专利名称：：作为用于早期预测自身免疫和1型糖尿病风险之工具的生物流体代谢物谱分析的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于早期诊断儿童发生1型糖尿病的易感性的方法。此外，本发明还涉及一种用于预防诊断为易发生1型糖尿病的儿童中1型糖尿病的方法。
背景技术：
：将本文中使用的用于阐述本发明背景的出版物及其它材料，特别是提供有关实施的补充详细内容的实例通过参考并入本文。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，其中身体自身的免疫系统攻击胰脏胰岛中的P细胞，破坏它们或损伤它们至足以减少或消除胰岛素的生成。在几乎所有的西方国家中，在过去10-50年期间，l型糖尿病(最常见的儿童代谢性-内分泌疾病)的发病率由于未知的原因而增加。p细胞特异和最终破坏一起出现，它们通常先于1型糖尿病的明显发病几个月至几年。自身免疫的未知引发因素和对支持p细胞衰竭发生机制的缺少理解不仅阻碍了对遗传易感个体中绝对疾病风险和疾病发病时间的评估，而且妨碍了对有效预防的发现。
发明内容本发明的目的和概述本发明的一个目的是提供一种用于早期诊断儿童发生1型糖尿病的易感性的方法。特别地，所述目的是提供一种用于在1型糖尿病的临床发病之前几个月或几年、优选地甚至在儿童血清中出现自身抗体的紧急情况之前，诊断儿童发生1型糖尿病风险的方法。一个具体的目的是提供一种用于诊断甚至新生儿在以后阶乾良生1型糖尿病的风险的方法。而且，本发明的一个目的是提供用于预防被诊断为易发生1型糖尿病的儿童中1型糖尿病发病的方法。为了克服和已确立方法有关的障碍，我们于1994年在芬兰开始了1型糖尿病预测和预防研究(DIPP),这是一个大的出生,研究。在父母知情同意之后，首先分析了新生儿脐带血中与l型糖尿病风险和保护相关的HLA等位基因。然后，对遗传危险增加的儿童进行频繁检查以发现何时出现糖尿病相关自身抗体或发生临床糖尿病。在11.5年的研究期间，筛选了超过100,000名新生儿，超过450名发生了表明疾病风险显著提高的多种自身抗体，其中仍在研究中的138名迄今已发生临^t尿病，这提供了一系列独特的用于研究疾病发病机理和预测的样本。代谢物的血清模式至少在某种程度上反映了系统的动态平衡，特定代谢物组的改变可能是对环境或遗传改变或介入的系统反应2。代谢组学(Metabolomics)平台适用于所有的分析物，其追踪时间-反应并具有高才羊品通量的能力。代谢表型也受环境因素比如营养和肠道孩i生物群的影响3，4，其与复杂疾病比如1型糖尿病特别相关，1型糖尿病被认为是同时受遗传因素和环境的影响5。采用现今用于处理大量数据的分析和信息技术，所述代谢组学方法变得日益切实可行。因此，代谢组学可以提供用于表征例如所选生理反应和病理反应的复杂表型和生物标志物的有力方法6，7。因此，就其最宽泛方面而言，本发明涉及一种用于诊断儿童发生I型糖尿病的易感性的方法，其中所述方法包括下述步骤i)测定幹珍断儿童中至少一种血清代谢物的浓度，ii)比较所述代谢物的血清浓度与健康儿童对照组中相同代谢物的血清浓度，和iii)使用待诊断儿童与对照组之间的浓度差异作为指示儿童发生I型糖尿病的易感性的生物标志物。在另一个方面，本发明涉及一种用于预防儿童中l型糖尿病发病的方法，所述儿童根据本发明已被诊断为易发生I型糖尿病，所述方法包括使所述儿童接受一种或多种预防糖尿病发病的措施。图1.DIPP研究的设计和代谢组学的样品选择。(a)DIPP研究设计，(b)9岁时已发生糖尿病的儿童的自身抗体分镨(autoantibodyprofile)，(c)研究中所包括的样品，(d)分析设计和本文所要解决的主要问题。图2.Oulu批中所有样品的二维Sammon映射(two-dimensionalSammon，smapping)。总共包括518个样品，186个鉴定的脂质作为变量。在映射分析后使四个不同的潜在的疑似因素直观化，(a)个体ID,(b)性别，(c)年龄，和(d)样品时间。图3.来自DIPPTurku批的选定的醚连接的磷^碱物质的分布，(a)GPCho(36:2e)的纵向分布。(b)GPCho(40:4e)的纵向分布。(c)l岁时的GPCho(36:2e)水平。每个个体只包括一个样品，最接近1岁。(d)3岁时的GPCho(36:2e)水平，(e)6岁时的GPCho(36:2e)水平。图4.脐带血脂质分布。(3)得分图表明出生时*者和大多数未*者之间的脂质分布差异。(b)载荷表明该差异是由磷脂引起的，(c)i^者和未*者之间的醚连接的磷酸胆碱GPCho(36:2e)没有差异。