专利名称:糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片及其制备、检测方法
技术领域：
本发明涉及生物医学研究及临床应用领域，具体涉及糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片及其制备、检测方法。
背景技术：
糖尿病是目前危害人类健康与生活质量最严重的疾病之一，它以血糖浓度持续性增高为主要症状表现，通过多种严重并发症而危害健康。据国际糖尿病联盟(KDF)对全球糖尿病的发病现状及世界卫生组织(WHO)对糖尿病发病情况作出的最新预测指出，目前全球已诊断出II型糖尿病患者达1.3亿人，我国超过4000万人。预计到2025年，全球糖尿病患者将突破3亿，我国糖尿病患者总数接近1亿。在我国，随着经济生活水平的提高和饮食结构的改变，糖尿病患者人群正迅速发展，预防和治疗糖尿病已成为我国重大社会课题。
糖尿病依病因可分为两类，I型和II型，这两种类型的糖尿病起因不同、对患者的危害以及治疗方法都截然不同。早在80年代，就有人观察到一部分临床诊断为II型糖尿病患者在血液中可检出特异性的胰岛细胞自身抗体，这类患者易出现继发性的口服降糖药治疗失效，必须依赖胰岛素治疗。随后的大量研究表明，这类患者实际属于I型糖尿病中的免疫中介亚型，为一种起病晚的成人隐匿性I型糖尿病(LADA)，起病原因为自身免疫紊乱。但由于这类病人的临床表现与II型糖尿病很难鉴别，绝大多数医院又无相关抗体的检测手段，通常都诊断为II型糖尿病，从而使用不适当的II型糖尿病治疗方法，延误病情，导致患者健康乃至生命的损失。
在1999年，世界卫生组织(WHO)专家评议报告“糖尿病及其并发症的定义、诊断和分型”第一部分中提出了糖尿病新分型。其中，I型糖尿病被分为免疫中介型和特发型两个亚型，并指出，确诊免疫中介I型糖尿病，主要依赖在糖尿病患者中检出针对胰岛β细胞各种抗原的自身免疫抗体。人们目前已发现了多种与糖尿病相关的自身免疫抗体，其中最重要的自身免疫抗体包括胰岛细胞自身抗体(ICAs)；谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)；蛋白酪氨酸磷酸酶样跨膜蛋白抗体(ICA512/IA-2)；胰岛素抗体(IAA)。因胰岛细胞自身抗体的出现远早于临床症状，在I型糖尿病临床的前期，多种自身抗体在外周血就可检测出，其最远时间可达8年，可及时预测未来I型糖尿病发生。对这类患者如采取相应治疗措施，会大大延缓发病时间，甚至最终改变疾病的预后。
糖尿病自身免疫抗体在检测中由于出现情况、时间和强度并不一致，而且各种自身免疫抗体单一检出率都不超过80％，所以，任何单一的检测都很可能造成实际患者的漏诊。因此，糖尿病自身免疫抗体必须联合检测，在临床上才可用于分型确诊，进而影响治疗和患者预后的重要实用价值。目前常规的糖尿病诊断仍是以临床症状结合血糖浓度和口服糖耐量实验等相对实验室指标来诊断，它已不适合进行分型确诊，同时因其自身原因常会受到各种因素的干扰，有时会产生波动较大的检测结果，也就是说检测结果不稳定。另外已有人尝试采用特异性的血清免疫学方法来辅助分型诊断，但一般都是针对每种自身免疫抗体进行单独检测，因此检测成本高，一般患者难以采用，同时也难以作为体检筛查的手段，不能提供适应目前糖尿病患者增加所需要的相应的高通量标准化检测手段。
发明内容
本发明要解决现有糖尿病临床分型确诊不准确和检测成本高的问题。
为解决现有的问题，本发明的解决方案是提供一种糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，包括外壳1和检测微阵列3，其特殊之处在于，所述外壳1是上表面设置有多个反应池2的玻璃薄片，反应池内均设置有一个检测微阵列3，每个检测微阵列3分别由四种同一规格大小的微型固相检测片组成，所述的微型固相检测片分别是胰岛细胞微型固相检测片4、重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片5、重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片6和重组人胰岛素蛋白微型固相检测片7。
上述微型固相检测片大小在0.1mm2～9mm2之间。
上述玻璃薄片规格为22mm×75mm，厚度1mm～3mm，其上表面设置有3～200个反应池2，所述反应池2是边长为0.2mm～18mm的正方形。
上述反应池2容量为10μl～100μl。
上述胰岛细胞微型固相检测片4上包含有约1×103～1×106个胰岛细胞；所述每个蛋白微型固相检测片上包含有2个～10个相应的蛋白点样点。
