水稻转录因子Os01g60810基因CDS序列的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水稻转录因子Os01g60810基因CDS序列的应用。在本发明中，首次将CaMV35S启动子与水稻转录因子Os01g60810基因的CDS序列进行融合，并将该融合基因转化到水稻中，从而改良水稻株高和茎粗的性状，例如水稻株高明显变矮、茎秆明显增粗。对于详细阐明水稻生长发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的性状，因此在生产实践中具有重要意义。
【专利说明】水稻转录因子0s01g60810基因 CDS序列的应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子0s01g60810基因⑶S序 列的应用。 【背景技术】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是我国和全世界最重要的粮食作物之一，是世界一半以上 人口的主食，也是单子叶植物功能基因研究的一个重要模式植物。与其相关的分子生物学 和遗传学的研究一直倍受大量研究者们的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方 式。
[0003] 株高是水稻的一个重要农艺性状之一，其主要由水稻节间的伸长调节，它与植株 的丰产潜力、抗病虫害、抗倒伏、光合强度和肥料的耐久性密切相关。直到上世纪60年代， 水稻半矮杆基因 sdl (semi-dwarf)的应用，带来了农业生产的第一次"绿色革命"，这成为 了矮化育种的重要标志，这在水稻育种史也是前所未有的重大突破，此后，大量的矮杆基因 的发掘、遗传、定位方面的研究受到广大研究者的重视。近年来在水稻中也相继出现与株高 相关的研究报道。Ashikari等（1999)利用图位克隆方法分离出水稻D1基因，该基因的隐 性突变等位基因 dl导致水稻呈现为矮杆表型。研究表明，D1是通过编码一种GTP结合蛋白 的α亚基来参与赤霉素信号传导，而dl由于缺失了这种编码功能而导致赤霉素信号传导 受阻，使水稻发生矮化。Yamamuro等（2000)通过克隆水稻矮杆基因 d61，证明了该基因的 作用是使油菜素内酯及其受体的合成受阻而造成植株的矮化表型。Zhi等（2003)克隆了水 稻D2基因，通过对该基因的研究发现表明，D2基因是编码一个BR合成霉的中间体P450，而 水稻矮杆基因 d2则缺失了这种编码功能，使得BR合成受阻从而引起水稻植株的矮化。因 此，开展控制水稻株高相关的研究将是水稻主要农业性状的遗传学研究和育种实践的重要 内容。
[0004] 茎杆性状是影响水稻产量的一个重要因素，目前用于评价水稻茎杆的性状的一些 农艺性状如茎杆高度、茎杆粗细、茎杆节间长度、茎壁厚度，解剖性状如厚壁组织大、小和数 量，维管束数量以及理化性状如木质素、细胞壁纤维素含量、硅与钾的含量和细胞中碳水化 合物积累的数量等。近年来关于水稻茎杆各个性状的研究很多，其中茎杆粗度或直径是影 响水稻倒伏的一个重要因素。邹德堂等（1997)研究认为，植株茎杆基部越粗，越不容易发 生倒伏。肖应辉等（2005)研究表明，倒伏指数与茎杆粗细的相关系数达显著水平，这表明 了水稻倒伏指数受茎粗细性状的显著影响。王秀凤等（2006)对水稻茎杆抗倒伏性构成因 素做了深入分析，结果表明：遗传因子和栽培管理是影响水稻倒伏最主要的因素，并指出从 遗传因子角度改良水稻抗倒伏能力比改善栽培管理条件更经济有效；此后，沈洪昌（2009) 对水稻茎杆形态结构与倒伏性的相关性的研究也阐述了这一问题。
[0005] 因此，鉴定和研究控制水稻株高和茎粗的基因，开展株高和茎粗克隆、基因定位及 作用机理等方面的研究，实现对水稻株高和茎粗的改良，具有重要的理论意义与应用价值。
[0006] OVATE蛋白首先在番茄中被研究报道，该基因的一个点突变将导致其功能缺失，使 番茄形状由圆形变为梨形，过量表达该基因还影响叶片、花和果实的生长和发育。Liu等 (2002)研究表明，OVATE蛋白本身并不控制果实的形状，它是一种植物生长和发育抑制调 节蛋白。Hackbusch等（2005)在拟南芥中过量表达该基因，过表达株系显示出发育迟缓、叶 片、花和角果的生长发育受到抑制，花瓣萼片呈现卵圆形以及短角果等表型变化。Wang等 (2007)对该家族基因进行了深入的研究，例如，AtOFPl是一个转录因子抑制子，调控一种 控制细胞延伸的赤霉素合成酶基因表达，它的过表达会减小细胞长度，从而使其下胚轴、子 叶、叶片、花器官、角果表现均变短的表型变化，同时AtOFP2与AtOFP7也有相似的表型。Li 等（2011)研究表明，AtOFP4与生长发育相关基因 KNAT7能发生相互作用共同调控次生细胞 壁的形成，从而调控植物的生长和发育。该结论为解释过表达拟南芥的表型变化提供了新 的理论依据。水稻中尚未见OVATE蛋白的相关研究报道，水稻转录因子0s01g60810是水稻 OVATE蛋白家族成员之一，因此，研究它在水稻中的调控机制以及功能具有非常重要的理论 意义与应用价值。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供水稻转录因子0s01g60810基因⑶S序列的应用。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种融合基因，其为CaMV35S启动 子-Linker-0s01g60810。
