一种用于检测二型糖尿病风险的SNPs引物及其应用的制作方法
【专利摘要】一种用于检测二型糖尿病风险的SNPs引物及其应用,包含CDK5调节亚基相关蛋白1类似物1SNPrs7756992，电压门控钾通道的KQT类亚家族成员1SNPrs2237892，胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白SNPrs4402960三种SNPs的引物.通过使用本发明的引物组合检测DNA中这三种单核苷酸多态性的存在可以判断出高风险人群，从而帮助他们调节生活习惯，降低患二型糖尿病的风险，同时定时监控，提早发现二型糖尿病症状，有益治疗。
【专利说明】-种用于检测二型糖尿病风险的SNPs引物及其应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于生物领域，涉及一种用于检测二型糖尿病风险的SNPs引物及其应用。 【背景技术】
[0002] 二型糖尿病是糖尿病中最常见的，其主要症状有高血糖，不同程度的胰岛素抵抗， 和胰岛素分泌功能受损。二型糖尿病会给患者带来各种生活不便，例如口渴，无力，视力下 降等。血液中过高的血糖浓度对血管和器官会造成伤害，引起各种并发症，对患者造成较大 痛苦。其发病原因中有环境因素，生活方式因素，年龄因素等，基因也是其中一个重要原因。
[0003] 目前糖尿病的确定诊断以血糖水平为依据。但是等到血糖水平异常升高到确诊标 准时，往往为时已晚。作为一种慢性代谢性紊乱病症，二型糖尿病也是长期内分泌失调的结 果，其发病过程中伴随着一系列的激素异常，而此类异常往往发生在血糖异常出现之前。发 掘早于血糖指标的早期指标能为预防和治疗糖尿病争取宝贵的时间，也因此成为对抗糖尿 病的关键。
[0004] SNP 全称为 Single-nucleotide polymorphism，单核昔酸多态性。SNPs 是最常见 的基因突变。每一个SNP代表一个核苷酸的不同。大多数时候SNPs出现在编码基因之间， 这可以帮助研究人员定位编码基因。但是，当SNP出现在编码基因当中时有可能对基因的 功能造成一定影响。研究已经发现，SNPs可以影响到一个人对药物的反应,感染某些疾病 的可能性，比如，心脏病，癌症和糖尿病。
[0005] 近年来，研究已经发现了多种SNPs与二型糖尿病相关。不过，这些研究更多的是 针对欧美人种。在基于中国人遗传背景的研究中，二型糖尿病相关SNP多以单个形式被报 道，并未建立起相关模型。由于二型糖尿病是一种慢性代谢紊乱症，与多种蛋白质功能失常 相关，以单个SNP来检测二型糖尿病风险准确性偏低。为了弥补这一缺陷，通过同时检测这 三种易感基因，本发明可以提供更加准确的个体化二型糖尿病患病的危险性评估，从而安 排具体干预措施，通过生活方式上的适度调整（增加每天的身体运动，同时削减热量的摄 入）显著地减少或者延缓糖尿病的发生，降低糖尿病治疗成品。
【发明内容】
[0006] 解决的技术问题：
[0007] 本发明主要目的是提供一种可以用于检测二型糖尿病风险的SNPs引物组合。
[0008] 本发明的另一目的是提供上述SNPs引物在制备检测二型糖尿病风险的试剂盒上 的应用。
[0009] 本发明的另一目的是提供用于检测二型糖尿病风险的试剂盒。
[〇〇1〇] 技术方案：
[0011] -种用于检测_型糖尿病风险的SNPs引物，包含⑶K5调节亚基相关蛋白1 类似物1(CDKAL1)SNP rs7756992,电压门控钾通道的KQT类亚家族成员1(KCNQ1)SNP rs2237892,胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白（IGF2BP2) SNP rs4402960三种SNPs的引物。
[0012] 所述rs7756992 的引物如 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 所示；rs2237892 的引物 如 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 所示；rs4402960 的引物如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
[0013] 所述的用于检测二型糖尿病风险的SNPs引物在制备检测二型糖尿病风险的试剂 盒中的应用。
[0014] 一种用于检测二型糖尿病风险的试剂盒，该试剂盒用于检测DNA中CDK5调节 亚基相关蛋白1类似物1(⑶KAL1)SNP rs7756992,电压门控钾通道的KQT类亚家族成员 1(KCNQ1)SNP rs2237892,胰岛素样生长因子 2mRNA 结合蛋白（IGF2BP2)SNP rs4402960 三 种 SNPs。
[0015] 所述的用于检测二型糖尿病风险的试剂盒，试剂盒中含有CDK5调节亚基相关蛋 白1类似物1 (CDKAL1) SNP rs7756992,电压门控钾通道的KQT类亚家族成员1 (KCNQ1) SNP rs2237892，胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白（IGF2BP2) SNP rs4402960三种SNPs的引物。
