15212-215，1997。
根据给药途径，可以使用任何生理可接受的介质施加DNA，重组病毒载体或脂质载体，例如，去离子水，生理盐水，磷酸缓冲盐水，5％葡萄糖水，等等如上所述用作药物组合物。在配方中可以包括其它的组分，例如缓冲液，稳定剂，杀虫剂等。这些组分在文献中有大量的例子此处不需要特殊描述。任何导致复合物聚集的稀释剂或稀释剂的组分应该被避免，包括高盐，鳌合剂，等。
治疗载体的使用量应该足以满足提供糖尿病并发症目标组织的治疗用表达水平，或者进入血流后足以提供多种组织的充分分布，并且在目标组织提供治疗水平的表达。治疗水平的表达是指表达量充分道足以防止，治疗，或减轻一种或多种糖尿病并发症或糖尿病并发症的症状。此外，使用的核酸载体的剂量足以在感染组织或体内组织产生需要水平的转基因表达。其它的DNA序列，例如腺病毒VA基因可以包括在给药介质中并且与目的基因共转染。如果需要，编码腺病毒VA基因产物的基因的存在可以大大加强从表达盒转录而来的mRNA的翻译。
大量因子可以影响转染组织中的表达量，并且因此可被用来调整表达水平来满足特殊目的。如果需要高水平的表达，所有的因子可被优化，如果需要较少表达，可以改变一个或多个参数获得需要的表达水平。例如，如果高表达超过了治疗范围，可以使用较优化条件差的条件。
重组基因的表达水平和表达组织可以如上所述在mRNA的水平，和/或多肽或蛋白的水平决定。基因产物可通过检测其在组织中的生物活性来定量。例如，可采用如上所述的免疫检测，生物测定例如抑制ROS，或通过免疫染色技术鉴定转染细胞中的基因产物来测量蛋白活性，例如探测特异性识别表达盒中存在的基因产物或报告基因产物的抗体。
典型的，治疗盒并不整合到病人的基因组。如果需要，治疗可以依据依赖于所获结果的特定基础反复进行。如果重复治疗，应该对病人进行监控，来保证没有针对治疗的不良免疫或其它反应。
下列实施例是以作为本发明例子的方式提出，并不是对于本发明的限制。
实施例实施例1具有早发2型糖尿病的中国病人/MODY的葡萄糖激酶以及肝细胞核因子1α基因的鉴定本实施例例举了鉴定到的一群中国病人的葡萄糖激酶以及肝细胞核因子1α以及HNF-4α基因的突变。早发2型糖尿病的中国病人葡萄糖激酶以及HNF-1α基因的突变相对普遍，而且他们分别占了目前早发2型糖尿病的中国病人的大约3％和5％。
试验设计和方法受试者这个研究组包括92个不相关的病人(年龄34±5岁(平均年龄±SD)范围18-40岁，30个男性，62个女性)，他们在40岁以前被诊断为2型糖尿病并且有阳性家族史(至少第一种水平与2型糖尿病相关)。诊断时的平均年龄为30±5岁(年龄范围在16-40岁之间)。13(14％)个病人满足MODY(在25岁之前被诊断并且连续两代表现糖尿病)的最低标准。这些病人选自威尔士亲王医院糖尿病和内分泌中心包含1800个病例的登记在案的数据库。如果可以，征募带有MODY基因突变的疾病渊源者的家庭成员然后进行75-克的口服葡萄糖耐受试验(OGTT)。在医院职员或学生中征募100个没有糖尿病家族史的健康的中国人(年龄33±10岁，40个男性，60个女性)作为对照。经每个受试者同意采集血样用于DNA分离和检测临床参数。这项研究经香港中文大学临床研究道德委员会的批准。
突变的葡萄糖激酶，HNF-1α和HNF-4α基因的筛选通过描述于(Froguel，等(1993)N Engl J Med 328697；Yamagata，等 (1996)Nature 384455；Yamagata，等(1996)Nature 384458))))))))))))))))的聚合酶链式反应(PCR)产物的直接测序筛选葡萄糖激酶(β细胞形式)，HNF-1α和HNF-4α(HNF-4α2形式)基因的最小启动子区和外显子区的突变。通过PCR限制性长度多态性(RFLP)鉴定其他家庭成员和对照中可能突变的存在。如果核酸取代不能导致获得或失去限制性位点，就将人工限制性位点导入野生型或突变序列。简要的，直接测序鉴定到独特于中国受试者的HNF-1α基因中的5个突变(G20RR203HS432CI618M和IVS2nt-1G→A)以及葡萄糖激酶基因中的3个突变(I110TA119D和G385V)。筛选如下采用正向引物5′-GGCAGGCAAACGCAACCCACG-3′(SEQ IDNO14)和修饰的反向引物5′-CAGTGCCTCTTTGCTCAGGC-3′(SEQ IDNO15)进行PCR扩增然后用StuI降解来筛选HNF-1α的G20R。野生型等位基因指示19和140bp的产物，而突变等位基因指示159bp的产物。
采用正向引物5′-TGCCTGCAGAGTTCACCCATG-3′(SEQ IDNO16)和修饰的反向引物5′-ATCTGCTGGGATGCTGGGCCCCACTTGCAA-3′(SEQ ID NO17)进行PCR扩增然后用BsrDI降解来筛选HNF-1α的R203H。野生型等位基因显示121bp的产物，而突变等位基因显示26和95bp的产物。
采用正向引物5′-TGGAGCAGTCCCTAGGGAGGC-3′(SEQIDNO18)和修饰的反向引物5′-GTTGCCCCATGAGCCTCCCAC-3′(SEQ ID NO19)进行PCR扩增然后用Cac8I降解来筛选HNF-1α的S432C。野生型等位基因显示104bp的产物，而突变等位基因显示37，67和21bp的产物。
采用正向引物5′-GTACCCCTAGGGACAGGCAGG-3′(SEQ IDNO20)和反向引物5′-ACCCCCCAAGCAGGCAGTACA-3′(SEQ IDNO21)进行PCR扩增然后用TaqI降解来筛选HNF-1α的I618M。野生型等位基因显示88和160bp的产物，而突变等位基因显示248bp的产物。
采用正向引物5′-GGGCAAGGTCAGGGGAATGGA-3′(SEQ IDNO22)和反向引物5′-CAGCCCAGACCAAACCAGCAC-3′(SEQ IDNO23)进行PCR扩增然后用PstI降解来筛选HNF-1α的IVS2nt-1G→A。野生型等位基因显示73和231bp的产物，而突变等位基因显示304bp的产物。
采用正向引物5′-GTCCCTGAGGCTGACACACTT-3′(SEQ IDNO24)和反向引物5′-AGCTGGGCCCTGAGATCCTGCA-3′(SEQ IDNO25)进行PCR扩增然后用FokI降解来筛选葡萄糖激酶I110T。野生型等位基因指示108和142bp的产物，而突变等位基因指示250bp的产物。
采用正向引物5′-ACCTGGGTGGCACTAACTTCA-3′(SEQ IDNO26)和反向引物5′-CGGCCCCTGCGCTGCTCACCATCTGA-3′(SEQID NO27))进行PCR扩增然后用BclI降解来筛选葡萄糖激酶的A119D。野生型等位基因指示150bp的产物，而突变等位基因指示28和122bp的产物。
采用正向引物5′-GGACTGTCGGAGCGACACTCA-3′(SEQ IDNO28)和反向引物55′-GCGGTTGATGACGCCTGCCAG-3′(SEQ IDNO29)进行PCR扩增然后用FauI降解来筛选葡萄糖激酶的G385V。野生型等位基因指示5,22,44和137bp的产物，而突变等位基因指示5,44和159bp的产物。
糊精基因中的突变(S20G)和线粒体DNA的突变(A3243G)的筛选如下。
采用正向引物5′-TCACATTTGTTCCATGTTAC-3′(SEQ ID NO30)和反向引物5′-CAATAACTATAGAGTTACATTG-3′(SEQ ID NO31)进行PCR扩增然后用MspI降解来筛选糊精S20G。野生型等位基因指示239bp的产物，而突变等位基因指示99和140bp的产物。
采用正向引物5′-AAGGTTCGTTTGTTCAACGA-3′(SEQ IDNO32)和反向引物5′-AGCGAAGGGTTGTAGTAGCC-3′(SEQ IDNO33)进行PCR扩增然后在最后一个循环用α32PdATP来标记PCR产物。PCR产物用ApaI降解然后在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分析。野生型等位基因指示427bp的产物，而突变等位基因指示214bp的产物。
临床研究所有的病人进行结构分析包括家族史记录，诊断年龄以及身体重量参数(BMI)(Piwemetz，等(1993)Diabetic Med 10371；Chan，等(1997)Hong Kong Auth Qual Bull 23)。家族史记录两代，只是因为祖父母的糖尿病状况往往不知晓。采集空腹后的血样用来检测葡萄糖，C-肽以及糖基化血红蛋白(HbA1c)。肥胖定义为男性BMI≥27kg/m2，女性≥25kg/m2(National Diabetes Data Group(1979)Diabetes 281039)。
