一种用于诊断乳腺癌的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物化学与分子生物学领域，提供一种用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有特异性扩增检测人HERC4基因mRNA表达水平的荧光定量PCR引物：5’-GTCTCCACAGTTGCCAGTAATA-3’(SEQ?NO.1)，5’-CTAAAGCACTGCAGCATCAATAA-3’(SEQ?NO.2)；和荧光探针：5’FAM-ACCCAGTGATTGGTGCTCATAGTAGC-BHQ13’(SEQ?NO.3)。该试剂盒对乳腺癌中HERC4基因的表达检测具有良好的敏感性和特异性，重复性很好，可以有效的区分乳腺癌癌变的上皮细胞和正常乳腺上皮细胞(或乳腺良性病变细胞，包括乳腺增生、乳腺囊肿、乳腺纤维瘤、乳腺炎导管内乳头状瘤等)，从而为乳腺癌的临床诊断和鉴别诊断提供参考依据。
【专利说明】—种用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物化学及分子生物学领域，具体涉及包含核酸测定或检验方法的检测试剂。
【背景技术】
[0002]自上世纪70年代末开始，全球乳腺癌发病率一直呈上升趋势。世界卫生组织GL0B0CAN网站统计预测，2013年全球有130万妇女被诊断患有乳腺癌，45万死于乳腺癌。国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的数据显示:在全国肿瘤登记地区，2009年乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第I位，女性乳腺癌发病率(粗率)全国合计为42.55/10万,城市为51.91/10万,农村为23.12/10万。可见乳腺癌已成为威胁女性生命和健康，影响当前社会的重大公共卫生问题。
[0003]乳腺癌的早期发现、早期诊断，是提高疗效的关键。据国内资料报道，乳腺癌I期的5年生存率在90%~95%以上，II期是70%到80%，III期是50%到60%，IV期则是10%左右，其治愈率与临床分期存在相关关系。早期乳腺癌的治愈率高，晚期的治愈率低，因此早期诊断、早期治疗对于乳腺癌的防治具有重要意义。然而，早期乳腺癌往往不具备典型的症状和体征，不易引起重视。多数患者是自己无意中发现乳腺肿块来医院就诊的，少数患者是通过定期体检或筛查被发现乳腺肿物或可疑病变。这种被动诊断的结果常常造成了早期治疗的延误。
[0004]目前国内乳腺癌 的诊断主要是通过实验室检查和辅助检查。应用免疫学的方法对于肿瘤标志物的检查，普遍存在特异性差、灵敏度低等问题，尤其对于早期乳腺癌的诊断效率更低。而影像学检测对于占位较大的肿瘤才有较高的诊断率。同样脱落细胞学检查主要是针对乳头溢液涂片、乳腺肿物破溃处等症状已经较为明显的组织进行检查。除此之外，中国属于发展中国家，人口基数庞大，开展以影像学为主的筛查还需要一段时间。多数乳腺癌患者确诊时已处于晚期，对于病人术后预后的检测和有效治疗方法的选择需要更有效、更简便的方法。
[0005]研发具有灵敏度高、特异性强、简单方便的乳腺癌诊断产品，是提高乳腺早期检出率，改善预后的关键之一。蛋白质的降解主要有两条途径，其中一条是通过溶酶体的非特异性降解；另外一条是通过泛素-蛋白酶系统(UPS)的特异性降解，被选择的蛋白质连接有泛素“标签”以后，就会被转入26S蛋白酶体中进行特异性降解。泛素是由76个氨基酸组成的蛋白质，广泛存在于生物体内。泛素连接至蛋白质的氨基酸残基上主要通过三种酶的作用:泛素激活酶(El)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。E3泛素连接酶决定了泛素化底物的特异性，大量研究表明，泛素-蛋白酶系统(UPS)在肿瘤的发展、发展过程中起到了关键作用。
[0006]HERC4是近年来才被鉴定出的一种E3泛素连接酶，其特点是具有HECT结构域和至少一个RCCl样结构域。免疫荧光结果显示HERC4定位于细胞的核内体和溶酶体中。研究证明，在小鼠中突变HERC4基因，可通过减弱成熟精子的运动性而间接影响雄性小鼠的生育能力。关于HERC4基因在乳腺癌发生、发展过程中起到的作用，及其可以作为一种新的乳腺癌临床诊断和鉴别诊断的分子标志物应用于临床，目前国内外尚未有报导。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是提供一种用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒对乳腺癌中HERC4基因表达检测具有良好的敏感性和特异性等特点。
[0008]本发明解决上述问题的技术方案具体是:
[0009]一种用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括一对引物、荧光探针和定量阳性模板，其特征在于，
[0010](I)所述的一对引物是特异性扩增HERC4基因的引物，其序列为:
[0011]上游引物序列为:5’-GTCTCCACAGTTGCCAGTAATA-3’ (SEQ N0.1)； [0012]下游引物序列为:5’-CTAAAGCACTGCAGCATCAATAA-3’ (SEQ N0.2)；
[0013](2)所述的荧光探针的序列为:
[0014]5’FAM-ACCCAGTGATTGGTGCTCATAGTAGC-BHQ13’ (SEQ N0.3),
[0015]其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，BHQl为标记在探针3’端的荧光淬灭基团；
[0016](3)所述的定量阳性模板为克隆有HERC4基因片段的pMD18-T载体重组质粒，其中所述的HERC4基因片段的序列为:
[0017]GTCTCCACAGTTGCCAGTAATAAAAAGAAACATTGGCTACTATGAGCACCAATCACTGGGTTATAGCTTTCAAAAT TATTGATGCTGCAGTGCTTTAG(SEQ N0.4)。
[0018]本发明所述的用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR试剂盒还包括Taq DNA聚合酶预混液和参比染料。
[0019]本发明所述的特异性扩增HERC4基因的引和物荧光探针可以采用本领域常用的方法合成。
[0020]上述的荧光定量PCR试剂盒中的，所述的Taq DNA聚合酶预混液为来自大连宝生物(Takara)公司的Premix Ex Taq?,所述的参比染料为来自大连宝生物(Takara)公司的ROX Reference Dye II。
[0021]本发明所述的定量阳性模板的构建方法是将HERC4基因片段(SEQ N0.4)插入到PMD18-T质粒载体中构建重组质粒得到，其中所述的将HERC4基因片段(SEQ N0.4)插入到质粒载体的方法为本领域的常规方法，具体的步骤和参数按照所选的质粒载体、插入片段、DNA连接酶等而定。
[0022]根据Genbank检索结果,HERC4基因在人体内主要有两个可变转录本(transcriptvariant) ,Genbank登录号分别为ΝΜ_022079.2及ΝΜ_015601.3，BLAST结果显示，这两个转录本仅有24个碱基(I个外显子)的差别，本发明人通过前期研究发现，这两个转录本在正常乳腺上皮细胞中均不表达，而在乳腺癌组织中明显高表达，因此本发明试剂盒针对HERC4基因的两个转录本中的共有序列设计了上游及下游扩增引物(SEQ N0.1和SEQ N0.2)，其位置在靠近HERC4基因多聚腺苷酸尾部(如图1所示)，以保证该片段在逆转录过程中能够得到有效的合成。
[0023]本发明所述的试剂盒的使用方法为:[0024](I)荧光定量PCR，反应体系如下:
[0025]表1本发明试剂盒Real-Time PCR反应体系
【权利要求】
1.一种用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括一对引物、荧光探针和定量阳性模板，其特征在于， (1)所述的一对引物是特异性扩增HERC4基因的引物，其序列为: 上游引物序列为:5’ -GTCTCCACAGTTGCCAGTAATA-3’ ； 下游引物序列为:5’ -CTAAAGCACTGCAGCATCAATAA-3’ ； (2)所述的荧光探针序列为:
5’ FAM-ACCCAGTGATTGGTGCTCATAGTAGC-BHQ13’， 其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，BHQl为标记在探针3’端的荧光淬灭基团； (3)所述的定量阳性模板为克隆有HERC4基因片段的pMD18-T载体重组质粒，其中所述的HERC4基因片段的序列为:
GTCTCCACAGTTGCCAGTAATAAAAAGAAACATTGGCTACTATGAGCACCAATCACTGGGTTATAGCTTTCAAAAT TATTGATGCTGCAGTGCTTTAG。
2.根据权利要求1所述的一种用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括Taq DNA聚合酶预混液和参比染料。
【文档编号】C12Q1/68GK103981276SQ201410243062
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】石嵘, 周晖, 周珏宇, 危敏, 马文丽 申请人:南方医科大学