[0009] 其中，CaMV35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；0s01g60810为水稻转 录因子0s01g60810基因的CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；Linker序列为 5'-CTAGAGTTATCAACAAGTTTGTA-3' 。
[〇〇1〇] 本发明还提供在严格条件下，可与该融合基因的核苷酸序列发生杂交的核苷酸序 列。所述严格条件为在含0. 1 % SDS的0. 1 X SSPE或含0. 1 % SDS的0. 1 X SSC溶液中，在 65 °C下杂交，并用该溶液洗膜。
[〇〇11] 本发明还提供含有所述融合基因的载体（例如，植物双元表达载体 pCambial390)、工程菌及细胞系。
[0012] 所述载体的构建方法如下：
[0013] (1)在植物转录因子数据库（http://rice· plantbiology. msu. edu/analyse_ search_locus. shtml)中找到0s01g60810基因，根据其CDS序列设计PCR扩增引物对，其为 正向引物 F5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGGGAGGCACAAGTTCAGG-3' 和反向引物 R5' -CAAGAAAGCT GGGTCCATCTTGATGTCCGCGAGGTTG-3' 。
[0014] (2)以野生型'日本晴'水稻总cDNA为模板，利用上述引物F和R进行PCR，获得 0s01 g60810基因完整的CDS序列。
[0015] (3)将上述PCR产物克隆到pDONR克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相 同的序列。
[0016] (4)通过LR反应将0s01g60810基因的⑶S序列构建到其由花椰菜花叶病毒 (CaMV)35S启动子驱动的植物双元表达载体上，获得组成型过表达载体35S:0s01g60810， 其全序列如SEQ ID No. 3所示。
[0017] 上述组成型过表达载体35S:0s01g60810可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接 DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998, Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,第 411-463页；Geiserson和 Corey, 1998, Plant Molecular Biology,第二版）。
[0018] 本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为：采用农杆菌介导的方法， 将上述携带有编码所述组成型水稻转录因子35S-Linker-0s01g60810基因的表达载体转 入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的材料经过共培 养-筛选-分化-生根-炼苗和移栽，筛选转基因水稻植株。
[0019] 本发明还提供用于扩增水稻转录因子0s01g60810基因⑶S序列的引物对，包括正 向引物 F5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGGGAGGCACAAGTTCAGG-3' 和反向引物 R5' -CAAGAAAGCTGG GTCCATCTTGATGTCCGCGAGGTTG-3' 。
[0020] 本发明进一步提供水稻转录因子0s01g60810基因⑶S序列在调控水稻株高、茎粗 (例如，抑制水稻株高，增加水稻茎粗）中的应用。将水稻转录因子0s01g60810基因的CDS 序列去掉终止密码子之后，构建到CaMV35S启动子的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻 植株性状。
[0021] 前述的应用，其是将水稻转录因子0s01g60810基因的⑶S序列去掉终止密码子之 后，通过Gateway系统构建到CaMV35S启动子的下游，转化水稻，从而调控水稻株高、茎粗等 性状。
[0022] 本发明首次将玉米CaMV35S启动子与水稻转录因子0s01g60810基因的⑶S序列 进行融合，并将该融合基因转化到水稻中，从而改良水稻株高和茎粗的性状，例如抑制水稻 株高，增加水稻茎粗。对于详细阐明水稻生长发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过 转基因手段，改良水稻的性状，因此在生产实践中具有重要意义。 【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为本发明实施例1中构建的组成型过表达载体35S:0s01g60810的质粒图谱。
[0024] 图2为本发明实施例3中过表达0s01g60810转基因水稻株系的基因组PCR鉴定 结果。
[0025] 图3为本发明实施例4中过表达0s01g60810转基因水稻的株高性状表型改 变（A)和考种数据分析（B);其中，WT表示野生型水稻'kitaake'，35S:0s01g60810表示 35S:0s01g60810转基因水稻株系。
[0026] 图4为本发明实施例4中过表达0s01g60810转基因水稻植株的茎粗的改变 (A)和考种数据分析（B);其中，WT表示野生型水稻'kitaake'，35S:0s01g60810表示 35S:0s01g60810转基因水稻株系。 【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0028] 实施例10s01g60810基因⑶S序列的获得及植物表达载体的构建