检测用葡萄糖氧化酶的方法测定血浆葡萄糖的浓度(DiagnosticChemicals，Charlottetown，Prince Edward Island，Canada)。通过放射性免疫(Novo-Nordisk，Copenhagen，Denmark)测定C-肽。通过凝胶电泳测定HbA1c(Ciba Corning Diagnostics Corp，Palo Alto，CA)。
数据分析如果正常分布，数据表示为平均值±SD。否则，数据表示为中值和范围。
结果葡萄糖激酶，HNF-1α和HNF-4a基因的突变和多态性筛选葡萄糖激酶基因的启动子区和外显子1a z-10(Stoffel，等(1992)Proc Nratl Acad Sci 897698；Tanizawa，等(1992)61070)发现3个新的错义突变I110T，A119D和G385V。除了这些突变，在mRNA的5′-非翻译区以及内含子区发现三种罕见突变(其中两个从未描述过)以及两种多态性(表1)。受试者HK84的兄弟和母亲(表1)也遗传了I110T突变(图7)。通过筛选，母亲在64岁被诊断为糖尿病。兄弟25岁，当用75gOGTT试验时，在0和120分钟时血浆葡萄糖浓度分别为6.3mmol/l和6.9mmol/l。这些结果并非结论性的，用1997ADA标准表明空腹葡萄糖减低(IFG)但是并未达到1998WHO糖耐受减低(IGT)的标准。
筛选HNF-1α发现四种错义突变(G20R，R203H，S432C和618M)以及一种剪接受体点突变(VS2nt-1G→A)(表2)。所有这些代表HNF-1α基因中中国病人独有的突变。受试者HK10(表2)有三个兄妹(年龄在26-36岁之间)有糖尿病。感染的兄妹均遗传了IVS2nt-1G→A突变，另一个IGT的兄妹和父亲没有遗传。此外，HK10的外祖父母，舅舅，和母亲为糖尿病但是他们不适合筛选(图7)(Chan，等(1990)Diabetic Med 7211)。受试者HK54(表2)有4个兄妹(年龄33-43岁之间)有正常的葡萄糖耐受且一个兄妹(39岁)有IGT。父亲和母亲分别在50岁和60岁被诊断为糖尿病。母亲和兄妹都未遗传R203H突变(图7)。除了HNF-1α中假定的糖尿病相关突变，又鉴定到正常氨基酸多态性的两个取代，内含子中的四个沉默突变以及九个变异型/多态性(表2)。其它五个带有葡萄糖激酶或HNF-1α错义突变的遗传疾病渊源者(表1和2)的家庭成员不适合筛选。在100个健康对照中，没有发现葡萄糖激酶和HNF-1α基因的突变。
分析HNF-4α基因的启动子区和外显子1a，2-10(Furuta，等(1997)Diabetes 461652)没有表现明显的糖尿病相关突变。三个病人为前面描述的氨基酸多态性T/I130的杂合子(Yamagata等，(1997)Nature 384458)。两个病人为L211的密码子沉默突变的杂合子(表3)，一个病人为P441T的密码子沉默突变的杂合子(表3)。它们是内含子-上游外显子2(内含子1B)的两种多态性，启动子中的G→A取代在杂合子状态下的病人体内发现。在核苷酸-462的启动子的G→A取代没有位于基因(Furuta，等(1997)同上)已知的顺式-调节区并且其对于HNF-4α表达调控的影响还未确定。
具有MODY或未知病因的病人的临床特征在葡萄糖激酶和HNF-1α基因有突变的病人或者未知病因的病人的临床特征指示于表4。在92个病人中，54(59％)个在研究的期间内不肥胖。具有葡萄糖激酶突变相关糖尿病(‘葡萄糖激酶糖尿病’)的病人的诊断年龄平均为28岁。这三个受试者均有轻微的高血糖症和和令人满意的糖血控制(空腹时葡萄糖≤7.4mmol/l；HbA1c≤6.7％；非糖尿病范围5.1-6.4％)。这些病人有由其空腹C-肽水平表示(0.28-1.60nmol/l)的不同水平的基础脾脏β细胞分泌功能(Chan，等(1990)同上)。所有都进行食物或口服药物治疗。在三个具有葡萄糖激酶突变的病人中均未观察到糖尿病并发症(Froguel，等(1993)同上；Page，等(1995)12209；Velho，等(1997)40217)。
具有HNF-1α突变相关糖尿病的病人的诊断年龄平均为31岁。这四个带有错义突变的病人(HK30，54，90和92)均有轻微的高血糖症和和令人满意的糖血控制(空腹时葡萄糖≤7.4mmol/l；HbA1c≤7.1％)但是这些病人有表现不同水平的基础脾脏β细胞分泌功能(空腹时C-肽，0.10-0.49nmol/l)。他们均未观察到糖尿病并发症，所有都进行食物或口服药物治疗。带有剪接位点IVS2nt-1G→A突变的受试者(HK10)在诊断年龄19岁时不超重(Fajans(1990)Diabetes Care 1349-64)并且表现增生性视网膜病以及临床蛋白尿。诊断后她用胰岛素持续治疗3个月。她逐渐发展了神经疾病和肾衰竭。
表1在带有早发2型糖尿病的中国人受试者中葡萄糖激酶基因的突变和多态性受试者位点 密码子/nt核苷酸的改变 命名 频率突变HK84 外显子3110 ATC(Ile)→ACC(Thr)I110THK38 外显子3119 GCT(Ala)→GAT(Asp)A1I9DHK15 外显子9385 GGG(Gly)→GTG(Val)G385V多态性5′-UT*-213 A→G 5′-UTβ-213A/GA 0.96，G 0.045′-UT -84 C→G 5′-UTβ-84C/G C 0.94，G 0.06内含子1c nt-13C→G IVS1nt-13C/G C 0.99，C 0.01内含子9nt+8 C→T IVS9nt+8C/TC 0.50，T 0.50内含子9*nt+49G→A IVS9nt+49G/A G 0.99，A 0.01对于多态性而言，nt表示相对于在β细胞特异性外显子1α/1β的5′-I非翻译区(5′-UT)的密码子1的第一个核苷酸和剪接供体(+)或受体位点(-)的核苷酸位点。内含子1c是位于编码葡萄糖激酶的少数肝异种型14个氨基酸的氨基端的外显子1c，和外显子2(Velho，等(1996)19915)之间的内含子。星号表示由Ng，等(Diabetic Med(1999)16956)报道的和在其它人研究(Veiga-deCunha，等(1996)J Biol Chem 2716292；Zhang，等(1995)381055)但尚未报道的多态性。
表2早发2型糖尿病的中国人受试者HNF-1α基因的突变和多态性受试者 位点密码子/n 核苷酸变化命名频率突变HK90外显子1 20 GGG(Gly)→AGG(Arg)G20RHK10内含子2 nt-1 AG→从在剪接受体位点 IVS2nt-1G→A/外显子3HK54外显子3 203CGT(Arg)→CAT(His)R203HHK30外显子6 432TCC(Ser)→TGC(Cys)S432CHK92外显子10618ATC(Ile)→ATG(Met)I618M沉默突变/多态性外显子1 17 CTC(Leu)→CTG(Leu)L17C/G C 0.63，C 0.37外显子1 27 ATC(Ile)→CTC(Leu)I/L27 A 0.57，C 0.43内含子1 nt-42 G→A IVS1nt-42G/AC 0.58，A 0.42内含子2*nt+53 C→G IVS2nt+53C/GC 0.99，C 0.01内含子2 nt-51 T→A IVS2nt-51T/AT 0.77，A 0.23内含子2 nt-23 C→T IVS2nt-23C/TC 0.48，T 0.52内含子5 nt+9 C→G IVS5nt+9C/G C 0.98，G 0.02内含子5 nt-42 G→T IVS5nt-42G/TG 0.87，T 0.13内含子6*nt+26 C→T IVS6nt+26C/TC 0.99，T 0.01外显子7 459CTG(Leu)→TTG(Leu)L459C/T C 0.48，T 0.52外显子7 459CTG(Leu)→CTA(Leu)L459G/A C 0.99，A 0.01外显子7 487AGC(Ser)→从C(Asn)S/N487 G 0.48，A 0.52内含子7 nt+7 G→A IVS7nt+7G/A G 0.48，A 0.52外显子8*531AGC(Ser)→AGT(Ser)S531C/T C 0.99，T 0.01内含子9 nt-24 T→C IVS9nt-24T/CT 0.48，C 0.52nt表示相对于剪接供体(+)或受体位点(-)的核苷酸位点。星号表示由Ng，等(Diabetic Med(1999)16956)报道的和在其它人研究中尚未报道的多态性。