(d)总磷i^S碱水平，计算为所有酯连接的甘油磷i^a碱分子种类的总和。图5.血清转化之前和之后6个月间隔内的脂质分布图。(a)利用PLS/DA分析检测脂质分布的改变，(b)在血清转化(即出现第一自身抗体)之前，逸艮者中已知与炎症相关的溶血磷脂酰胆碱种类LysoGPCho(18:0)上调，(c)在血清转化之后，*者中醚连接的磷酸乙醇胺种类GPEth(38:le)上调。图6.1型糖尿病发病机制背景中研究发现的概要。图7.显示从DHAP合成胆碱缩,脂的通路。图8.年龄为1.5至5岁之间的*者中醚磷脂酰胆碱水平的变化。每个个体仅包括一个样品，在最接近1.5或5岁时抽取。(A图)。精确的脂肪酸位置(即snl与sn2)和双键位点还未确定。B图显示了ii^者和未i^者的GPCho(O-18:l/16:0)浓度的框线图(boxplot)。所述框包含中间50%的数据。所述框的上端(连接处)显示75%的数据，下连接处显示25%的数据。两个i^者和两个未ii^者的示例性纵向分布(C图)。D图列出了血清转化前9个月期间和血清转化后不久ii^者和未i^者之间溶血磷脂酰胆碱水平的变化。所选的未ii^者的时间点与配对的ii^者的那些最接近。图9.狄者和未ii^之间醚磷脂酰减GPCho(0-18/18:2)的早期差异。年龄在315至405天(l岁)的儿童的水平显示在A图中，年龄在630至810天(2岁)的儿童的水平显示在B图中，年龄在1980至2340天(6岁)的儿童的水平显示在C图中。每个个体仅包括一个样品，在最接近显示年龄时获得。D图显示了批次1的受试者的GPCho(O-18:0/18:2)的纵向分布。图10.进展者和未进展者之间乙醇胺缩醛磷脂GPEtn(O-18:l(lZ)/20:4)的早期差异。显示了年龄为315至405天(A图)和年龄为1980至2340天(B图)的儿童的缩,脂水平。优选实施方案的描述我们假设血清代谢物分布图异常可能早于发生1型糖尿病所必需的自身免疫表现途径(autoimmunityrevealingpathway)的发生。我们通过在11.5年间在超过IOO，OOO名连续新生儿中筛选遗传性糖尿病风险并招募具有遗传性糖尿病风险的儿童进行密切随访来检验该假设。在继续此研究的超过8500名儿童中，超过450名产生了多种类型的自身抗体，138名已发生明显的1型糖尿病。将从一组47名儿童中出生和糖尿病发病之间以3至12个月间隔采集的1039个血清样品的代谢物分布图与60名保持健康和自身抗体阴性的儿童的分布图进行了比较。我们观察到，在ii^者和持续自身抗体阴性的儿童之间，脐带血和后来样品中代谢物模式的显著不同。在显著早于出现儿童血清转化为自身抗体阳性的病例和对照中，抗氧化应激的代谢物和与炎症相关的代谢物明显不同。这些发现提示可将代谢组学有效地用于筛选嬰儿期和儿童早期的糖尿病风险，并表明对氧化损伤和炎症的保护不力在糖尿病的发病机制中起到重要作用。优选实施方案待用作生物标志物的血清代谢物优选为保护免受氧化应激和/或炎症的代谢物。在这种情况下，与健康儿童对照组相比，旨断儿童中其浓度降低指示儿童发生I型糖尿病的易感性。所述表述"浓度降低"应当理解为属于风险组的儿童中生物标志物的水平可以是健康对照中相同生物标志物水平的至多80%。然而，风险组中的该水平通常为对照组水平的最高75%,更通常为最高65%至最高50%。在一个优选的实施方案中，所述生物标志物为总磷脂，一种或多种酯连接的磷^喊或总的酯连接的磷^喊。在所有这些方案中，优选在新生儿中就已经测定了所述生物标志物，例如通过脐带血分析。在一个特别优选的实施方案中，所述儿童为新生儿，并将儿童总的酯连接的磷^S^的7jC平为对照组平均水平的约80。/。或更少用作儿童发生I型糖尿病的易感性的指示。在另一个优选的实施方案中，所述生物标志物为一种或多种醚连接的裤^a碱，比如(但不限于)GPCho(36:2e)、GPCho(38:le)、GPCho(38:5e)、GPCho(40:4e)、CPCho(O-18:l/16:0)、CPCho(0-18:l/16:l)、CPCho(O-16:0/20:4)、CPCho(O-18:l/20:4)或CPCho(O-18:0/18:2)。可以在年龄范围为新生儿至六岁、优选1-2岁的儿童中测定醚连接的磷i^a碱。在另一个优选的实施方案中，所述生物标志物为乙醇胺缩,脂，比如GPEtn(O-18:l(lZ)/20:4)。可以在年龄范围为新生儿至六岁的儿童中测定这一生物标志物。在又一个实施方案中，所述生物标志物是酸或其衍生物、酮或醇。作为该组中生物标志物的非限制性实例，可以提及的是色氨酸、核糖醇、戊二酸、甘氨酸、花生酸、1，2，3-丙烷三羧酸、肉豆蔻烯酸、甘露醇、肌酸酐、丁二酸、庚酸和2-酮戊二酸甲肟。在这些化合物中，色氨酸、核糖醇、戊二酸、1,2,3-丙烷三羧酸、肌酸酐烯醇和丁二酸被认为是最优选的。血清代谢物的测定可以在不同年龄的儿童中随访进行，且将结果与和待诊断儿童相同年龄的对照组进行比较。还可以测定待诊断儿童的几种血清代谢物，且将该水平与对照组所述代谢物的水平相比较。可以在一段时间中监测所有或某些所述代谢物。可以将前述一种或多种血清代谢物的监测与测定发生1型糖尿病的遗传风险和/或监测儿童中自身免疫的出现相组合。优选地，发生l型糖尿病的遗传风险和/或出现自身免疫是根据作为进行性疾病易感性检测的代谢物标志物而得出的。最优选地，测定自身抗体标志物的出现以及醚连接的磷^碱水平的降低来鉴定具有较高风险发生1型糖尿病的个体。一旦在早期诊断为属于风险组，就可以釆用许多不同的方式来预防儿童的l型糖尿病发病。预防措施可以是例如营养干预、抗氧化治疗或刺激儿童中胆碱缩醛磷脂的生化合成、或者其任意组合。作为根据我们结果的1型糖尿病的可能预防措施，是使用已知安全的营养干预，例如-向母亲补充胆碱，特别是如果父母中有任何人携带所述风险基因型。-向出生后的儿童补充胆碱，如果发现其磷i^a碱水平低。-向儿童补充胆碱缩醛磷脂，如果出生时发现其磷酸胆碱水平低或后来发现其醚连接的磷^碱水平低。作为一种可能的药物疗法，抗氧化治疗是一种选择。作为替代，刺激本发明中发现下调的内源性抗氧化剂胆碱缩醛磷脂的合成是一种可能的选择。途径显示在图7中。通过下述非限定性实^分举例说明本发明。实验部分我们使用高通量代谢组学技术来分析由我们研究的从出生至发生明显糖尿病(i^良者)的儿童所采集的系列血清样品，并将研究结果与来自对照儿童的系列研究样品获得的结果进行比较，对照儿童与研究儿童的年龄、性别、遗传风险组和出生地点相匹配，M没有显示出糖尿病相关自身免疫或糖尿病的体征(无*者)。在脐带血与在嬰儿期和儿童早期所釆集的样品中，血清脂质、水溶性化合物和与血清白蛋白结合之代谢物的模式不同，这完全改变了基于自身抗体对l型糖尿病的预测。所鉴定的代谢物和推测的途径提示防止氧化应激和炎症的因子是疾病进展的高度重要的抑制剂，这提供了用于糖尿病预防的潜在目标。受试者的选择已经在芬兰的三个城市中进行了DIPP研究计划，这三个城市每年出生率的总和为11,000，代表了芬兰几乎20%的出生率。该研究计划于1994年11月在Turku开始进行；一年后Oulu加入了该研究，三年后Tampere加入。在Turku的群体中，分析了HLA-DQB1等位基因*02、*0301、*0302、*0602和*0603，并对于DQB1*02阳性的男性进一步测定DQA1等位基因*0201和*05。将确定的PCR扩增基因序列与具有等位基因特异性、镧系元素螯合物标记的寡核苷酸探针在溶液中杂交，利用时间分辨荧光分析法(Victor，Wallac,Turku)检测杂交产物。至2006年6月6日，已经连续筛选了107,484名新生儿及其年长的兄弟姐妹，约8,000名具有遗传风险的儿童仍在随访中。我们的尝试包括对胰岛素启动子区、CTLA4和PTPN22的多态性的筛选分析，其仅稍微改善筛选效力，并具有相当差的成本效益比，这促使我们从常规筛选中放弃这些测定，尽管我们仍使用这些测定用于所选的研究目的。在研究参与者中，有1445名对胰岛细胞、胰岛素、谷氨^羧酶或IA-2蛋白具有至少一次自身抗体阳性。其中的516名具有超过一种类型的抗体，其发生糖尿病的可能性强烈增加。最后，在随访其间，有137名儿童发生明显的l型糖尿病(图la-b)。这137名儿童中大部分发生了单第一抗体IAA,其单独或者与ICA或GADA—起产生，而IA-2A则通常是晚出现的抗体。某些儿童在一岁之内快4JC生糖尿病，而具有极为类似的自身抗体类型的其它儿童则有多年没有发生明显的糖尿病(参见例如图lb)。在随访期间，自身抗体值一般变化明显，但在发生临床糖尿病之前，该值常常緩慢地下降(参见例如图lb)。从出生至疾病发病(可能在其之后)以3-6个月间隔纵向血清采集提供了对疾病发病机制和可能的早期机制的详细研究。自身抗体随时间的出现显示在图lb中。发生明显l型糖尿病的受试者选自DIPP试验，他们的HLA基因型、性别、城市和出生阶斜目匹配。选择了总共41名i^lL^和54名未ii^，总计950个样品(图lc)。为进行试验和数据分析，将样品根据出生城市进一步分成两个分开的批次Turku(13名ii^者，26名未ii^)和Oulu(28名ii^，28名未*者)。