一种上述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片的制备方法如下首先准备微型固相检测片，本发明中的微型固相检测片，根据其上的检测基质种类不同分为胰岛细胞微型固相检测片、重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片、重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片和重组人胰岛素蛋白微型固相检测片；这四个微型固相检测片的制备中，检测片采用经硅化处理的玻璃盖玻片或透明聚苯乙烯盖玻片或醋酸纤维膜，其中胰岛细胞微型固相检测片4的制备采用细胞体外培养技术结合细胞爬片技术，另外三种蛋白微型固相检测片的制备方法是依次包括将蛋白与磷酸盐缓冲液混合后调节蛋白溶液的浓度；将蛋白溶液再加入40％的甘油，混匀；采用市售的DNA微阵列仪点样仪在基质平面上点样；点样后孵育3小时；用牛血清白蛋白溶液封闭，使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片；然后进行组装①选用表面上设有3～200个反应池的玻璃薄片，每个反应池均为边长是0.2mm～18mm的正方形，容量10μl～100μl；②在反应池内设置有一个检测微阵列，由四个同一规格大小的不同种类的微型固相检测片排列并以透明黏合剂黏附固定于其内制成。
上述微型固相检测片的制备方案是①胰岛细胞微型固相检测片的制备首先选取对胰岛细胞自身抗体抗体敏感的体外培养细胞，所述的对胰岛细胞自身抗体抗体敏感的体外培养细胞包括胰岛细胞瘤手术切除组织培养的胰岛β细胞瘤细胞，以及哺乳动物胰腺组织内胰岛细胞；然后进行检测基质的培养培养方法是先参照胰岛细胞体外培养法进行原代培养，再在传代后使贴壁的单层培养细胞生长于检测片的表面，待细胞生长贴附整个检测片表面超过50％后，取出检测片，放入磷酸盐缓冲液洗涤，再于检测片表面滴加固定液固定30min，固定后浸入磷酸盐缓冲液-甘油混合液置于-20℃储存，使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片；②重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片的制备中，点样试剂采用美国sigma公司纯化重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白，磷酸盐缓冲液稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片，每个微型检测片含有2个～10个蛋白点样点；
③重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片的制备中，试剂采用美国sigma公司重组纯化重组人胰岛细胞抗原512蛋白β-亚型，磷酸盐缓冲液稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片，每个微型检测片含有2个～10个蛋白点样点；④微型重组人胰岛素蛋白固相检测片的制备中，试剂采用美国sigma公司合成人胰岛素蛋白，磷酸盐缓冲液稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片，每个微型检测片含有2个～10个蛋白点样点；①、②、③和④中所述检测片可采用经硅化处理(APES)的玻璃盖玻片或市售的透明聚苯乙烯盖玻片。
上述制备方法还包括包装步骤，将芯片表面用锡箔纸包裹，再密封包装。
芯片储存于-20℃条件下，运输时置于不高于4℃的恒温容器内。
一种上述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片的检测方法如下先采用间接荧光法检测，检测结果再以生物芯片激光共聚焦扫描仪扫描判定，也可以采用其他种类的微阵列扫描仪扫描实验检测结果，通过软件或专业人士进行判读；也可使用普通荧光显微镜直接观察，由专业人士对实验结果进行判定。以上所述反应池中的任意两个作为质控反应池，其余均为检测反应池。
上述间接荧光法中，首先进行预处理①将芯片取出后，室温放置5min，打开包装；②在每个反应池加入50μl磷酸盐缓冲液，放入37℃水浴中孵育15min；③滴加1％牛血清白蛋白50μl室温下封闭20min；然后对检测反应池的进行检测，操作步骤是①将一份患者待测血清以1∶5用磷酸盐缓冲液稀释，直接滴加于一个检测反应池表面，37℃孵育1h；②磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5min；
③加入荧光标记的鼠抗人IgG单克隆抗体，37℃孵育1h；④含1％吐温的磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次10min；⑤滴加封裱剂封片；对质控微阵列反应池的进行检测，操作步骤是与上述对检测反应池的检测同步进行，仅将对检测反应池的检测操作步骤中所用患者待测血清换为阳性对照检测液或阴性对照检测液，其余步骤相同；阳性对照检测液是将健康成人血清，经1500转离心10min，将纯化的人谷氨酸脱羧酶自身抗体、人胰岛细胞抗原512蛋白自身抗体、人胰岛素蛋白自身抗体单克隆抗体各5u或相当于此量的浓缩溶液溶于健康成人血清制备而成；阴性对照检测液是将健康成人血清，经1500转离心10min，取上清液制备而成。