表3早发2型糖尿病的中国人受试者的HNF-4α基因的突变和多态性位点 密码子/nt核苷酸变化 命名频率沉默突变/多态型启动子* nt-462 G→APtr-462G/A G 099，A 0.01内含子1B nt-38C→TIVS1nt-38C/TC 0.80，T 0.20内含子1B nt-5 C→TIVS1nt-5C/T C 0.79，T 0.21外显子4 130 ACT(Thr)→ATT(Ile) T/I130 C 0.98，T 0.02外显子6* 211 CTC(Leu)→CTT(Leu) L211C/T C 0.99，T 0.01外显子10* 441 CCG(Pro)→CCA(Pro) P441G/A G 0.99，A 0.01对于多态型而言，nt表示相对于在启动子区的密码子1(ATG)的第一个核苷酸和剪接供体。(+)或受体位点(-)的核苷酸位点。nt-464多态型的序列为GATA(G/A)TATC。星号表示在其它的研究中尚未报道的多态性。
表4相对于那些由于葡萄糖激酶基因和HNF-1α基因突变导致的2型糖尿病那些未知病因的早发2型糖尿病的中国病人的临床特征未知病因(n＝84) 葡萄糖激酶糖尿病(n＝3)HNF-1α糖尿病(n＝5)HK1 HK38 HK84 HK10 HK30 HK54 HK90 HK92诊断年龄(岁)30±518293819 3033 3638自从诊断的时间(年) 3(0-16) 152 1 93 60 0性别(M/F)(％) 32/68F F F FM FM M家族史(fa/mot/sib)(％) 45/63/25 famot，sib mot gparent fafa，mot mot， mot， uncle， sibmot，sibBMI(kg/m2) 26±5nd*152826 2320 2029HbA1c(％) 7.5±1.9 6.7 6.0 6.6 8.7 7.1 6.0 6.9 6.1空腹葡萄糖(mmol/l) 8.5±3.3 7.2 7.4 6.6 13.9 7.4 4.9 4.9 6.6空腹C-肽(nmol/l)0.43(0.03-4.96) nd1.60 0.28 0.47 0.49 0.11 0.16 0.10T治疗(D/O/I)(％)49/43/8 O O D IO OD Ogparent，祖父母感染；uncle，舅舅感染；fa，父亲感染；mot，母亲感染；sib，兄妹感染；D，食物；O，口服药物；I，胰岛素；nd，没有治疗。数据表示为平均数±SD，中数(值域)或n。*BMI没有测试因为这个病人由脊柱肌肉萎缩。gparent，祖父母感染；uncle，舅舅感染；fa，父亲感染；mot，母亲感染；sib，兄妹感染；D，食物；O，口服药物；I，胰岛素；nd，没有治疗。数据表示为平均数±SD，中数(值域)或n。*BMI没有测试因为这个病人有脊柱肌肉萎缩。
84个未知病源的患者(病人)在被诊断时的平均年龄类似于带有葡糖激酶HNF-1a基因突变的患者的诊断年龄为30岁。高血糖症(空腹葡萄糖8.5±3.3mmol/l)水平以及基础胰腺β细胞分泌功能(空腹C-peptide 0.03-4.96nmol/l)的很大区别被观察到。这些病人大多数进行口服或食物处理(92％)。
实施例2在香港的中国人中早期或晚期2型糖尿病人的线粒体DNAA3243G突变该实施例例举了在香港的中国人中线粒体DNA的A3243G突变的广泛流行，表现为大量不同诊断年龄以及临床表型的2型糖尿病人。
试验设计和方法受试者该实验组包含根据1985WHO(世界卫生组织，1985年)标准诊断的906个不相关2型糖尿病病人。这群人根据诊断年龄和糖尿病家族史的存在与否包括四组病人。组1和2分别包括219和128个病人，他们的诊断年龄较小(≤40岁)，组1有糖尿病家族史组2没有糖尿病家族史。组3和组4分别包括211和348个病人，诊断年龄较大(＞40岁)组3有糖尿病家族史，组4没有糖尿病家族史。每个组的病人随机选自威尔士亲王医院糖尿病和内分泌中心一群征募者，其代表香港120万的民众。根据Europe DiabCare Protocol(Piwernetz，等(1993)Diabetic Med 10371；Chan，等(1997)Hosp Auth Qual Bull 23)所有的病人进行结构系统评估。mt3243突变携带者的家庭成员，如果可能也被征募并进行75克的口服葡萄糖耐量测试(OGTT)。在医院的职员和学生中征募213个没有糖尿病家族史的健康人作为对照受试者。该试验组包括75个早发2型糖尿病人(其中两个具有mt3243突变)而且95个对照受试者包括在以前的报告中(参见Smith，等(1997)Diabetic Med 141026)。经每个受试者同意采集血样用于DNA分离和检测临床参数。这项研究经香港中文大学临床研究道德委员会的批准。
Mt3243突变分析用蛋白酶K和苯酚/氯仿的常规方法(Sambrook，等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，此处引作参考)提取白细胞DNA。通过描述于(Smith，等，(1997)同上)的聚合酶链式反应(PCR)扩增然后用ApaI酶切。简要的说就是通过PCR扩增跨越核苷酸3029和3456的DNA区然后在最后一步循环中用α32PdATP标记。这种方法防止低估PCR中突变体mtDNA以异源双链体形式存在的比例(Schoffner，等(1990)Cell 61931)。PCR产物用ApaI(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)在30℃酶切两小时。酶切后的PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳然后放射性自显影观察。mt3243的存在导致427bp的产物被切割为213和214bp的片段。在检测中还包含含有0-100％突变体mt3243的标准(通过以不同比例将不携带mt3243突变的克隆DNA和携带＞99％的突变体mt3243的另一种克隆DNA混合，由Leiden University的J.vanden Ouweland博士友情赠送。100％突变体DNA用作阳性对照来评价PCR产物酶切的完全性。通过Bio-Rad Model GS-670显像密度计以及Molecular Analyst软件(1.3版)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)计算带的强度。在样品中mt3243的比例通过野生型和突变体带的强度分开突变带(213和214bp)的强度来计算。
临床研究所有的病人进行结构分析包括家族史记录，诊断年龄以及身体重量参数(BMI)和腰围臀部比。由技术人员在耳鼻喉科对受试者进行听力测验来评估携带mt3243突变的受试者的感觉状况。采集空腹的血液样品来测定葡萄糖，C-肽，胰岛素和糖基化血红蛋白(HbA1c)。采用动态静止模型评估(HOMA)估计胰岛素耐受(IR)，其中IR＝空腹胰岛素×空腹葡萄糖/22.5(Matthews等，(1985)Diabetologia 28412).。肥胖被定义为男性BMI≥27kg/m2女性≥25kg/m2(National DiabetesData Group，1979)。基础胰腺β-细胞储备也通过血浆空腹C-肽的水平进行评估。C-肽水平≤0.2nmol/l的病人被认为是胰岛素缺陷(Service等，.(1997)Diabetes Care 20198)。
生化测试用葡萄糖氧化酶的方法测定血浆葡萄糖(Diagnostic Chemicals，Charlottetown，PEI，Canada)。HbA1c通过凝胶电泳测定(Ciba ComingDiagnostics Corp，Palo Alto，CA.USA)。C-肽通过放射性免疫测定进行(Novo-Nordisk，Copenhagen，Denmark)内部检测的变异系数(CV)为3.4％和之间检测的变异系数为9.6％。用放射性免疫(Pharmacia，Uppsala，Sweden)测定胰岛素，内部检测的CV为6％，之间检测的CV为13.8％。
统计分析数据表示为平均值±SD或如果合适用中值(值域)表示。X2试验用来分析分类数据。斯皮尔曼相关用来测定变异之间的关联。所有的统计表都用Statistical Package for Social Sciences(SPSS)forWindows，6.1版进行。P-值＜0.05被认为是显著的。
结果906个2型糖尿病人的临床详细资料指示于表5。发现有阳性家族史的无论是早发糖尿病(组1)还是晚发糖尿病(组3)人母系糖尿病家族史较父系糖尿病家族史更普遍(表5)。
在906个2型糖尿病人中，除了两个从前报道过携带mt3243突变(Smith，等(1997)同上)，又鉴定了3个携带mt3243突变的病人。在组1中，这种突变在有阳性家族史的早发病人中为1.8％(219人中4个)。如果只考虑带有阳性母系家族史的病人流行率达到3％(133中3个)。此外，不带阳性家族史的348个晚发病人中发现一个有这种突变(0.3％)。128个不带阳性家族史的早发病人(组2)或带有阳性家族史的211个晚发病人(组3)或213个对照受试者没有这种突变。
在这5个带有mt3243突变的渊源者中，三个家庭被征募(图8)。在家族A中，鉴定到了带有糖尿病和IGT的家庭成员，但是他们都不携带这种突变。在家族E中，还有两个受试者带有这种突变，但是只有一个为糖尿病。携带mt3243突的受试者的临床和生化特征列在表6。
mt3243的百分比从1％到14％(表6)。突变的异质水平和空腹血浆的葡萄糖的HbA1c，C-肽，胰岛素，胰岛素抗性或感觉神经损伤的出现水平之间没有关联(P＞0.05)(表6)。
家族A和B在以前的研究中已经报道了这两个家族(Smith，等，(1997)同上)。家族A中37岁的渊源者(II4)自从32岁时诊断为糖尿病一直进行口服药物的治疗。母亲(I-2)和两个兄妹(II-1和II-3)为糖尿病而父亲(I-1)和一个姐妹(II-2)有IGT。但是，虽然母亲具有听力损伤的家族史，但是所有家庭成员均没有mt3243突变。
家族B的渊源者在22岁时被诊断为糖尿病并且一直进行口服药物治疗。母亲为糖尿病和耳聋，但是不适合筛选。
家族C38岁的渊源者(III-3)在31岁时被诊断为糖尿病。在转为胰岛素治疗之前，她进行食物和口服药物治疗6年。听力测试显示有双面高音感觉神经损伤。父亲(II-1)有正常的葡萄糖耐受而且没有mt3243突变。大姐(III-2)和母亲(II-2)都在40岁时发展了糖尿病且祖母在50岁时得了糖尿病。母亲在59岁时耳聋。这些感病成员都不适合筛选。
表5带有2型糖尿病的902个中国病人的临床和生化特征组1组2组3组4(n＝219) (n＝128) (n＝211) (n＝348)诊断年龄(岁) 32±6 32±7 52±8 57±9疾病的持续时间(年)4(0-31)2(0-41)5(0-24)4(0-26)性别(M/F)(％) 36/64 36/64 44/56 41/59糖尿病家族史父亲(％) 45*0 21**0母亲(％) 61 0 38 0兄妹(％) 35 0 57 0至少1父母和1兄妹 26 0 19 0体重指标(kg/m2) 25.7±4.8 24.9±4.4 24.4±3.8 24.3±3.8HbA1c(％)7.3(4.1-15.3) 7.1(3.8-16.8) 7.7(4.0-16.0) 7.6(4.2-19.7)空腹血浆葡萄糖(nmol/l)7.4(4.4-23.0) 7.7(2.8-21.4) 7.8(3.9-34.0) 8.1(3.0-24.5)空腹血浆C-肽(nmol/l) 0.47(0.03-4.96)0.56(0.09-1.62)0.57(0.01-9.40)0.51(0.01-8.22)胰岛素缺陷(％)_ 16 11 12 16胰岛素治疗(％)11 13 9 11平均数±SD或中数(值域)。组1带有糖尿病阳性家族史的早发(40岁)病人；组2不带有糖尿病阳性家族史的早发病人；组3带有糖尿病阳性家族史的晚发病人(＞40岁)；组4不带有糖尿病阳性家族史的晚发病人。_胰岛素缺陷被定义为空腹血浆C-肽0.2nmol/l(Service，等(1997)同上)；*P＜0.005和**P＜0.0001用于比较父系家族史的流行率和母系家族史的流行率的区别。
表6在线粒体tRNALeu基因携带mt3243突变的中国受试者的临床和生化特征家族A 家族B 家族C 家族D 家族E渊源者 渊源者 渊源者渊源者渊源者 II-2 II-4诊断年龄(yr) 32 22 317033 38 -疾病持续时间(yr) 2 1 7 9 2 1 -性别 F M F M M F F体重指数(kg/m2) 18.222.418.6 25.3 27.621.6 19.6腰围臀围比0.790.810.75 0.90 0.860.79 0.75HbA1c(％)5 7.7 6.8 5.9 11.37.54.3空腹葡萄糖(mmol/l)5.3 11.69.8 5.8 15.77.14.4空腹C-肽(nmol/l) 0.430.230.30 0.7 0.720.83 0.4空腹胰岛素(mIU/l) 13.426.0NDND20.616.8 13.2胰岛素耐受*3.2 13.45.5 ND14.45.32.6治疗 口服口服胰岛素口服 口服口服 -药物药物 药物 药物药物听力敏感图正常正常高音损伤 高音损伤 正常ND NDMt3243水平(％)13 1 141 5 9 4*HOMA方法，ND，未确定家族D79岁的渊源者在70岁时被诊断为糖尿病。听力测试指示高音感觉神经损伤。父母和所有兄妹都不适合筛选或者都未知有糖尿病。
家族E35岁的渊源者(II-3)在33岁时被诊断为糖尿病，并接受食物治疗。一个姐妹(II-4)有正常的葡萄糖耐受而两个姐妹(II-1和II-2)分别在30岁和38岁被诊断为糖尿病。父亲(I-1)和母亲(I-2)也分别在50和35岁被诊断为糖尿病。所有接受筛选的糖尿病或非糖尿病姐妹都有mt3243突变。一个糖尿病姐妹(II-1)有高音感觉神经损伤而渊源者的听力敏感图正常。
实施例3糊精基因S20G突变对于早发2型糖尿病人以及在调节中国人胆固醇代谢中的作用该实施例例举了在有2型糖尿病和没有2型糖尿病香港中国人中糊精基因S20G突变的分布，以及其对于β-细胞功能和代谢谱的影响。这些数据与糊精基因中S20G突变导致2型糖尿病早发的结论一致，并且也与其可能影响中国人群脂肪代谢的结论一致。
试验设计和方法受试者这项研究经香港中文大学临床研究道德委员会的批准。获得了每位参与者的同意。为了研究，227个早发和235个晚发2型糖尿病人(分别定义为诊断年龄≤40和＞40)，以及126个非糖尿病受试者(被定义为空腹血浆葡萄糖＜6mmol/l)在威尔士亲王医院糖尿病中心连续征募。2型糖尿病根据世界卫生组织的标准(Anonymous(1997)DiabetesCare 201183)进行确定。这些病人都没有典型的1型糖尿病的症状，例如糖尿病酮酸中毒的急性症状以及严重的酮尿(＞3+)史或者在诊断一年内持续需要胰岛素治疗。研究中排除在葡萄糖激酶和肝细胞核因子-1α和4-α基因中有抗谷氨酸脱羧酶自身抗体(Ko，等(1998)Ann ClinBiochem 35761)糖尿病引起的突变的病人(Ng等(1999)DiabeticMedicine 16956)。
临床和生化测试在临床检测前至少8小时病人空腹。在他们持续坐下至少5分钟采用常规的水银血压计测血压。病人着少量衣物不穿鞋的站着的情况下测定体重身高，以及腰围和臀围。在威尔士亲王医院的化学病理科采用常规方法测定空腹血浆葡萄糖和脂类。用市售试剂酶学检测(Centrichem，chemistry system，Baker Instrument Co.，Allentown，PA)总胆固醇和甘油三羧酸的水平。用右旋糖苷硫酸处理的MgCl2分级沉降后确定HDL-胆固醇的含量，LDL-胆固醇用Friedewald公式进行计算(Friedewald等(1972)Clin Chem 18499)。采用自动离子交换层析法测定HbA1c(BioRad，Hercules，CA，USA；正常范围5.1-6.4％)。用放射免疫的方法采用市售试剂盒测定C-肽的血浆水平(分别为#7350104和#141，Novo Nordisk，Denmark)。检测范围是从0.01到1.0pmol/l。胰岛素缺陷被定义为空腹血浆C-肽水平＜0.2 pmol/l(Service等(1997)Diabetes Care 21987)。
突变检测S20G突变带有MSPI限制性片段长度多态性(RFLP)，其能够通过PCR-RFLP分析检测(Sakagashira等(1996)Diabetes 451279)。简而言之，跨越突变位点的DNA片段采用引物5′-TCACATTTGTTCCATGTTAC-3′(SEQ ID NO30)和5′-CAATAACTATAGAGTTACATTG-3′(SEQ ID NO31)的PCR进行扩增，退火温度为56℃。每个PCR产物用5单位的限制酶MSPI(#R6401，Promega，WI，USA)在37℃过夜酶解。在2.5％琼脂糖凝胶上分离等位基因。野生型等位基因指示239bp的产物，而突变等位基因指示99和140bp的产物。
统计分析连续变化表示为平均值±SD。卡方试验用来分析比例。连续变异的差别用学生的t-试验采用社会学研究的分析包(SPSS Inc.，Chicago，USA)进行分析。P值＜0.05被认为是统计学上显著。
结果表7例举了参与研究的受试者的人口数据。鉴定了六个早发和一个晚发糊精S20G突变杂合子病人(2.6％vs0.4％，p＝0.055)。非糖尿病受试者均没有S20G突变(表7)。
在早发组中，6个携带突变的病人中有5个都有很好由饮食和/或口服药物介入的血糖控制，并且空腹血浆C-肽浓度大于0.2pmol/l(表8)。此外，突变携带者有较没有突变的更低的总胆固醇(4.3±0.9vs5.3±1.1，p＝0.02)和LDL-胆固醇(2.3±0.7vs3.2±0.9，p＝0.01)(表9)。带有或不带有S20G突变的病人的年龄(34±6vs35±8，p＞0.05)。
表7.
早发和晚发病人以及非糖尿病受试者的临床特征，和糊精基因的S20G突变的分布2型糖尿病对照受试者 早发 晚发临床特征n 126 227 235年龄(岁)34.9±10.4 36.8±6.759.4±10.1性别比例(M/F) 1∶1.75 1∶1.97 1∶1.33诊断年龄(years) NA 31.7±4.654.3±9.8体重指数(kg/m2) 22.3±3.425.1±4.524.2±3.6腰围臀围比 0.77±0.05 0.85±0.07 0.89±0.06心脏收缩压(mmHg)114±10 119±17 137±21心脏舒张压(mmHg)64±976±10 82.0±11HbA1c(％) -7.6±2.0 8.1±2.2总胆固醇(mmol/l)4.7±0.9 5.3±1.2 5.6±1.2HDL-胆固醇(mmol/l) 1.4±0.3 1.3±0.4 1.3±0.4LDL-胆固醇(mmol/l) 2.9±0.8 3.2±0.9 3.6±1.1甘油三羧酸酯(mmol/l)0.9±0.5 1.7±1.8 1.8±1.5基因型野生型等位基因纯合子126 221 234杂合子 06 1突变等位基因纯合子 00 0S20G等位基因频率(％)02.6_0.4平均值±SD；_p＝0.055
表8携带糊精基因S20G突变的早发2型糖尿病人的空腹血浆葡萄糖，HbA1c和C-肽的水平病人 发病年龄 持续时间 治疗C-肽 HbA1c葡萄糖(年) (pmol/l)(％) (mmol/l)索引病例a 291食物 ＞1.0 6.2 5.3索引病例b 2518 口服药物 ＞1.0 7.2 7.2索引病例c 353食物 ＞1.0 8.2 9.3索引病例d 282食物+口服 0.02 5.4 4.9索引病例e 361食物+口服 0.51 5.8 14.0索引病例f 1313 胰岛素- 11.5 7.2
表9早发S20G突变携带病人和在发不携带S20G突变病人之间临床特征和生化测试的比较病人 年龄 性别BMI WHR SBPDBP HbA1c甘油三羧酸酯 总C HDL-C LDL-C索引病例a 30F 23.20.76 11479 6.20.76 3.8 1.042.5索引病例b 43F 17.90.78 13874 7.20.46 5.8 2.213.3索引病例c 38M 28.20.88 12890 8.22.90 4.7 1.062.3索引病例d 30F 23.20.75 10566 5.40.99 4.0 1.372.2索引病例e 37F 24.00.89 12680 5.82.76 3.3 0.871.2索引病例f 26M 29.10.89 12081 11.5 0.59 4.2 1.712.2突变+(n＝6)34±6 - 24±4 0.8±0.1 122±1678±87.4±2.0 1.4±1.1 4.3±0.9 1.3±0.52.3±0.7突变-(n＝221 35±8 - 25±4 0.9±0.1 119±1776±10 7.6±2.3 1.7±2.5 5.3±1.1*1.3±0.43.2±0.9**平均值±SD；*p＝0.02；**p＝0.01BMI，体重指数(kg/m2)；WHR，腰围臀围比；SBP，心脏收缩压(mmHg)；DBP，心脏舒张压(mmHg)；总-C，总胆固醇(mmol/l)；HDL-C，HDL-胆固醇(mmol/l)；LDL-胆固醇(mmol/l)。
S20G突变和2型糖尿病(表7；Sakagashira等(1996)同上)之间的遗传关联与糊精可能在疾病的发病机理中扮演重要角色的生理数据一致(Cooper(1994)Proc Natl Acad Sci 848628)。早发2型糖尿病实际上是普遍的，虽然2型糖尿病在分类上为晚发型。但是，早发病人表现病因学的异质性。在香港的中国人中，尤其是青年的晚发型2型糖尿病以及非典型性自动免疫糖尿病存在，但是只占所有早发型人群的很少一部分(Ng等(1999)同上；Ko等(1998)同上)。S20G突变也可能解释一些早发例子。
S20G突变携带者并不需要胰岛素用来进行血糖控制，而且并不表现胰岛素缺陷(表8)。这些发现不同于从前观察到的S20G突变可能与损伤性血糖控制以及β细胞功能失调相关(Sakagashira等(1996)同上；Chuang等(1998)同上)。报道的日本S20G携带者(Sakagashira等(1996)同上)在他们试验的时间内有大约20年的糖尿病平均持续时间。他们普遍需要胰岛素治疗可能是由于长期糖尿病导致的血糖控制损伤，而不是突变存在导致的。
另外，突变发现血浆中低水平总胆固醇以及LDL-胆固醇(表9)相关。这与最近的发现，即pramlintide(一种合成的人糊精类似物)能够降低2型糖尿病人血浆中总胆固醇以及LDL-胆固醇的水平一致(Thompson等(1998)Diabetes Care 21987)。目前很少研究集中在糊精的作用和脂谱之间的关系上。这些数据以及来自Thompson和其合作者的数据与糊精可能在调节胆固醇代谢中起作用的结论一致。
实施例4遗传因素和肥胖在中国病人中家族性早发2型糖尿病中的重要性该实施例例举了在隔离的具有早发和晚发2型糖尿病的中国病人群体中已知分子缺陷的普遍性。这些研究的基因已经发现与糖尿病相关而且可能在基因—基因和基因—环境影响下与疾病的早发相关，这些基因包括葡萄糖激酶(MODY2)，HNF-1α(MODY3)，以及线粒体DNA中编码tRNALeu(UUR(mt3243)的A3243G突变，其与被确定为母系遗传和耳聋类型的糖尿病相关(van den Ouweland，等(1992)Nature Genet.1368)。
试验设计和方法受试者威尔士亲王医院(PWH)是香港的一个地域性医学院附属医院。其汇水面积有大约1.2million的人口，占香港20％的总人口。在香港缺乏长期的健康保护措施，医疗保险不能广泛实施。很多慢性疾病的病人，例如糖尿病人被公共医院或门诊部控制，只需要很少的费用。因此，除了上流社会，病人大部分代表了香港的糖尿病人群。自从1995年，所有参加PWH糖尿病门诊的病人在进行结构系统评估后均参加了PWH Diabetes Registry(Piwemetz，等(1993)Diabetic Med 10371；Chan，等(1997)Hosp Auth Qual Bull 23)。在研究阶段，进行结构系统评估的150个早发糖尿病的年轻病人(年龄≤40岁且诊断年龄≤35岁)隔离群从PWH的门诊部连续征募形成年轻中国人糖尿病数据库(Ko，等(1998)Ann Clin Biochem 35761)。年轻中国人糖尿病数据库中的150个病例，分别有92个和53个病人选自本研究只要满足下列标准所有这些145个年轻病人有早发(目前年龄和诊断年龄≤40岁)2型糖尿病(1985 WHO标准，Geneva)和糖尿病阳性家族史(至少第一个程度与糖尿病相关)。典型1型糖尿病的病人(急性酮病或者在诊断1年内持续需要胰岛素)从本研究中排除。
已经报道了在来自年轻中国人糖尿病数据库中的病人中抗-GAD(Ko，等(1998)同上)，mt3243(Smith，等(1997)Diabetic Med 141026；Ng，等(2000)52557)和糊精基因突变(Lee，等(2001)J.Endocrinol)的广泛性。此外，已经报道了来自PWH数据库的隔离人群中的mt3243(Ng，等(2000)同上)，糊精(Lee，等(2001)同上)，葡萄糖激酶，HNF-1α和HNF-4α突变基因(Ng，等(1999)Diabetic Med 16956)。在这项研究中从来自年轻中国人糖尿病数据库筛选葡萄糖激酶和HNF-1α基因突变增加到53个病人。在这群人中没有筛选HNF-4a基因，因为已知低的突变频率。(来自PWH Diabetes Registry的92个病人均未发现(Ng，等(1999)同上))。来自PWH Diabetes Registry筛选抗-GAD的病人增加到92个。
145个带有家族糖尿病史的年轻病人中19个(13％)符合MODY的标准(诊断年龄≤25岁连续两代出现糖尿病)。20个有携带候选糖尿病遗传基因突变的家庭总共有10个被征募进行75-gOGTT和临床评估。1999WHO的分类标准用来定义家庭成员的血糖水平(WHO，Geneva，1999)。为了比较早发病人的临床特征，290个带有晚发糖尿病和阳性家族史的成人病人(诊断年龄＞40岁)从目前PWH Diabetes Registry中的1800个病例中随即选择。从医院的职员和学生中选择100个健康中国人(年龄33±10岁，40个男性和60个女性)作为对照受试者用来筛选在研究的病人中鉴定到的遗传变异。受试者自愿接受采集血样用于DNA提取和测定生化指数。这项研究获得了香港中文大学临床研究道德委员会的批准。