[0029] 1. 0s01g60810基因 CDS序列的获得
[0030] 在植物转录因子数据库（http://rice. plantbiology. msu. edu/analyses_s earch_locus. shtml)中找到0s01g60810基因，根据其⑶S序列设计PCR扩增引物，正向引 物 F5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGGGAGGCACAAGTTCAGG-3' 和反向引物 R5' -CAAGAAAGCTGGGTCC ATCTTGATGTCCGCGAGGTTG-3'。以野生型'日本晴'水稻总cDNA为模板，利用引物F和R进行 PCR，获得 0s01g60810 基因完整的 CDS 序列（Seq I D No. 1)。
[0031] 2.植物表达载体的构建
[0032] 将水稻转录因子0s01g60810基因的CDS序列通过Gateway系统构建到CaMV35S 启动子（SEQ ID No. 2)的下游。
[0033] 2. 1将上述PCR产物克隆到pDONR克隆载体上
[0034] 按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮PCR，第 一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的基因引物（F和R)，而第二轮的模板用第一 轮的 PCR 产物，并且引物用完整的 adaptor attB 引物（attB-adaptor-F :5' -GTGGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB-adaptor-R :5' -GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3 '）。将PCR产物克隆到pDONR克隆载体（购自Invitrogen)上，经测序鉴定得到与目的基因 完全相同的序列。
[0035] 2. 2植物表达载体的构建
[0036] 通过LR反应将0s01g60810基因的⑶S序列构建到其由CaMV35S驱动的植物双 元表达载体pCambial390上，获得组成型过表达载体35S:0s01g60810,其全序列如SEQ ID No. 3所示，载体图谱见图1。
[0037] LR反应体系如下：
[0038]
【权利要求】
1. 一种融合基因，其特征在于，其为CaMV35S启动子-Linker-0s01g60810 ;其 中，CaMV35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；0s01g60810为水稻转录因 子0s01g60810基因的CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；Linker序列为 5'-CTAGAGTTATCAACAAGTTTGTA-3' 。
2. 含有权利要求1所述融合基因的载体。
3. 根据权利要求2所述的载体，其特征在于，出发载体为植物双元表达载体 pCambial390。
4. 含有权利要求1所述融合基因的工程菌。
5. -种转基因水稻植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将权利要求 2或3所述的载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化 后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-炼苗和移栽，筛选转基因水稻植株。
6. 用于扩增水稻转录因子0s01g60810基因⑶S序列的引物对，其特征在于，包括正向 引物 F5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGGGAGGCACAAGTTCAGG-3' 和反向引物 R5' -CAAGAAAGCTGGGT CCATCTTGATGTCCGCGAGGTTG-3' ； 其中，水稻转录因子0s01g60810基因的CDS序列如Seq ID No. 1所示。
7. 水稻转录因子0s01g60810基因 CDS序列在调控水稻株高、茎粗中的应用，所述水稻 转录因子0s01g60810基因的CDS序列如Seq ID No. 1所示。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述调控水稻株高、茎粗具体为抑制水稻 株高，增加水稻莖粗。
9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0s01g60810基因的 CDS序列去掉终止密码子之后，构建到CaMV35S启动子的下游，转化水稻，从而改良转基因 水稻植株性状。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0s01g60810基因的 ⑶S序列去掉终止密码子之后，通过Gateway系统构建到CaMV35S启动子的下游。
【文档编号】C12N1/21GK104046643SQ201410243051
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】边鸣镝, 于慧, 周连霞, 柳青, 朴明鑫, 杨振明, 孙禹, 黄胜, 熊璐, 张云云 申请人:吉林大学