与现有技术相比，本发明具有下述优点①利用当前最新的蛋白芯片和细胞芯片技术，通过血清中糖尿病自身免疫抗体存在与否或其含量多少，为免疫中介性糖尿病患者的分型鉴别提供重要依据，也可广泛用于糖尿病高危人群中I型糖尿病临床前期和发病早期的预测，因此具有重要的临床实用价值。
②高通量。使用一张检测芯片可同时检测数位至数十位患者血清，一次提供每份血清中三种糖尿病自身免疫抗体的相关信息，非常适合在人群中进行大批量筛查诊断使用。
③检测成本低廉，经济性强。一张芯片可检测数位至数十位患者血清，每份血清四种糖尿病诊断标志物，相当于常规数百次实验的结果；但所需检测试剂用量仅相当于常规检测的试剂用量的1/20～1/50，可大大降低检测成本，具有非常强的经济性，易普及。
④特异性强、灵敏度高。以纯化蛋白为检测底物，避免了常规检测中的干扰，保证了高度的检测特异性，有效的避免了假阳性和假阴性的检测结果的产生。同时采用最新固相检测芯片制作工艺，保证了其检测的高灵敏度。
⑤稳定的质量控制。高度纯化的抗原蛋白保证了抗原质量的稳定，减小批间批内差异，从而有效的实现检测标准化，降低检测结果的波动。同时每张芯片都具有独立的质控微阵列，保证了每张芯片质量的可靠性。
⑥检测结果准确可靠。芯片采用间接荧光法检测，检测结果以生物芯片专用激光共聚焦扫描仪扫描后通过智能化的分析软件判定，消除了通常实验室检测人为判定结果可能造成失误的因素。
⑦通过细胞芯片技术，可对以往较难检测的胰岛细胞自身抗体胰岛细胞自身抗体进行精确的检测。相对于传统胰岛细胞自身抗体检测的冰冻切片免疫组化法，具有高检测灵敏度、无背景干扰、批间差异小、质量可靠，操作简便等多种优点，可以完全取代以往的检测法。
图1是芯片的表面结构示意图；图2是单个检测反应池的结构示意图。
附图标记说明如下1-外壳，2-反应池，3-检测微阵列，4-胰岛细胞微型固相检测片，5-重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片，6-重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片，7-重组人胰岛素蛋白微型固相检测片。
具体实施方式
本发明涉及糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片、其制备及检测方法，主要用于检测糖尿病辅助诊断上的四个重要指标胰岛细胞自身抗体、人谷氨酸脱羧酶自身抗体、人胰岛细胞抗原512蛋白自身抗体和人胰岛素蛋白自身抗体。以下将通过实施例对本发明作进一步说明，但不应理解为保护范围仅限于下述
(一)一种糖尿病自身免疫抗体检测蛋白芯片，包括外壳1和检测微阵列3，所述外壳1是规格为22mm×75mm，厚度是1mm的玻璃薄片，所述玻璃薄片上表面设置有78个反应池2，所述反应池2是表面边长为2.5mm，底边2.0mm，深0.5mm的倒置台形。在每个反应池2内均设置有一个检测微阵列3，检测微阵列3由四个面积是1mm2、方形的微型固相检测片组成它们分别是胰岛细胞微型固相检测片4、重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片5、重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片6和重组人胰岛素蛋白微型固相检测片7。每个细胞微型固相检测片内包含有1×105个单层贴壁人胚胎胰岛β细胞，所说的每个微型固相检测片上包含有6个蛋白点样点。
(二)一种糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片的制备方法如下首先准备微型固相检测片，所说的微型固相检测片根据其上的蛋白种类不同分为胰岛细胞微型固相检测片、重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片、重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片和重组人胰岛素蛋白微型固相检测片。
①胰岛细胞微型固相检测片的制备检测基质是胰岛细胞瘤手术切除组织培养的胰岛β细胞瘤细胞，通过胰岛细胞体外培养法进行原代培养，传代后使贴壁的单层培养细胞生长于检测片的表面，此例中检测片采用经硅化处理(APES)的玻璃盖玻片，待细胞贴附生长占整个检测片表面50％后，取出检测片，放入磷酸盐缓冲液洗涤，再于检测片表面滴加4％多聚甲醛的固定液固定30min，固定后浸入磷酸盐缓冲液-甘油混合液置于-20℃储存，磷酸盐缓冲液-甘油混合液的比例为1∶1，PH7.4，使用时切割为1mm2的矩形微型检测片，每个细胞微型固相检测片内包含有1×105个单层贴壁人胚胎胰岛β细胞。固定液也可以是含1％冰醋酸的95％的乙醇溶液。