临床研究所有的病人进行基于Europe DiabCare Protocol的系统评估。他们有糖尿病家族史的记录，诊断年龄以及人体测量参数的记录(Piwernetz，等(1993)同上；Chan，等(1997)同上)。体重参数(BMI)作为一般肥胖的参数。与中国人内脏脂肪堆积高度相关的腰围通过磁谐振成像测定(Anderson，等(1997)Diabetes Care 201854)，它作为一般肥胖的指标。过夜空腹后，采集静脉血用来测量血浆葡萄糖，胰岛素，HbA1c，总胆固醇(TC)，HDL-C，LDL-C(计算的)，甘油三酸酯(TG)和抗-GAD。收集一滴晨尿用于测定蛋白尿。如前所述测定视网膜病以及感觉神经病(Ko，等(1999)J Diabetes Complications 13300)。
采用最近的亚洲人标准(WHO，Western Pacific Region，2000)一般肥胖被定义为BMI≥25kg/m2。蛋白尿被定义为在一滴尿样品中白蛋白∶肌酸的比例(ACR)≥3.5mg/mmol(Schwab，等(1992)Diabetes Care151581)。HOMAIR指数(空腹血浆胰岛素×葡萄糖/22.5)来自HOMA公式被用来评价胰岛素抗性(Matthews，等(1985)Diabetologia 28412)。
生化测试在PWH的化学病理学科采用常规方法测定血浆葡萄糖，HbA1c，脂类，尿白蛋白以及肌酸(参见Chan，等(1996)Diabetic Med13150)。通过放射免疫法(Pharmacia，Sweden)测定非胰岛素治疗病人的血浆胰岛素，内检测和之间检测的CV分别为6％和13.8％。抗-GAD通过放射免疫沉淀测定法检测(Chen，等(1993)Pediatr Res 34785)。18个单位的上限适合亚洲和欧洲受试者(Tuomi，等(1995)ClinImmunol Immunopath 74202，Chen，等(1993)同上)。
遗传分析通过直接测序PCR产物筛选葡萄糖激酶(β-细胞类型)，HNF-1α和HNF-4α(HNF-4α2类型)的基因寻找突变(参见Froguel，等(1993)N Engl J Med 328697；Yamagata，等(1996)Nature 384455；Yamagata，等(1996)Nature 384458)。在这项研究中，一个从前未报道的HNF-1α(A116V)的突变和葡萄糖激酶中两个从前未报道的突变(V101M和Q239R)被鉴定。采用正向引物5′-CATGCACAGTCCCCACCCTCA-3′(SEQ ID NO34)和反向引物5′-TCCCACTGACTTCCTTTCC-3′(SEQ ID NO35)进行PCR扩增，然后进行HphI酶切，来筛选HNF-1α的A116V。野生型等位基因表现44和397bp的产物，而突变等位基因表现44，136和261bp的产物。利用正向引物5′-GTCCCTGAGGCTGACACACTT-3′(SEQ ID NO24)和反向引物5′-AGCTGGGCCCTGAGATCC-TGCA-3′(SEQ ID NO25)进行PCR扩增，然后进行Hsp92II酶切，来筛选葡萄糖激酶的V101M。野生型等位基因表现20，56和174bp的产物，而突变等位基因表现20，42，56，和132bp的产物。用正向引物5′-AGGAACC-AGGCCCTACTCCG-3′(SEQ ID NO36)和反向引物5′-TACTCCA-GCAGGAACTCGTCC-3′(SEQ ID NO37)进行PCR扩增，然后进行AciI酶切来筛选葡萄糖激酶Q239R。野生型等位基因表现70和134 bp的产物，而突变等位基因表现33，70和101bp的产物。用PCR-RFLP确定渊源者家庭成员(表10)以及对照受试者的假定突变。用描述于(Sakagashira，等(1996)Diabetes 451279；Smith，等(1997)同上)的PCR-RFLP法筛选Mt3243A→G和糊精基因S20G突变。
统计分析正常分布数据表示为平均值±SD。通过对数变换将非正常分布的数据进行标准化。结果的平均值经过反对数转换表示为几何平均数和25以及75百分数。在比较组之间采用卡方检验以及t检验。p值＜0.05(2-tailed)被认为显著。所有的统计分析均采用Statistical Packagefor Social Sciences(SPSS for Windows，版本9.0)进行。
结果带有家族性早发糖尿病的病人中假定基因突变以及抗-gad的普遍性在145个带有家族性早发糖尿病的病人中，20(14％)个带有假定突变，包括HNF-1α基因，7个(5％)，葡萄糖激酶基因，6(4％)，mt3243，4(3％)，和糊精的S20G，3个(2％)。6(4％)个病人中抗-GAD阳性。来自PWH Diabetes Registry的92个病人中没有发现HNF-4α基因突变。所有在HNF-1α和葡萄糖激酶基因中鉴定的突变以前从未报道(表10)。在4个不相关病人中发现了HNF-1αG20R和葡萄糖激酶Q239R突变。在100个健康对照受试者中没有发现这些突变。
基因突变的家族共隔离研究在携带候选基因突变的20个家族中，10个家族被征募进行共隔离研究(图9)。在4个家族中观察到了带有临床糖尿病或葡萄糖耐受的突变的共隔离HK10带有HNF-1α的IVS2nt-1G→A，YDM142带有葡萄糖激酶的V101M，HK84带有葡萄糖激酶的I110T和HK50带有mt3243。在其它6个家族中隔离与否不确定。带有HNF-1α的R203H的家族HK54，带有mt3243的家族YDM83以及带有糊精S20G突变的家族CX216中，只有渊源者携带了基因突变，筛选的糖尿病家族成员或非糖尿病家族成员都没有携带基因突变。对于带有葡萄糖激酶Q239R的家族YDM67，以及带有mt3243的家族HK61和带有糊精S20G突变的家族YDM99而言，在糖尿病和非糖尿病家族成员中均发现了突变。带有葡萄糖激酶突变的3个家族中，来自家族YDM142和HK84的所有突变携带者较那些不带突变的(4.2-5.3mmol/L)有更高的空腹葡萄糖浓度(5.8-8.9mmol/l)。另外，渊源者YDM67的携带4个突变的兄妹有正常的空腹血浆葡萄糖浓度(4.0-5.6mmol/l)不考虑他们的血糖情况。
表10具有早发糖尿病的中国受试者的HNF-1α和葡萄糖激酶基因的突变受试者 位点 密码子/nt 核苷酸改变命名HNF-1α突变HK90*，YDM42_外显子120 GGG(GLy)→AGG(Arg)G20RYDM20_外显子2116 GCG(Ala)→GTG(Val)A116VHK10*内含子2/外显子3nt-1AG→AA在剪接受体位点 IVS2nt-1G→AHK54*外显子3203 CGT(Arg)→CAT(His)R203HHK30*外显子6432 TCC(Ser)→TGC(Cys)S432CHK92*外显子10 618 ATC(Ile)→ATG(Met)I618M葡萄糖激酶突变YDM142_ 外显子3101 GTG(Val)→ATG(Met)V101MHK84*外显子3110 ATC(Ile)→ACC(Thr)I110THK38*外显子3119 GCT(Ala)→GAT(Asp)A119DYDM67_，YDM144_ 外显子7239 CAG(Gln)→CGG(Arg)Q239RHK15*外显子9385 GGG (Gly)→GTG(Val) G385V*以前研究中报道的(Ng，等(1999)Diabetic Med 16956；Ng，等(2000)Diabetologia 43816)_本研究中新发现的未知病因的家族性早发糖尿病人与家族性晚发糖尿病人的临床特征的比较虽然26个早发糖尿病人携带与糖尿病或自身免疫指示物，抗-GAD抗体相关的候选基因突变，但是其他119个病人的病因仍待鉴定。这些带有未知病因糖尿病的年轻病人(诊断年龄为30±6岁)临床上区分于290个晚发病人(诊断年龄52±8岁)(表11)。因此，虽然两个组的所有病人都有糖尿病阳性家族史，那些早发糖尿病人更可能父亲糖尿病频率(39％vs.22％)和母亲糖尿病频率(63％vs.41％)，但是兄妹有糖尿病的频率较低(30％vs.53％)(p＜0.001)。相比于晚发糖尿病人，早发糖尿病人有更高的BMI但是更低的BP和视网膜病以及神经疾病的更普遍。早发糖尿病人较晚发糖尿病人有更好的血糖控制(葡萄糖和HbA1c)以及较高的空腹胰岛素浓度。虽然类似的平均得病时间只有4年，早发和晚发病人相比于其它微血管并发症的流行率其蛋白尿的流行率分别高达40％和38％。用HOMA IR参数评估，胰岛素耐受在两个非胰岛素处理组病人中相似。用胰岛素处理的病人在两个组中类似(8％vs.7％)，但是相比于晚发组早发组中有更少的病人接受口服药物治疗(33％vs.61％，p＜0.001)未知病因的家族性早发糖尿病的病人和根据肥胖指数化分的家族性晚发糖尿病人的临床特征由于未知病因的早发糖尿病和晚发糖尿病人中普通肥胖的广泛普遍性(分别55％和46％)，肥胖和心血管病危险因素以及并发症的关联被进行进一步分析(表11)。在早发病人中，肥胖病人有更差的血糖控制(HbA1c)以及更高的心脏收缩BP，更不利的脂谱(较高的TG，较低的HDL-C以及较高的TC/HDL-C)，和比非肥胖病人更高的空腹胰岛素。较非肥胖病人有更高的胰岛素抗性(HOMA IR指数)和更普遍的视网膜病和蛋白尿。在晚发病人中，肥胖病人较非肥胖病人有更好的血糖控制(葡萄糖和HbA1c)。但是他们较非肥胖病人有更高的心脏收缩和心脏舒张BP，以及更高的空腹胰岛素。在两个组中，胰岛素抗性和并发症的普遍性程度是类似的。