为了将从7月龄至青春期后之间的遗传确定的DIPPA^中的代谢物分析研究结果与从7月龄至青春期后之间的可获得预期采集样品系列的遗传不确定的儿童组的研究结^目比较，我们选择了在土尔库儿童冠状动脉风险因子介入专项研究计划(SpecialTurkuCoronaryRiskFactorInterventionProjectforChildren(STRIP))8中已经发生1型糖尿病的6名儿童，这六名儿童的年龄和性别与来自相同研究的健康对照(总共89个样品)相匹配。STRIP研究包括招募1062名儿童，其中超过700名年龄为1G5岁的儿童仍在该研究中。仅一些发生糖尿病的儿童携带HLA风险等位基因，但是在临床发生糖尿病之前都具有多种自身抗体。在我们的代谢组学数据研究中，我们特别关注1型糖尿病中三种类型的比较(图ld):纵向分布中的整体差异、*者和未*者之间基于年龄的比较以及与出现自身免疫相关的代谢物分布变化。脂质组学揭示了年龄作为主要的疑似因素(confoundingfactor)我们利用UPLC-MS平台对所选的所有1039个样品进行了脂质组学(lipidomics)分析。虽然数据处理产生了大量的未鉴别峰，但是数据分析限于在所有批中鉴定的186种脂质分子。为了探索数据结构和鉴定影响脂质分布的主要疑似因素，我们进行了Sammon非线性映射9，其将样品从高(例如186)维空间非线性映射至低维空间，而目的在于维持样品间的分布图(例如欧几里得)距离。与更通常使用的线性方法如主成份分析(PrincipleComponentsAnalysis)10相比，Sammon方法在从高度相互依赖的特征中提取信息的能力方面更好，并且它是一种由原始数据将分布类似性进行具体化显现的更直接方式。图2显示了OuluDIPP批次的针对四个可能因素(个体身份、性别、年龄和取样年龄)的sammon映射分析的结果。显然，无论是取样年龄还是性别都不是影响脂质分布类似性的主要因素。然而，分布图明确表现出按年龄聚类(图2c)，即早期儿童的脂质分布彼此之间比在后期它们的分布更类似。由于饮食随年龄改变且通常在早龄时较一致，以及由于儿童的发育其代谢有显著的变化，这是可以预期的。有趣地是，还可以检测到个体间的差异(图2d)。在自身免疫之前i^!L者和未ii^之间早期血清脂质组(lipodome)差异为了检查早期疾病预测的可行性，我们利用部分最小二乘法判别分析12对特定年龄组进行了多变量横断面分析(cross-sectionalanalysis)。针对所分析的三批，独立地开发了PLS/DA模型。我们发现，在已经一岁的ii^者和未i^者之间存在着明显差异，并且这些差异是由所有三批中相同或相关的分子种类所引起的。我们还基于VIP分析，使用针对DIPPTurku批次所开发的模型来选择最重要的脂质分子种类。基于所选择的脂质种类，开发了新的PLS/DA模型并将其用于其它两个批次，我们发现它能正确地预测糖尿病的发病。我们的结果表明，所述脂质组学策略(可能与之前的遗传筛选相组合)可以对儿童将随后发生自身免疫和明显1型糖尿病的确定进行显著提前并改善所述确定的准确性。病例和对照之间缩,脂分子种类的一致性差异在血清脂质分布中发现的早期差异表明疾病相关事件出现得比以前所认为的要更早。为了检查个体内脂质水平随时间的变化以及由此测定血清脂质组中所观察到的一致性变化，我们研究了每种所鉴定的脂质分子种类的纵向分布。值得注意的是，我们发现后来发生自身免疫和明显l型糖尿病的儿童中多种胆碱缩醛磷脂分子种类的水平在早期时(即在明显发生自身免疫体征之前)已降低(图3)。该差异持续到所有年龄段，缩醛磷脂水平似乎不受疾病本身出现(i^者的最后时间点)的影响。缩醛磷脂是一种醚连接的磷脂的亚类，先前已提示其参与抵抗氧化损伤13-15。已提出活性氧物质(ROS)在p-细胞破坏中起重要作用，并且已显示出将胰岛暴露于细胞因子增加了ROS生成，并引起|3细胞的氧化损伤16。p细胞对氧化损伤特别敏感，因为它们包含低水平的抗氧化酶17。抗氧化治疗被提议作为一种预防糖尿病的可能策略18，M今为止结果比较混乱19。我们的结^明，抵抗氧化损伤的能力在l型糖尿病发病机制中起重要作用，Mros生成本身没有作用。已知缩,脂合成的最后几部分位于内质网(er)中2°。来自体内研究的可靠证据表明，er应激在疾病发病机制中起重要作用。脐带血分析揭示后来发生糖尿病的儿童中磷J^S碱7jC平降低脂质表型的早期差异提出了后来发生糖尿病的儿童的代谢表型的可能性。为了该目的，我们检查了39名儿童的胯带血样品，其中15名后来直到12岁或更早发生1型糖尿病。这些儿童出生在Turku，但与前述分析中所研究的并不相同。所述多变量分析鉴定了影响样品分组的两个主要因素(图4)。三酰基甘油水平的升高影响了i^者和未ii^者。然而，似乎区别两组中大部分样品的另一个主要因素是磷脂水平的变化(图4a和4b)。发现在早期i^者中已经下调的缩醛磷脂种类GPCho(36:2e)在各组之间没有显著差别(图4c)。然而，*者中总的酯连接的磷^喊(血清中最大量的磷脂种类)水平在出生时已经显著下调(图4d)。血清转化我们还研究了所观察到的脂质分布变化是否与自身免疫的出现有关。为了该目的，我们比较了血清转化之前6个月期间内和血清转化后即刻的血清脂质分布。如图3中所示，*者的胆碱缩,脂水平不随自身免疫的出现而改变。在*者中，血清转化之前的主要因素是溶血磷脂酰胆碱上调(图5)。溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)与炎症相关21，因此，表明存在着在自身免疫之前导致炎症的事件。重要地是，已经表明LysoPC增强细胞因子的产生22。LysoPC的特异性上调是瞬时的；其仅在短期内出现。血清转化后的变化主要是乙醇胺缩醛磷脂水平的增加(图5)。il^明这些醚连，脂的增加是针对氧化损伤增加的正常系统反应。总之，后来发生1型糖尿病的儿童的纵向血清脂质分布揭示出导致自身免疫和疾病的几个后续事件(图6)，表明了磷脂代谢在早期疾病发病机制中的关键作用。所显露的对于疾病发病机制的描述揭示了致病因素和代偿性反应之间的复杂相互作用。在早期时预测1型糖尿病的可行性所观察到的脂质组变化表明在血清转化之前利用代谢分布分析来预测疾病可能是可行的。因此，基于从60%的^^者和未*者中随机选择之亚组的扩展脂质分布开发了分类算法。基于已知的纵向分布变化和没有观察到疑似因素的依赖性，仅醚磷脂被认为是可能的生物标志物。在早期时观察到了的最好的疾病预测，在1.5岁龄(范围0.5-2.5岁)的最佳生物标志物包括GPCho(O-18:l/16:0)分子种类(表1)。对于*者的分类规则包括脂质浓度低于4.09jimo!/L的必要*。通过检验那些试验结果显示出与1型糖尿病发病无关的零假设来评价分类模型(classifier)的性能。为了控制偏差，对试验组和训练组随机选择1000次。对于每种选择，在训练组上确定脂质特异性分类阈值，并在试验组中评价分类的准确性。如果使用了对应于零假设的随机分类模型(TP=FP),则使用二项式分布来精确计算与获得至少真阳性(TP)的观察值或至多假阳性(FP)的观察值的概率相对应的P-值。报告了各变量的概要统计量(summarystatistics)、中间值和80%置信区间。表1.由单一醚磷脂酰胆碱GPCho(O-18:l/16:0)组成的分类模型的性能。如果醚裤脂酰胆碱的浓度低于4.1nmol/L，卯％CI=[4.0[imol/L，4.7Hmol/L]，则将受试者归类为*者。从所述分析中排除自身抗体阳性样品。TP，真阳性数；P,阳性(即*者)数；P(TP)，真阳性数偶然大于的TP的概率；FP，假阳性数；N，阴性(即未i^者)数；P(FP),假阳性的概率数小于偶然的FP。基于对试验组和训练组的1000次随机选择的针对TP、FP和Odds比(比值比)的卯％置信区间显示在括号中。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>方法血清采集。在1994-2004年期间从儿童采集静脉血样。在非禁食的全天中的多个时间釆集样品。4吏用针和BDVacutainer⑧PlasticTubes或Vacutainer⑧PlusPlasticTubes通过静脉抽取采集血样。(BDVacutainerSSTTubes包含用于血清分离的喷雾涂覆的二氧化硅和聚合物凝胶。)将所述管置于室温下30-60分钟使凝集。通过在室温下以1300rcf离心10分钟分离血清。将血清样品贮存在-80。C的小塑料管中。脂质组学。将等分试样(IOnl)的包含11个脂质类型的内标混合物和0.05M的氯化钠(IOfil)加入到血清样品(10jil)中，并用氯仿/甲醇(2:l，100jil)萃取所述脂质。在涡旋(2分钟)后，静置(1小时)并离心(10000RPM,3分钟)，分离下层，向萃取物中加入包含3种带标记之标准脂质的标准混合物(IOjil)。所述内标混合物包含下述脂质化合物(ng/ml)与十七酸(C17:0)作为酯化的脂肪酸D-赤式-鞘氨醇-l-磷酸酯(9.3ng/ml;C17Base,AvantiPolarLipids),l-十七烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷^JS碱(8.8jig/ml;AvantiPolarLipids),1-十七烷酸单甘油酯(//v渗凌伴)(9.3pg/ml;LarodanFineChemicals),1,2-双十七烷酰基-sn-甘油基-3-[磷酸-mc-(l-甘油)(9.6ng/ml;AvantiPolarLipids),N画十七烷^^-D-赤式-鞘氨醇(9.2ng/ml;AvantiPolarLipids),1,2醒双十七烷酰基-sn-甘油基-3-[砩酸-L-丝氨酸(8.6jig/ml;AvantiPolarLipids),1,2画双十七烷酰基國sn國甘油基画3画磷酸胆碱(9.9ng/ml;AvantiPolarUpids),1,2-双十七烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(8.5ng/ml;AvantiPolarLipids),1，2-双十七烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(8.9fig/ml;AvantiPolarLipids),1，2-十七烷酸甘油二酯(//v^凌谬)(10.2jig/ml;LarodanFineChemicals)和十七烷^_甘油三酯(10.4ng/ml;LarodanFineChemicals)。所述带标记的标准混合物由以下化合物组成L-a-溶血磷脂酰胆碱-棕榈酰基-D3(9.3照/ml;LarodanFineChemicals),1,2-二棕榈酰基-D6-sn-甘油裤脂酰胆碱(11.7照/ml;LarodanFineChemicals)和甘油三棕榈酸酯-l，l,l-"C3(10.0fig/ml;LarodanFineChemicals)。当分析第一批232个样品(批次1)时，在用氯仿/甲醇(2:l，100nl)萃取脂质之前，仅将包含十七烷酸甘油三酯(0.804mg/ml;LarodanFineChemicals)和1,2-双十五烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(0.304mg/ml;LarodanFineChemicals)的一种标准混合物(25^1)加入到血清样品(15pi)中。用WatersQ-TofPremier质i^R与AcquityUltraPerformanceLCTM(UPLC)联合分析脂质萃取物。柱为具有1.7nm颗粒的AcquityUPLCTMBEHC1810x50mm，其保持在50。C下。所述二元溶剂系统包括A.7JC(1%的1MNH4Ac，0.1%HCOOH)和B.LC/MS级(Rathburn)乙腈/异丙醇(5:2,1%的1MNH4Ac,0.1%HCOOH)。梯度从65%A/35%B开始，在6分钟内达到100y。B,并在该梯度保持7分钟。包括5分钟再平衡步骤在内的总运行时间为18分钟。流速为0.200ml/分钟，注射量为0.75fil。样品组织器(sampleorganizer)的温度设定在10。C。通过Q-TofPremier质镨仪利用ESI+模式进行脂质分布分析。釆集m/z为300-1200质量范围内的数据，扫描持续时间为0.2秒。对于最后的样品而言，扫描时间改变为0.02秒。将源温度设定在120'C,使用250。C的氮气作为去溶剂气体(800L/h)。釆样锥(samplingcone)和毛细管的电压分别为39V和3.2kV。使用利血平(50ng/L)作为锁定喷雾(lockspray)参考化合物(5n!/分钟；扫描频率为10秒)。使用串联质镨法来鉴定所选脂质的分子种类。通过使用ESI+模式进行MS/MS运行，碰撞能梯度范围(collisionenergyramp)为15至30V，质量范围从m/zl50开始。其它条件如上所示。代谢物组学数据的处理和分析使用MZmine软件(版本0.60)23'24处理数据。使用内部光i普库鉴定代谢物。使用部分最小二乘法判别分析(PLS/DA)12，25作为监督建模方法，该建模方法使用SIMPLS算法来计算模型26。使用Venetian盲式交叉验证法(blindscross-validationmethod)27和得分来开发所述模型。报告了与药物特异性作用相关的潜在变量的最高载荷(Toploadings).计算VIP(研究计划中变量的重要性)值来鉴定用于具体组的聚类的最重要分子种类。使用Matlab(版本7.2,Mathworks,Inc.)和PLSToolbox(版本4.0，Matlab程序包，EigenvectorResearch,Inc.)进4亍多变量分才斤。在脐带血中发现的其它血清代谢物(即非磷脂)方法如下制备血清样品将400nl甲醇和10的250ppmd3-棕榈酸(内标准)加入到25fil血清样品中。涡旋该样品30秒。在30分钟后，以10000rpm离心该样品3分钟。将上清液转移到GC瓶中并在氮气下蒸干。用20HiMOX(45。C，60分钟)和20nlMSTFA(455。C，60分钟M吏才羊品珪烷化。将5nl保留指数溶液加入到样品中(600ppm的Cll、C15、C17、C21和C25烷烃)。仪器使用的仪器为LecoPegasus4DGCxGC-TOF质谱仪，具有Agilent68卯NGC和CombiPAL自动进样器。仪器^^lt如下对于血清样品，按1:20以每次2ji1分流注射。第一个柱RTX画5，10mxl80nmx0.20jim第二个柱BPX國50，1.10mxl00nmx0.10nm氦气35.33psig，恒压温度程序第一柱箱初始50。C，l分钟。->280。C，7。C/分钟，5分钟。第二柱箱高于第一柱箱温度+10。C。第二维分离时间4s。MS测量40-700amu，100镨/s。方法特征用三种纯的、非萃取的参考化合物试验GCxGC-TOF的性能特征。将所有化合物制成10至30000ng/样品的八个浓度水平。L-苏氨酸线性范围7.4-2200ng相关系数(在线性范围内)0.99975相对标准偏差(8个样品，7440ng):7.60%在最低浓度7.4ng时的S/N:56.6月桂酸线性范围10-30000ng相关系数0.99737相对标准偏差(7个样品，10100ng):2.61%在最低浓度10.1ng时的S/N:115.3胆固醇线性范围:10-30000ng相关系数0.99999相对标准偏差(7个样品，10000ng)::2.89%在最低浓度10.0ng时的S/N:62.7数据处理使用ChromaTof软件进行样品内数据处理，将自己开发的软件用于校准和峰匹配样品。基于在36个样品的总分布中所检测的峰的数目(设定最少找到12个峰值)和基于数据库的同一性配对(相似性指标阈值=800)过滤峰值。结果结果显示在下表2中。倍数(中间值)列显示发生1型糖尿病的儿童代谢物水平的中间值与随访期间保持自身抗体阴性的儿童(未#者)代谢物的中间值之比。p(Wilcoxon);OL于比较两组的Wilcoxon秩和检验的p值。倍数(平均值)列显示发生1型糖尿病的儿童代谢物水平的平均值与随访期间保持自身抗体阴性的儿童(未ii^)的平均值之比。p(t检验)是基于比较两组的双侧t-检验的p值。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>应当理解，可以以多种实施方案的形式引入本发明的方法，本文中仅公开了其中的少数。显然，对本领域技术人员而言，存在其它实施方案而不背离本发明的精神。因此，所述实施方案是示例性的，而不应当看作是限定性的。参考文献1.Kupila,A.etal.FeasibilityofgeneticandimmunologicalpredictionofTypeIdiabetesinapopulation-basedbirthcohort.D/flAeto/ogiVi44，2卯画297(2001)。2.Oresic,M.，Vidal國Puig,A.&Hanninen,V.Metabolomicapproachestophenotypecharacterizationandapplicationstocomplexdiseases.五x/7eWWev.A^/.D/fl^f.6,575-585(2006)。3.Clayton,A.T.etal.Pharmaco-metabonomicphenotypingandpersonalizeddrugtreatment.7Vfl似/r440,1073-1077(2006)。4.Robosky，LC.etal.MetabonomicidentificationoftwodistinctphenotypesinSprague國Dawley(Crl:CD(SD))rats.Tim'co/.5W.87,277-284(2005)。5.Knip,M.etal.EnvironmentaltriggersanddeterminantsofType1Diabetes.D/a^te54，S125-136(2005)。6.Raamsdonk,L.M.etal.Afunctionalgenomicsstrategythatusesmetabolomedatatorevealthephenotypeofsilentmutations.池A说Vtec/mo/.19,45-50(2001)。