②重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片的制备中，检测片采用透明聚苯乙烯盖玻片，厚度0.1mm，点样试剂采用美国sigma公司纯化重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白，磷酸盐缓冲液稀释，PH7.5，终浓度100μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度600点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封闭，-20℃储存。使用时切割为1mm2的矩形微型检测片，每个微型检测片含有6个蛋白点样点。
③重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片的制备中，检测片采用透明聚苯乙烯盖玻片，厚度0.1mm，试剂采用美国sigma公司重组纯化重组人胰岛细胞抗原512蛋白β-亚型，磷酸盐缓冲液稀释，pH7.5，终浓度100μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度600点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封闭，-20℃储存。使用时切割为1mm2的矩形微型检测片，每个微型检测片含有6个蛋白点样点。
④重组人胰岛素蛋白微型固相检测片的制备中，检测片采用透明聚苯乙烯盖玻片，厚度0.1mm，试剂采用美国sigma公司合成人胰岛素蛋白，磷酸盐缓冲液稀释，pH7.5，终浓度范围在100μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在600点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封闭，-20℃储存。使用时切割为1mm2的矩形微型检测片，每个微型检测片含有6个蛋白点样点。
然后进行组装，①选用含78个反应池的玻璃薄片，所说的反应池是表面边长为2.5mm，底边2.0mm，深0.5mm的倒置台形；②将四种同一大小的不同种类的微型蛋白检测片排列并以透明黏合剂黏附固定于其内，制成芯片。
最后还包括包装步骤，将芯片表面用锡箔纸包裹，再密封包装，储存于-20℃条件下，运输时置于不高于4℃的恒温容器内。
(三)一种糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片的检测方法如下首先进行间接荧光法检测，上面所说的78个反应池中的任意两个指定为质控反应池，其余76个是检测反应池。
第一步检测前准备①将芯片取出后，室温放置5min，打开包装；②在每个反应池，即78个反应池中均加入50μl磷酸盐缓冲液，放入37℃水浴中孵育15min；③滴加1％牛血清白蛋白50μl室温下封闭20min。
第二步对检测反应池的检测操作步骤是①将一份患者待测血清以1∶5用磷酸盐缓冲液稀释，直接滴加于一个反应池表面，37℃孵育1h，该芯片上的76个可用于76份血清的检测；②磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5min；③加入荧光标记的鼠抗人IgG单克隆抗体，37℃孵育1h，所说的荧光标记可选用市售FITC标记；④含1％吐温的磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次10min；⑤滴加封裱剂封片，所说的封裱剂是甘油与0.5％磷酸盐缓冲液以1∶1混合制备的，PH7.4。
第三步与第二步同步操作，对质控反应池的检测操作步骤是仅将操作步骤中所用患者待测血清换为阳性对照检测液或阴性对照检测液，其余步骤相同。所说的阳性对照检测液按下述方式制备健康成人血清，1500转离心10min，将纯化的人谷氨酸脱羧酶自身抗体、人胰岛细胞抗原512蛋白自身抗体、人胰岛素蛋白自身抗体单克隆抗体各5u溶于160JDF单位的胰岛细胞自身抗体阳性血清(通过国际青少年糖尿病基金会标准血清定标)制成；所说的阴性对照检测液按下述方式制备健康成人血清，1500转离心10min，取上清液制成。
然后以生物芯片激光共聚焦扫描仪扫描，观察结果。
(四)针对本发明的芯片，本发明提供以下的结果判定标准。本例中选用ScanArray共聚焦微阵列扫描仪扫描后观察结果。
本标准以一个检测反应池的检测结果为例，实际检测结果判定中其他检测微阵列判定方法相同①当胰岛细胞微型固相检测片上的细胞在实验后平均荧光强度与阴性质控微阵列中胰岛细胞微型检测片上的细胞在实验后平均荧光强度比值超过20∶1时，则ICA检测阳性，否则为阴性，②当重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片上蛋白点样点的平均荧光强度与阴性质控微阵列中重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片上蛋白点样点的平均荧光强度比值超过50∶1时，则人谷氨酸脱羧酶自身抗体检测阳性，否则为阴性；③当重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片上蛋白点样点的平均荧光强度与阴性质控微阵列中重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片上蛋白点样点的平均荧光强度比值超过50∶1时，则人胰岛细胞抗原512蛋白自身抗体检测阳性，否则为阴性；④当重组人胰岛素蛋白微型固相检测片上蛋白点样点的平均荧光强度与阴性质控微阵列中重组人胰岛素蛋白微型固相检测片上蛋白点样点的平均荧光强度比值超过50∶1时，则人胰岛素蛋白自身抗体检测阳性，否则为阴性。