表11根据诊断年龄和肥胖状况比较具有家族性2型糖尿病的中国病人的临床特征
接11表
比较早发和晚发病人之间，早发非肥胖和肥胖病人之间，晚发非肥胖和肥胖病人之间的数据数据表示为n(％)，平均值±SD或几何平均数(25和75百分数)*只检测未用胰岛索处理的病人_p＜0.05_p＜0.001
实施例5例举一个带有HNF-1α糖尿病(MODY3)强调需要早期诊断和合适治疗的中国家族该实施例报道了一个带有早发糖尿病和严重并发症的中国家族的HNF-1α糖尿病/MODY3的临床治疗过程(图10)(Chan，等(1990)Diabetic Medicine 7211)。这个家族强调早期诊断以及及时治疗在提高临床效果甚至是遗传易感的受试者中的重要性。
渊源者家族中有三个家庭成员在接受治疗时有严重的糖尿病并发症。渊源者(III-5)，19岁，有严重的增生性视网膜病，严重的蛋白尿(每天1.4g蛋白)以及类脂质渐进性坏死。她在3个月以前就被诊断为2型糖尿病(非胰岛素依赖性)并接受格列本脲的治疗。开始了视网膜激光凝固法治疗，而且她还开始了胰岛素和ACE抑制剂治疗。她随后还得了高血压还发展了晚期肾病在30岁时就需要透析。多年来她的平均HbA1c为8.0％。目前她接受42个单位的胰岛素。
她的姐姐(III-2)有玻璃质状出血并且自从24岁诊断出糖尿病后一直用胰岛素治疗。两年前她开始失明并且得了肾病(每天0.8g蛋白)。目前她正接受胰岛素(16个单位)和ACE抑制剂的治疗，平均HbA1c为6.4％。
受试者的母亲(II-3)在她33岁怀孕时并发糖尿。在38岁时她被诊断为2型糖尿病并接受格列本脲的治疗10年。在研究时，她有增生性视网膜病，肾病，外周神经疾病，类脂质渐进性坏死，高血压以及白内障。开始胰岛素治疗(20个单位)在8个月内她的HbA1c从17.2％减小到9.2％。两个月后她得了心肌梗塞随后心脏和肾功能渐进性坏死。她52岁时死于肺水肿和败血症伴随着足坏疽。
第四个女儿(III-6)自从她12岁时一次鼻息肉手术后突发糖尿病后，她一直接受胰岛素治疗。她目前接受68个单位的胰岛素，平均HbA1c为8.8％。
其他两个家庭成员接受OGTT筛选。第二个女儿(III-3)在过去的11年中在正常葡萄糖耐受和IGT之间浮动。一个兄弟(III-7)用10.5％的HbA1c初始筛选时表现明显的糖尿病。他目前正接受26个单位的胰岛素，平均HbA1c为5.3％。
一个舅舅(II-4)在39岁时被诊断为糖尿病和高脂血症伴随渴感和多尿。自从诊断后他就接受口服药物治疗，平均HbA1c为8.4％。他的子女不适合进行详细的遗传测试和临床评估。染病的成员II-4，III-6和III-7(图10)尽管都已经得糖尿病10年以上，都没有得并发症。
父亲也接受了IGT治疗。他不肥胖并有高脂血症。
这个家族HNF-1α基因的测序指示与糖尿病共隔离的内含子2(IVS2nt-1G→A)中有一个新的剪接受体点突变(AG→AA)(图10)(Ng，等(1999)Diabetic Medicine 16956)。这个突变可能产生一个没有功能的mRNA。所有的糖尿病家族成员，包括舅舅(II4，III-2，III-5，III-6和III-7)都是这个突变的杂合子，但是父亲(II-2)和带有IGT的女儿(III-3)没有这个突变。因此非常可能，没有DNA样品的母亲(II-3)也携带了该突变。对于其他带有HNF-1α糖尿病的病人而言(Byrne，等(1996)Diabetes 451503)，大多数感染的家庭成员通过胰高血糖素刺激试验评价表现胰腺β-细胞功能的缺陷。母亲和所有的感染子女，除了受试者III-2，都是基于胰高血糖素(静脉内1mg)刺激后血浆C肽6分钟时小于0.6nmol/l(分别0.24-0.55nmol/l)定义的胰岛素缺陷(Service，等(1997)Diabetes Care 20198)。兄弟III-7，通过OGTT被诊断为糖尿病也是胰岛素缺陷。所有的HNF-1α突变体携带者，除了II-4，需要胰岛素治疗用于血糖控制。
虽然所有的染病家族成员携带相同的HNF-1α基因突变，他们的临床治疗过程差别很大。治疗延迟以及在治疗前可能有较差血糖控制的家族成员(II-3，III-2和III-5)出现严重的并发症。但是舅舅(II-4)和年龄小的子女(III-6和III-7)他们虽然得糖尿病10年以上，但是他们诊断和接受治疗都很及时，因此都没有并发症出现。这种现象与近年来的报告，即在MODY3病人中较差的血糖控制与病人发展微量蛋白尿和视网膜病分别增加两倍到三倍危险性相关(Isomaa，等(1998)Diabetologia 41467)。
值得注意的是，外祖父母(I-3和I-4)都是在50岁以后被诊断为糖尿病。这种双系对于这个家族HNF-1α糖尿病自然过程的影响还未知。但是，可能的是非-MODY外祖母传递了一个修饰基因影响携带HNF-1α突变的糖尿病患者的发病年龄以及严重性。这个家族尽管所有携带者都相对不肥胖，但是糖尿病的诊断年龄在连续两代人中逐渐年轻化。这种较早诊断可能归因于确定性的偏差，或者更可能归因于香港生活方式逐渐的西方化，吸收高脂肪食物较多，较少进行体育锻炼(Chan and Cockram(1997)Diabetes Care 201785)。这就强调了在HNF-1α糖尿病自然发展过程中，环境影响遗传的重要性。总之，该报告强调了需要通过葡萄糖耐受试验和遗传筛选的较早诊断，以及那些有较强糖尿病家族史，尤其是那些带有早发疾病和胰岛素缺陷的糖尿病人的合适治疗。
实施例1-5的数据指示了基因突变的组合特定的相关于中国个体发展2型糖尿病危险性的增加。这些突变例如，但不限于HNF-1α的G20R，A116V，IVS2nt→GA，R203H，S432C和I618M；葡萄糖激酶的V101M，I110T，A119D，Q239R和G385V；糊精的S20G；和线粒体tRNALeu(UUR)的A3243G。与中国人个体发展2型糖尿病的遗传倾向相关的突变在带有疾病阳性家族史的中国家族中被有效鉴定，但是被发现用在筛选任何没有症状但是有发展糖尿病危险的中国人个体中。用来鉴定与中国人个体2型糖尿病相关的至少两种基因突变组合的方法对于临床医生而言需要重要的手段，不仅要在出现明显症状以前开始预防性治疗，而且需要涉及治疗方案针对每个个体的特殊病原学。
在说明书中提到的所有的公开物以及专利申请都显示了本发明涉及领域的技术人员的技术水平。所有的公开物和专利申请此处都相同程度的在此处引作参考，如同每个公开物或专利申请都特殊单独的说明被引作参考。
本发明至此已经全部描述完，本领域的普通技术人员应该明了只要不偏离后面说明书的精神或范围，可以做一些改变和修饰。
序列表<110>陈重娥(Chan，Juliana)伍楚贤(Ng，Maggie)李少钦(Lee，Shao)郭志良(Critchley，Julian)郭克伦(Cockram，Clive)<120>用于评估中国血统的人种发展2型糖尿病危险性的方法和组合物(METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR EVALUATING RISK OF DEVELOPING TYPE 2 DIABETES IN PEOPLE OF CHINESEDESCENT)<130>SCT032123-09<160>37<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>726<212>DNA<213>人<220>
<221>不确定<222>(1)..(726)<223>n＝g，a，t or c<400>1tgccggccgg caggcaaacg caacccacgc ggtgggggag gcggctagcg tggtggaccc 60gggccgcgtg gccctgtggc agccgagcca tggtttctaa actgagccag ctgcagacgg120agctcctggc ggccctgctc gagtcaaggc tgagcaaaga ggcactgatc caggcactgg180gtgagccggg gccctacctc ctggctggag aaggccccct ggacaagggg gagtcctgcg240gcggcggtcg aggggagctg gctgagctgc ccaatgggct gggggagact cggggctccg300aggacgagac ggacgacgat ggggaagact tcacgccacc catcctcaaa gagctggaga360acctcagccc tgaggaggcg gcccaccaga aagccgtggt ggagaccctt ctgcagtaag420gagccctgcc ccgtccccgc tcccaggaga gcctagaggg gcccccctca gctcctaacg480
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1.一种微芯片，其包含野生型核酸序列的至少两种不同突变核酸序列的组合，其中每种野生型核酸序列编码一种参与胰岛素分泌的蛋白，其中所述基因包含至少一种指示中国人群中的成员患2型糖尿病的倾向的突变。
2.权利要求1的微芯片，其中所述的核酸序列包含选自由基因组DNA，互补DNA和信使RNA的组成的核酸。
3.权利要求1的微芯片，其中所述的2型糖尿病是年轻发病的成年型糖尿病。
4.权利要求1的微芯片，其中所述的微芯片进一步包括特异性鉴定中国人群成员的遗传标记。
5.一种微芯片，其包含至少两种不同核酸序列的组合，其中每种核酸序列编码一种参与胰岛素分泌的基因产物，其中所述基因包含至少一种指示中国人群体中受试者患2型糖尿病倾向的突变，其中所述基因产物选自葡萄糖激酶，肝细胞核因子1α，糊精和线粒体tRNA(Leu)(UUR)。
6.一种微芯片，其包含不同核酸序列组合中的至少一种，其中每种核酸序列编码一种选自葡萄糖激酶，肝细胞核因子1α，糊精和线粒体tRNA(Leu)(UUR)的蛋白，其中所述的葡萄糖激酶基因包含至少一种选自V101M，I110T，A119D，Q239R，和G385V的突变，而且所述肝细胞核因子1α基因包含至少一种选自G20R，A116V，IVS2nt-G→A，R203H，S432C，和I618M的突变，且所述糊精基因含有S20G突变，且所述tRNA(Leu)(UUR)基因包含A3243G突变。
7.一种微芯片，其包含至少一种选自SEQ ID NO2，SEQ IDNO7和SEQ ID NO10的核酸序列。
8.一种微检测系统，其包含权利要求1，5或6的微芯片。
9.一种包含权利要求1，5或6的微芯片的试剂盒。
10.一种包括SEQ ID NO34的核酸引物。
11.一种包含SEQ ID NO35的核酸引物。
12.一种包含SEQ ID NO36的核酸引物。
13.一种包含SEQ ID NO37的核酸引物。
14.一种特异性退火到编码参与胰岛素分泌的野生型基因的突变基因的核酸上的核酸探针，其中，所述突变基因包含至少一种指示中国人群受试者患2型糖尿病危险性提高的突变，而且其中的所述核酸探针并不与所述野生型基因结合。
15.一种分离的核酸，其编码一种野生型基因的突变基因，该野生型基因编码一种参与胰岛素分泌的蛋白，其中所述的突变基因包含至少一种与中国人群的受试者患2型糖尿病危险性提高相关的突变。
16.权利要求15的分离的核酸，其中所述的突变是单个核苷酸的多态性。
17.权利要求15的分离的核酸，其中所述的突变选自错义突变，无义突变，插入和缺失突变。
18.权利要求15的分离的核酸，其中所述的野生型基因编码肝细胞核因子1α，且所述突变为A116V。
19.权利要求15的分离的核酸，其中所述的野生型基因编码葡萄糖激酶，且所述突变选自V101M和Q239R。
20.一种分离的核酸，编码一种野生型基因的突变基因，该野生型基因编码一种参与胰岛素分泌的蛋白，其中所述的突变基因选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO7和SEQ ID NO10。
21.一种分离的氨基酸序列，由编码参与胰岛素分泌的蛋白的野生型基因的突变基因编码，其中所述突变基因包含至少一种与中国人群的成员患2型糖尿病危险性增加相关的突变。
22.一种特异性结合于一种蛋白的抗体，该蛋白由编码参与胰岛素分泌的蛋白的野生型基因的突变基因编码，其中所述突变基因包含至少一种与中国人群的成员患2型糖尿病危险性增加相关的突变，所述抗体不与野生型基因编码的蛋白结合。
23.一种确定中国人群中的成员发展2型糖尿病的遗传倾向的方法，所述方法包含如下步骤将一种包含来自所述成员核酸的样品与至少两种核酸序列的组合接触，其中每种核酸序列编码一种野生型基因的突变基因，该野生型基因编码一种参与胰岛素分泌的蛋白，其中每种突变基因包含至少一种指示中国人群中的成员发展2型糖尿病倾向的突变，因此在所述样品中鉴定到至少一种所述突变就指示所述中国人群的成员有患2型糖尿病的遗传倾向。
24.一种检测胰岛素分泌功能下降的中国人群个体发展2型糖尿病危险性增加的方法，所述方法包括如下步骤将一种包含所述个体核酸的样品与至少两种不同核酸序列的组合接触，其中每种核酸序列编码一种野生型基因的突变基因，该野生型基因编码一种参与胰岛素分泌的蛋白，其中每种突变基因包含至少一种指示中国人群中的成员发展2型糖尿病倾向的突变，在所述样品中鉴定到至少一种所述突变就指示所述中国人群的个体患2型糖尿病的危险性提高。
25.权利要求23或24的方法，其中所述至少两种不同核酸序列的组合吸附在微芯片上。
26.权利要求23或24的方法，其中所述核酸样品获自体液或组织。
27.权利要求23或24的方法，其中所述野生型基因编码选自肝细胞核因子1α，葡萄糖激酶，糊精，和线粒体tRNA(Leu)(UUR)的基因产物。
28.一种确定中国人群的成员发展2型糖尿病遗传倾向的方法，所述方法包含如下步骤将一种包含来自所述成员核酸的样品和至少两种不同核酸序列的组合接触，这些不同的核酸序列选自肝细胞核因子1α的G20R，A116V，IVS2nt-G→A，R203H，S432C，和I618M；葡萄糖激酶的V101M，I110T，A119D，Q239R和G385V；糊精的S20G，以及线粒体tRNA(Leu)(UUR)的A3243G，其中每种核酸序列编码一种野生型基因的突变基因，该野生型基因编码一种参与胰岛素分泌的蛋白，其中每种突变基因包含至少一种指示中国人群中的成员发展2型糖尿病倾向的突变，且在所述样品中鉴定到一种所述突变就指示所述中国人群的个体患2型糖尿病的遗传倾向。
29.一种检测胰岛素分泌功能降低的中国人群中的个体发展2型糖尿病危险性提高的方法，所述方法包括如下步骤将一种来自上述个体的样品和至少两种不同核酸序列的组合接触，这些不同的核酸序列选自肝细胞核因子1α的G20R，A116V，IVS2nt-G→A，R203H，S432C，和I618M；葡萄糖激酶的V101M，I110T，A119D，Q239R和G385V；糊精的S20G，以及线粒体tRNA(Leu)(UUR)的A3243G，其中每种核酸序列编码一种野生型基因的突变基因，该野生型基因编码一种参与胰岛素分泌的蛋白，其中每种突变基因包含至少一种指示指示中国人群中的个体发展2型糖尿病倾向的突变，且在所述样品中鉴定到至少一种所述突变就指示所述中国人群的个体患2型糖尿病的遗传倾向。
30.一种筛选被诊断为2型糖尿病的中国人群的个体基因突变的方法，所述方法包含如下步骤将一种来自上述个体的样品和至少两种不同核酸序列的组合接触，其中每种核酸序列编码一种野生型基因的突变基因，该野生型基因编码一种参与胰岛素分泌的蛋白，其中每种突变基因包含至少一种指示指示中国人群中的成员发展2型糖尿病倾向的突变，且在所述样品中鉴定到至少一种所述突变就指示所述中国人群的个体患2型糖尿病的病因。
31.权利要求30的方法，其中所述个体年轻时就被诊断为成年型糖尿病。
32.权利要求30的方法，其中所述个体有至少一个祖先家族成员年轻时就被诊断为成年型糖尿病。
33.权利要求30的方法，其中所述突变选自错义突变，无义突变，插入或缺失突变。
34.一种筛选指示指示中国人群的个体发展2型糖尿病危险性增加的基因突变的方法，所述方法包括如下步骤将来自所述个体的样品和至少两种不同核酸序列的组合接触，这些不同的核酸序列选自肝细胞核因子1α的G20R，A116V，IVS2nt-G→A，R203H，S432C，和I618M；葡萄糖激酶的V101M，I110T，A119D，Q239R和G385V；糊精的S20G，以及线粒体tRNA(Leu)(UUR)的A3243G，其中每种核酸序列编码一种野生型基因的突变基因，该野生型基因编码一种参与胰岛素分泌的蛋白，其中每种突变基因包含至少一种指示指示中国人群中的个体发展2型糖尿病倾向的突变。
35.一种筛选中国人群的个体发展2型糖尿病遗传倾向的方法，这些人群有至少一个祖先家族成员被诊断为2型糖尿病，所述方法包含如下步骤将一种含有来自所述个体的核酸的样品和至少两种不同核酸序列的组合接触，，其中每种核酸序列编码一种野生型基因的突变基因，该野生型基因编码一种参与胰岛素分泌的蛋白，其中每种突变基因包含至少一种指示指示中国人群中的成员发展2型糖尿病倾向的突变，且在所述样品中鉴定到至少一种所述突变就指示所述中国人群的所述个体发展2型糖尿病的遗传倾向。
全文摘要
本发明公开了用于鉴定编码参与胰岛素分泌的基因产物，例如肝细胞核因子－1α，葡萄糖激酶，糊精和线粒体DNA的突变基因的突变和多态性的方法和组合物。具体的，本发明公开了含有至少两种不同突变基因组合的微芯片，其中每种基因至少含有一种指示中国人群中的成员患2型糖尿病倾向的突变。同时本发明也公开了含有微芯片，分离的核酸，引物和探针的试剂盒，其特异性的用于筛选或鉴定肝细胞核因子－1α，葡萄糖激酶，糊精和线粒体DNA基因中的突变。
文档编号C12N9/12GK1496412SQ02806425
公开日2004年5月12日 申请日期2002年3月14日 优先权日2001年3月14日
发明者朱利安.A.J.H.克里奇利, 玛吉.C.Y.Ng, 少.C.李, 克莱夫.S.科克拉姆, 朱利安娜.C.N.陈, .S.科克拉姆, .Y.Ng, 娜.C.N.陈 申请人:香港中文大学