[0016] 所述的用于检测二型糖尿病风险的试剂盒，试剂盒中含有rs7756992的引物如 SEQ ID N0. 13 和 SEQ ID N0. 14 所示；rs2237892 的引物如 SEQ ID N0. 15 和 SEQ ID N0. 16 所示；rs4402960 的引物如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
[0017] 所述的用于检测二型糖尿病风险的试剂盒，该试剂盒还包括PCR反应中常用的酶 和/或试剂。
[0018] 本发明所述的SNPs引物筛选过程包括以下步骤（图1)。
[0019] 1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序（S0P)从医院采集的血液样 本，系统收集完整的人口学资料和临床资料，患其他类型糖尿病患者不被包括在内。
[0020] 2)根据现有文献，筛选出11种二型糖尿病相关SNP钾离子内向整流通道蛋 白Jll (KCNJ11) SNP rs5219 (E23K变异），过氧化物酶体增殖物激活受体-γ (PPARG) SNP rsl801282(P12A变异），转录因子7类似物2(TCF7L2)SNP rs7903146,胰岛素样生长因 子2mRNA结合蛋白（IGF2BP2)SNP rs4402960, CDK5调节亚基相关蛋白1类似物1 (CDKAL1) SNP rs7756992,锌转运蛋白 8(SLC30A8)SNP rsl3266634,同源框转录因子（HHEX)SNP rsllll875,肝细胞核因子1β (HNFIP)SNP rs4430796,电压门控钾通道的KQT类亚家族成 员 1(KCNQ1)SNP rs2237892, Wolfram 综合征 I 型基因（WFSl)SNP rsl0010131，细胞周期蛋 白依赖性激酶抑制剂2B(CDKN2B) SNP rs 10811161进行分析。
[0021] 3)使用全血基因组DNA提取试剂盒（BioTeke，China)提取样本中的DNA。
[0022] 4)根据发布的SNP序列设计引物并使用PCR Master Mix (Tiangen Biotech, China)提取相关 SNPs。
[0023] 5)提纯聚合酶链反应产物，使用ABI PRISM3730xl(Applied Biosystems，California，USA)确定序列。并使用 Chromas software version2.0(Gene Codes Corporation, USA)分析所得结果。
[0024] 6)使用 SAS9. 2 (SAS Institute Inc.，Cary, NC, USA)进行数据分析，主要步骤如 下：
[0025] a)使用Chi-square test来分析比较二型糖尿病组与正常对照组的等位基因频 率，p〈0. 05被视为差异有统计学意义。
[0026] b)精确检验的近似检验法被用于分析SNP的Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)〇
[0027] c)基于显性模型，Logistic regression analysis被应用于每一个符合 Hardy-Weinberg equilibrium的SNP，ρ〈0· 05被视为差异有统计学意义。
[0028] d)基于多变量模型，multi-SNP logistic regression analysis被应用于每一个 符合Hardy-Weinberg equilibrium的SNP，ρ〈0· 05被视为差异有统计学意义。
[0029] e)根据以上结果筛选出在二型糖尿病患者和正常对照组中差异表达显著的⑶Κ5 调节亚基相关蛋白1类似物1 (⑶KAL1)SNP rs7756992,电压门控钾通道的KQT类亚家族成 员 1(KCNQ1)SNP rs2237892,胰岛素样生长因子 2mRNA 结合蛋白（IGF2BP2)SNP rs4402960 三种SNPs。
[0030] 7)根据以上结果制备测试二型糖尿病风险试剂盒，该试剂盒包括以上三种SNPs 的引物，PCR反应中的常用试剂。
[0031] 有益效果：
[0032] 随着生活方式和饮食结构的改变，糖尿病作为一种慢性常见病越来越成为危害身 体健康的主要疾病。目前，我国成年人的发病率已高达10%，患者超过1亿，其发病速度增 长迅猛，已在过去的六年翻了两番。而且糖尿病的未诊断率高达60%。农村的未诊断率更 高达到70%，中国的糖尿病患者大部分￠000-7000万）没有被发现和诊断。
[0033] 因此，糖尿病的预防与治疗越发重要。早期基因筛查是目前国际上被广泛应用的 预防方法之一。本发明的试剂盒可以对血糖正常的成年人甚至是婴儿进行二型糖尿病的 早期基因筛查，无需空腹测血糖，也无需其家族史和BMI测量值，实现了对二型糖尿病的快 速可靠的大面积早期筛查，是预防像糖尿病这种目前还无法治愈的慢性疾病的里程碑性突 破。
[0034] 与此同时，在基于中国人遗传背景的研究中，二型糖尿病相关SNP多以单个形式 被报道，并未建立起相关模型。由于二型糖尿病是一种慢性代谢紊乱症，与多种蛋白质功能 失常相关，以单个SNP来检测二型糖尿病风险准确性偏低。本发明所提供试剂盒可以支持 同时检测多种二型糖尿病易感基因，大大提高了二型糖尿病患病的危险性评估的准确性。
[0035] 本发明在基于中国人遗传背景的众多二型糖尿病相关SNPs中筛选出三种关联 性最高的SNPs，CDK5调节亚基相关蛋白1类似物1 (CDKALl)SNP rs7756992,电压门控钾 通道的KQT类亚家族成员1(KCNQ1)SNP rs2237892,胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白 (IGF2BP2)SNP rs4402960。在本发明的实验中，使用dominant model分析SNPs与T2D的关 联性时，rs7756992, rs2237892, rs4402960 的 Odds Ratio (0R)分别为 2. 0, 3. 09,1. 56。而使 用 multivariable model 分析 SNPs 与 T2D 的关联性时，rs7756992, rs2237892, rs4402960 的 Odds Ratio (OR)分别为 2· 29,4· 22, L 76。
[0036] 本发明的试剂盒提供了更准确的，更快速的，更便利的早期基因筛查，可以大面积 应用检测出二型糖尿病高风险人群，从而更有针对性地，效率更高地安排具体干预措施，通 过生活方式上的适度调整（增加每天的身体运动，同时削减热量的摄入）显著地减少或者 延缓糖尿病的发生，降低糖尿病治疗成本。
[0037] 本发明的试剂盒可以对血糖正常的成年人甚至是婴儿进行二型糖尿病的早期基 因筛查，无需空腹测血糖，也无需其家族史和BMI测量值，实现了对二型糖尿病的快速可靠 的大面积早期筛查，是预防像糖尿病这种目前还无法治愈的慢性疾病的里程碑性突破。 【专利附图】
【附图说明】
[0038] 图1为SNPs引物筛选与试剂盒的流程示意图。 【具体实施方式】
[0039] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本 发明。
[0040] 实施例1
[0041] 样本的收集与整理：
[0042] 发明人于2011年5月至2012年4月间从宁波李惠利医院收集了 222例二型糖尿 病患者和140正常对照组的血液样本进行研究。
[0043] 使用全血基因组DNA提取试剂盒（BioTeke，China)提取DNA，具体步骤如下：
[0044] 1)在1. 5mL的微量离心管中加入900 μ L红细胞裂解液。
[0045] 2)充分混合抗凝血液，加300 μ L到步骤1中的红细胞裂解液。
[0046] 3)在室温中静置10分钟。
[0047] 4)以12000rpm的转速离心20秒。小心去除红色上清液，震荡15秒。
[0048] 5)加入300 μ L核裂解液，快速强力地弹动几下离心管。
[0049] 6)加入30 μ g/mL的RNase Α，充分混合，在37°C中孵育15分钟，然后静置至室温。
[0050] 7)加入100 μ L蛋白质沉淀缓冲液，震荡20-25秒。
[0051] 8)以13000rpm的转速离心5分钟。
[0052] 9)转移上清液（大约300 μ L)到一个新的1. 5mL的微量离心管中。
[0053] 10)加入同样体积的异丙醇，轻柔翻转30次，直到一些白色丝状DNA沉淀出现。
[0054] 11)去除上清液，保留DNA沉淀。
[0055] 12)加入lmL70%乙醇并混合。以13000rpm转速离心1分钟，去除上清液。
[0056] 13)加入0. 5mL70%乙醇并混合。以12000rpm转速离心1分钟，去除上清液，在空 气中自然晾干几分钟。
[0057] 14)加入100 μ L DNA溶解液，轻敲离心管来混合，在65°C中孵育30-60分钟，然后 保持在4 C。
[0058] 使用PCR Master Mix (Tiangen Biotech,中国）提取相关SNP，具体步骤如下：
[0059] 1)取5yL上一步所得DNA溶解液，加入25yL双蒸水，稍震荡，离心。
[0060] 2)于超净工作台冰板上配置反应体系：25 μ L的PCR反应体系包括12. 5 μ L PCR Master Mix, 1 μ L 浓度为 10 μ m 的 upstream primer, luL 度为 10 μπι 的 downstream primer，2 μ L步所得稀释DNA溶解液，8. 5 μ L蒸水，稍震荡，离心。
[0061] 3)设置空白对照，包括 12.5yL PCR Master Mix，lyL浓度为 ΙΟμπι 的upstream primer, 1 μ L 浓度为 10 μ m 的 downstream primer, 10. 5 μ L 双蒸水，稍震荡，离心。
[0062] 4)定量PCR，在94°C下3min，然后进行30个热循环：94°C下30s，55°C (根据不同 SNP引物设定不同温度，见下表1)下30s，72°C下lmin，完成后在72°C下孵育5min。每一组 设置空白对照，以检测过程中是否有污染。
[0063] 5)反应后，取5 μ L反应产物，使用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0064] 提纯 PCR产物，使用 ABI PRISM3730xl (Applied Biosystems, California, USA)确 定序列。并使用 Chromas software version2.0 (Gene Codes Corporation, USA)分析所得 结果。
[0065] 使用 SAS9. 2 (SAS Institute Inc. , Cary, NC, USA)进行数据分析，主要步骤如下：
[0066] 1)使用Chi-square test来分析比较二型糖尿病组与正常对照组的等位基因频 率，p〈0. 05被视为差异有统计学意义。
[0067] 2)精确检验的近似检验法被用于分析SNP的Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)〇
[0068] 3)基于显性模型，Logistic regression analysis被应用于每一个符合 Hardy-Weinberg equilibrium的SNP，ρ〈0· 05被视为差异有统计学意义。
[0069] 4)基于多变量模型，multi-SNP logistic regression analysis被应用于每一个 符合Hardy-Weinberg equilibrium的SNP，ρ〈0· 05被视为差异有统计学意义。
[0070] 依据以上数据分析结果（表2,表3,表4)筛选出针对中国人遗传背景的二型糖尿 病易感基因，根据序列结果设计易感基因 PCR引物并制备试剂盒。
[0071] 应用试剂盒：根据以上步骤，提取血样中的DNA，使用PCR提取相关SNPs并使用琼 脂糖胶电泳检测，确定二型糖尿病易感基因的存在。
[0072] 表1 :所用寡核苷酸引物
[0073]
【权利要求】
1. 一种用于检测二型糖尿病风险的SNPs引物，其特征在于包含CDK5调节亚基相关蛋 白1类似物1 SNP rs7756992,电压门控钾通道的KQT类亚家族成员1 SNP rs2237892,胰 岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白SNP rs4402960三种SNPs的引物。
2. 根据权利要求1所述所述用于检测二型糖尿病风险的SNPs引物，其特征在于所述 rs7756992 的引物如SEQIDN(λl3和SEQIDN(λl4所示；rs2237892 的引物如SEQID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 所示；rs4402960 的引物如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
3. 权利要求1或2所述的用于检测二型糖尿病风险的SNPs引物在制备检测二型糖尿 病风险的试剂盒中的应用。
4. 一种用于检测二型糖尿病风险的试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测DNA中CDK5 调节亚基相关蛋白1类似物1 SNP rs7756992,电压门控钾通道的KQT类亚家族成员1 SNP rs2237892,胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白SNP rs4402960三种SNPs。
5. -种用于检测二型糖尿病风险的试剂盒，其特征在于试剂盒中含有CDK5调节 亚基相关蛋白1类似物1 SNP rs7756992,电压门控钾通道的KQT类亚家族成员1 SNP rs2237892,胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白SNP rs4402960三种SNPs的引物。
6. 根据权利要求5所述的用于检测二型糖尿病风险的试剂盒，其特征在于所述的用于 检测二型糖尿病风险的试剂盒，试剂盒中含有rs7756992的引物如SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14 所示；rs2237892 的引物如 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 所示；rs4402960 的引物 如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
7. 权利要求4~6任一所述的用于检测二型糖尿病风险的试剂盒，其特征在于该试剂盒 还包括PCR反应中常用的酶和/或试剂。
【文档编号】C12N15/11GK104087658SQ201410243182
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】刘宁生 申请人:南京医科大学, 刘宁生