本发明的芯片上附带两个额外的质控反应池，可对芯片的质量进行检测。结果判定标准是如果阳性质控微阵列微型细胞检测片中细胞平均荧光强度与背景荧光强度的比值高于20∶1，每个微型蛋白检测片上蛋白点样点的平均荧光强度与背景荧光强度的比值高于50∶1；同时阴性质控微阵列微型细胞检测片中细胞平均荧光强度与背景荧光强度的比值低于20∶1，每个检测片上蛋白点样点的平均荧光强度与背景荧光强度的比值低于50∶1表明则表明此芯片质量良好，本次检测结果有效。
权利要求
1.一种糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，包括外壳(1)和检测微阵列(3)，其特征在于所述外壳(1)是上表面设置有多个反应池(2)的玻璃薄片，反应池内均设置有一个检测微阵列(3)，每个检测微阵列(3)分别由四种同一规格大小的微型固相检测片组成，所述的微型固相检测片分别是胰岛细胞微型固相检测片(4)、重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片(5)、重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片(6)和重组人胰岛素蛋白微型固相检测片(7)。
2.如权利要求
1所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，其特征在于所述微型固相检测片大小在0.1mm2～9mm2之间。
3.如权利要求
1或2所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，其特征在于所述玻璃薄片规格为22mm×75mm，厚度1mm～3mm，其上表面设置有3～200个反应池(2)，所述反应池(2)是边长为0.2mm～18mm的正方形。
4.如权利要求
3所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，其特征在于所述反应池(2)容量为10μl～100μl。
5.如权利要求
4所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，其特征在于所述胰岛细胞微型固相检测片(4)上包含有约1×103～1×106个胰岛细胞；所述每个蛋白微型固相检测片上包含有2个～10个相应的蛋白点样点。
6.一种如权利要求
1所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片的制备方法，其特征在于首先准备微型固相检测片，本发明中的微型固相检测片，根据其上的检测基质种类不同分为胰岛细胞微型固相检测片、重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片、重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片和重组人胰岛素蛋白微型固相检测片；这四个微型固相检测片的制备中，检测片采用经硅化处理的玻璃盖玻片或透明聚苯乙烯盖玻片或醋酸纤维膜，其中胰岛细胞微型固相检测片的制备采用细胞体外培养技术结合细胞爬片技术，另外三种蛋白微型固相检测片的制备方法依次包括将蛋白与磷酸盐缓冲液混合后调节蛋白溶液的浓度；将蛋白溶液再加入40％的甘油，混匀；采用市售的DNA微阵列仪点样仪在基质平面上点样；点样后孵育3小时；用牛血清白蛋白溶液封闭；在使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片；然后进行组装①选用表面上设有3～200个反应池的玻璃薄片，每个反应池均为边长是0.2mm～18mm的正方形，容量10μl～100μl；②在反应池内设置有一个检测微阵列，由四个同一规格大小的不同种类的微型固相检测片排列并以透明黏合剂黏附固定于其内制成。
7.如权利要求
6所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片的制备方法，其特征在于所述微型固相检测片的准备中，①胰岛细胞微型固相检测片的制备首先选取对胰岛细胞自身抗体抗体敏感的体外培养细胞，所述的对胰岛细胞自身抗体抗体敏感的体外培养细胞包括胰岛细胞瘤手术切除组织培养的胰岛β细胞瘤细胞以及哺乳动物胰腺组织内胰岛细胞；然后进行检测基质的培养培养方法是先参照胰岛细胞体外培养法进行原代培养，再在传代后使贴壁的单层培养细胞生长于检测片的表面，待细胞生长贴附整个检测片表面超过50％后，取出检测片，放入磷酸盐缓冲液洗涤，再于检测片表面滴加固定液固定30min，固定后浸入磷酸盐缓冲液-甘油混合液置于-20℃储存，使