7.Oresic,M.etal.Phenotypecharacterizationusingintegratedgenetranscript,proteinandmetaboliteprofiling.必/o/w/o簡flfc13,205-217(2004)。8.Simell，O.etal.SpecialTurkuCoronaryRiskFactorInterventionProjectforBabies(STRIP)./CY/"7Vw^72，1316S-1331(2000)。9.SammonJr"J.W.Anonlinearmappingfordatastructureanalysis.7>朋&CVwi/;.C-18,401-409(1969)。10.Jackson,J.Epsilon.f/sw'sgu,Vfeto/7nVi"》fl/c麵/wwewto(JohnWiley&Sons,NewYork,NY,1991)。11.DeBacker,S.，Naud,A.&Scheunders,P.Non-lineardimensionalityreductiontechniquesforunsupervisedfeatureextraction.le汰19,711-720(1998)。12.Barker,M.&Rayens,W.Partialleastsquaresfordiscrimination./.Ore附6wi掛/cs117,166-173(2003)。13.Engelma叫B.Plasmalogens:targetsforoxidantsandmajorlipophilicantioxidants.所oc/re挑.5VcT)wfs1.32,147-150(2004)。14.Zoeller,R.A.etal.Plasmalogensasendogenousantioxidants:somaticcellmutantsrevealtheimportanceofthevinylether.所oc&附/338，769-776(1999)。15.Zoeller,R.A.etal.Increasingplasmalogenlevelsprotectshumanendothelialcellsduringhypoxia,j附/尸/r戸V/Z/^W0>cPA戸V/283,H671-679(2002)。16.Tabatabaie,T"Vasquez-Weldon,A.，Moore,D.R.&Kotake,Y.FreeradicalsandthepathogenesisofType1Diabetes:{beta}-cellcytokine-mediatedfreeradicalgenerationviacyclooxygenase-2.i)/fl6W^52,1994-1999(2003)。17.Lenzen，S.，Drinkgern,J.&Tiedge,M.Lowantioxidantenzymegeneexpressioninpancreaticisletscomparedwithvariousothermousetissues./^^Wflflf/o.AT^/.20,463-466(1996)。18.Piganelli,J.D.etal.Ametalloporphyrin-basedsuperoxidedismutasemimicinhibitsadoptivetransferofautoimmunediabetesbyadiabetogenicT-cdlclone.Z)/"6故s51,347-355(2002)。19.Li，X.，Chen,H.&Epstein,P.N.MetallothioneinandcatalasesensitizetodiabetesinNonobeseDiabeticMice:Reactiveoxygenspeciesmayhaveaprotectiveroleinpancreatic{beta}-cells.Z)/"6efes55,1592-1604(2006)。20.Nagan,N.&Zoeller，R.A.Plasmalogens:biosynthesisandfunctions.iV^.h》iW及^.40,199-229(2001)。21.Murphy,A.A.，Santanam,N.,Morales,A.J.&Parthasarathy,S.Lysophosphatidylcholine,achemotacticfactorformonocytes/T-lymphocytesiselevatedi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