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片；②重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片的制备中，点样试剂采用纯化重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白，磷酸盐缓冲液稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片，每个微型检测片含有2个～10个蛋白点样点；③重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片的制备中，试剂采用重组纯化重组人胰岛细胞抗原512蛋白β-亚型，磷酸盐缓冲液稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片，每个微型检测片含有2个～10个蛋白点样点；④重组人胰岛素蛋白微型固相检测片的制备中，试剂采用合成人胰岛素蛋白，磷酸盐缓冲液稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片，每个微型检测片含有2个～10个蛋白点样点；①、②、③和④中所述的检测片采用经硅化处理(APES)的玻璃盖玻片或市售的透明聚苯乙烯盖玻片。
8.如权利要求
6或7所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片的制备方法，其特征在于所述制备方法还包括包装步骤，将芯片表面用锡箔纸包裹，再密封包装。
9.一种采用权利要求
1的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片的检测方法，其特征在于先采用间接荧光法检测，检测结果再以生物芯片激光共聚焦扫描仪扫描判定，或采用其他种类的微阵列扫描仪扫描实验检测结果，通过软件或专业人士进行判读；或仅使用普通荧光显微镜直接观察，再由专业人士对实验结果进行判定；所述反应池中的任意两个分别作为阴性质控反应池和阳性质控反应池，其余均为检测反应池。
10.如权利要求
9所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片的检测方法，其特征在于所述间接荧光法中，首先进行预处理，①将芯片取出后，室温放置5min，打开包装；②在每个反应池加入50μl磷酸盐缓冲液，放入37℃水浴中孵育15min；③滴加1％牛血清白蛋白50μl室温下封闭20min；然后对检测反应池的进行检测，操作步骤是①将一份患者待测血清以1∶5用磷酸盐缓冲液稀释，直接滴加于一个检测反应池表面，37℃孵育1h；②磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5min；③加入荧光标记的鼠抗人IgG单克隆抗体，37℃孵育1h；④含1％吐温的磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次10min；⑤滴加封裱剂封片；对质控反应池的检测操作步骤是与对检测反应池的检测同步，仅将检测微阵列操作步骤中所用患者待测血清换为阳性对照检测液或阴性对照检测液，其余步骤相同；阳性对照检测液是将健康成人血清，经1500转离心10min，将纯化的人谷氨酸脱羧酶自身抗体、人胰岛细胞抗原512蛋白自身抗体、人胰岛素蛋白自身抗体单克隆抗体各5u或相当于此量的浓缩溶液溶于健康成人血清制备而成；阴性对照检测液是将健康成人血清，经1500转离心10min，取上清液制备而成。
专利摘要
本发明涉及生物医学研究及临床应用领域，具体涉及糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片及其制备、检测方法。本发明要解决现有糖尿病临床分型确诊不准确和检测成本高的问题。解决方案是糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，外壳是上表面设置有多个反应池的玻璃薄片，反应池内均设置有检测微阵列，每个检测微阵列分别由四个不同种类的、同一规格大小的蛋白微型固相检测片组成，所述蛋白微型固相检测片分别是胰岛细胞微型固相检测片、重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片、重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片和重组人胰岛素蛋白微型固相检测片；制备方法是首先准备微型固相检测片，然后进行组装；检测方法是先采用间接荧光法检测，结果再以生物芯片激光共聚焦扫描仪判定。
文档编号G01N33/53GKCN1176377SQ02145561
公开日2004年11月17日 申请日期2002年12月30日
发明者刘镭, 罗毅, 王伟华, 刘 镭 申请人:陕西超英生物医学研究开发有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan