专利名称：对虾的G蛋白pvGβ的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从对虾中G蛋白克隆的pvGβ1基因。
背景技术：
细胞与细胞之间的信息和物质之间的交流最主要的一种方式就是G蛋自信号途径。该途径普遍存在于各种生物体内，各种胞外信号，包括化学药物、蛋白激素等都通过细胞膜上具有七重跨膜片断结构特征的G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCR)将信号传给细胞内的G蛋白(GTP-binding protein)，再由各种G蛋白亚基(α、β和γ亚基)通过不同的组合激活下游不同的分子途径，使细胞以至机体发生不同的生物学效应。
G蛋白是α、β和γ 3个不同的亚基结合而成的异源三聚体，可将七次跨膜受体接受的胞外信号传给胞内的效应生物功能蛋白。β和γ亚基总是紧密结合在一起作为一个功能单位，而α亚基可以与二磷酸鸟苷GDP或三磷酸鸟苷(GTP)结合。α亚基在结合GDP状态下比结合GTP更易与β/γ亚基复合体亲和。当配体与膜受体结合后，可引起与α亚基结合的GDP被GTP取代，并导致GTP-α亚基与β/γ亚基复合体的分离，进而各自调控相应的效应功能蛋白。α亚基具有内在的GTP酶活性，可将GTP水解成GDP，使GDP-α亚基和功能蛋白分开，并再度与β/γ亚基复合体形成紧密结合，从而恢复到非激活状态。
G蛋白β亚基是最主要的G蛋白成员之一。哺乳动物中已克隆的G蛋白β亚基有5种(β1、β2、β3、β4、β5)。相对Gα来说，β/γ亚基复合体也是一个独立的功能单位，它们在细胞兴奋、神经递质信号传导、脱敏作用、细胞生长、分化和感觉传递等活动中都有调节作用。β/γ可以提高Gα对GDP的亲和力，至少可以部分阻断Gα与效应分子结合的位点，使Gα保持在无活性的状态。β/γ还能调节Gα的一些效应分子，如腺苷酸环化酶(Adenylyl cyclase，AC)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC-β)、磷脂酶A2(phospholipase A2)和离子通道。β/γ激活PLC-β是不依赖Gα的，不同的β/γ亚基组合能激活或者抑制不同的AC异构体。同样，β/γ对离子通道的调节也有正调控和负调控，例如β/γ通过直接结合在一种非L型的钙离子通道来抑制该通道，但是同时它却激活了钾离子通道。β/γ还能通过G蛋白偶联受体激活ras、MAPK和JNK。
β/γ在气味刺激多种第二信史过程中的作用证明了β/γ在嗅觉系统中的重要性。已有报道，Gβ1在美国龙虾(Homarus americanus)的脑神经元和嗅觉受体神经元中有非常丰富的表达。进一步说明Gβ在甲壳类嗅觉系统中的重要功能。
发明内容
本发明的目的在于利用生物工程技术从对虾的感觉器官触角和眼中克隆与其它Gβ1同源的新基因pvGβ1，为对虾生长与发育提供理论基础，为对虾养殖、防病害以及新型配合饲料的研制奠定理论基础。
本发明的基因名称pvGβ1(Penaeus vannamei heterotrimeric G protein beta 1 subunit)Genbank序列号AY626793序列特征长度1272个碱基类型核酸链型单链几何特征线性分子类型cDNA基因来源南美白对虾Penaeus vannamei(Litopenaeus vannamei)蛋白编码序列27-1049表达产物pvGβ1翻译成蛋白的氨基酸序列340aaMNDLDSLRQEAERLKNTIRDARKNALDTTLVQATSGMDPIGRIQMRTRRILRGHLAKIYAMHWGSDSRNLVSASQDGKLIVWDSYTTNKVHAIPLRSSWVMTCAYAPSGSYVACGGLDNICSIYNLKTREGNVRVSRELPGHTGYLSCCRFLDDNQIVTSSGDMTCALWDIETGQQCTQFTGHTGDVMSLSLSPNMNTFTSGACDASAKLWDIRDGMCRQTFPGHESDINAVTFFPNGHAFATGSDDATCRLFDIRADQELAMYSHDNIICGITSVAFSKSGRLLLAGYDDFNCNVWDSMRTERAGVLAGHDNRVSCLGVTEDGMAVATGSWDSFLKIWNcDNA序列描述1 attttttagt tttgtaattt ttagaaatga atgatttgga tagtttacga caagaagcag aaagactaaa gaacacaata81 cgagatgctc gcaaaaatgc acttgacacg accttggtcc aagccacatc cggcatggac cctattggcc gaattcagat161 gcgaaccagg agaacgctta gaggacactt agccaaaata tatgccatgc actgggggtc ggactctagg aatttggtat241 ctcatagtat gggacagtta cactacaaac aaggtgcatg cagcatctca agacggcaag ccattcccct tcggtccagc321 tgggtcatga cctgtgccta tgctccctcg ggcagttacg ttgcctgtgg tggccttgat aacatctgtt ctatatacaa401 cttaaagaca agagaaggca atgtgagagt gagtagggag ttgcctggtc acactggtta cctaagttgc tgtcggttcc
481 tagacgacaa ccaaatagtc acaagctcgg gagacatgac ctgtgccctc tgggatatag agacgggtca gcagtgcacg561 caattcacag gccatacagg ggatgtgatg tccctgtccc tgtcaccgaa catgaacaca ttcacatcag gtgcctgtga641 tgcgtctgct aagctatggg acattcgtga tgggatgtgc cgccagacct tcccaggaca cgaatctgac attaatgcag721 ttacattctt ccccaatggg catgcatttg ccacgggatc agatgatgcc acatgccgcc tatttgacat tcgtgcagac801 caggagcttg ccatgtactc tcatgacaac attatttgtg gcatcacctc agtggcattc agcaagtctg gcagactcct881 gctggcrggt tacgatgact ttaattgtaa cgtttgggac tccatgagga cagaaagagc tggtgttctg gcgggccatg961 acaaccgcgt cagttgcctg ggtgttacag aagatggcat ggcagtggcc acaggctcat gggatagctt cctcaagatc1041 tggaactaag cttgtcatgc caccaccact ccagtatcaa catcagtatc ttcccaagga accaaattcc ctccaccgtc1121 cctgggactt gcacactgtt atatgaggga tttttcaatt gattccgact ccggttgtag cttatgaagt ctcgtttgtg1201 aatttgtcat gtaagtaact atctgacttg tccaataaag ctatttgtct ttacaaaaaa aaaaaaaaaa aa//pvGβ1基因的提取过程如下1)从新鲜对虾中取出脑、触角和眼，用Trizol试剂(Invitrogen)分别提取其中的总RNA，经反转录酶SuperScriptTMII Reverse Transcriptase(Invitrogen)反转录成cDNA。
2)根据已知物种G蛋白β亚基的保守序列设计简并引物，GβF，5’-TGGGT(AGCT)ATG(AG)C(AC)TGTGCITA-3’，GβR，5’-AACTTG(AG)(ACT)I(GC)(AT)(AG)GCATCACA-3’，进行简并PCR。
3)简并PCR得到330bp的片断产物，将这些片段经Klenow和T4 DNA聚合酶处理后克隆到pBluescript经Sma I酶切，然后CIP去磷酸化后的载体上，测序分析发现，该片断序列与其他物种Gβ1具有非常高的保守性。
4)将这段序列设计特异的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物为Gβ5’，5’-CCTGATGTGAATGTGTTCATGTTCG-3’；3’-RACE引物为Gβ3’，5’-GTCACACTGGTTACCTAAGTTGCTGT-3’。5’-和3’-RACE的PCR扩增产物分别克隆到pBluescript载体并测序，得到5’-和3’-两端序列，从而得到全长序列。
5)利用Genedoc软件对pvGβ1与其它物种Gβ1序列进行alignment分析，比较pvGβ1与其它物种Gβ1的同源性。
6)利用DNAstar软件对Gβ1做进化树分析，确定对虾在进化中的地位。
对虾是我国主要的海水养殖产品之一，对虾的感觉系统发达，而且感觉系统在其简单的生命活动中起着非常关键的作用，我们发现pvGβ1蛋白在对虾的神经系统(脑)、感觉器官(眼、触角)、摄食器官(鳃)、消化器官(肠道)和运动器官(游泳足)中的有大量分布也证实了G蛋白在对虾生命活动中的重要性。本发明发现pvGβ1蛋白的结构和功能在进化上有极强的保守性，为G蛋白功能分子在进化上的同源性研究提供了分子与结构基础。所以对对虾pvGβ1蛋白的研究可能为对虾的生命活动规律、对虾抗病害和养殖的研究打下理论基础。
图1为对虾G蛋白pvGβ1与其它物种Gβ1的alignment分析。
图2为对Gβ1的进化树分析。
图3为Western blot检测对虾各器官组织的膜蛋白中pvGβ1的表达。
图4为免疫共沉淀实验电泳图。
图5为细胞内三磷酸肌醇IP3浓度测定结果示意图。
图6为细胞内游离钙离子浓度测定结果示意图。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1基因pvGβ1的克隆1.1从市场买来新鲜对虾，鉴定为南美白对虾(Penaeus vannamei)。从新鲜对虾中取出脑、触角和眼，用Trizol试剂(Invitrogen)分别提取其中的总RNA，经反转录酶SuperScriptTMII Reverse Transcriptase(Invitrogen)反转录成cDNA。
1.2根据已知物种G蛋白β亚基的保守序列设计简并引物，GβF，5’-TGGGT(AGCT)ATG(AG)C(AC)TGTGCITA-3’，GβR，5’-AACTTG(AG)(ACT)I(GC)(AT)(AG)GCATCACA-3’，进行简并PCR，PCR在25μl体系中进行，其中单链cDNA 1.5μl，两端引物各20pmol，dNTP0.24mM，Taq聚合酶(Promega，USA)1.25U和相应缓冲液2.5μl。运行程序如下94℃退火3分钟，接着94℃，30秒，42℃60秒，72℃60秒40个循环，最后72℃延伸3分钟。
1.3简并PCR得到330bp的片断产物，将这些片段经Klenow和T4 DNA聚合酶处理后克隆到pBluescript经Sma I酶切，然后CIP去磷酸化后的载体上，测序分析发现，该片断序列与其他物种Gβ1具有非常高的保守性。
1.4将这段序列设计特异的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物为Gβ5’，5’-CCTGATGTGAATGTGTTCATGTTCG-3’；3’-RACE引物为Gβ3’，5’-GTCACACTGGTTACCTAAGTTGCTGT-3’。5’-和3’-RACE的PCR扩增产物分别克隆到pBluescript载体并测序，得到5’-和3’-两端序列，从而得到全长序列。
1.5利用Genedoc软件对pvGβ1与其它物种Gβ1序列进行alignment分析，比较pvGβ1与其它物种Gβ1的同源性。利用DNAstar软件对Gβ1做进化树分析，确定对虾在进化中的地位。通过该序列与其它物种Gβ1序列进行alignment分析和进化树分析(如图1，2)，发现该基因与其它物种(从无脊椎动物线虫、甲壳类龙虾到脊椎动物小鼠和人类)都具有很高的同源性，而且具有其他物种保守的功能位点。与龙虾具有最近的亲缘关系。确定了该基因就是Gβ1，我们给它命名pvGβ1。
实施例2pvGβ1的功能鉴定2.1按文献Sternweis(Sternweis，P.C.，Robishaw，J.D.，1984.J.Biol.Chem.295，13806-13813.)公开的方法提取对虾各器官中膜蛋白，取10μg膜蛋白进行Western blot分析。发现pvGβ1在对虾的各组织中都有少量分布，尤其在脑、眼、肠道、游泳足和触角上有丰富的表达(图3)。
2.2免疫共沉淀取适当浓度的HEK293T细胞铺于60mm细胞培养板，在含10％小牛血清的DMEM(Gibco)培养液中培养，24小时后，用聚醚酰亚胺PEI(Polyethylenimine)将pCMV5-HA-pvGβ1分别与pCMV5，pCMV5-Flag-pvGαq和pCMV5-Flag-pvGαs各2ug，共转染到细胞中。36小时后收细胞，按照Sternweis等人的方法提取细胞膜蛋白。将膜蛋白重悬于缓冲液(Hepes 30mM，MgCl21mM，EDTA 10mM，DTT 0.1mM，NaCl 150mM，GDP 0.1mM，Lubrol-PX 0.1％)中，取800μl浓度为4mg/ml的膜蛋白，冰上放置30分钟，然后离心20分钟后去掉不溶物，在上清溶液中加入抗Flag的抗体(Santa Cruz)1μg，Protein-A/G beads5μl，于4℃混和器上转过夜，1000rpm 4℃离心收集沉淀产物，同上缓冲液洗三次，然后SDS-PAGE电泳，用抗HA的一抗进行western blot分析。发现在GDP存在的情况下pvGβ1能结合对虾G蛋白pvGαs，也能结合对虾pvGαq(图4)，2.3细胞内游离钙离子浓度的测定同上方法将pCMV5-HA-pvGβ12μg转染到HEK293细胞，同时转染空载体为对照。36小时后分散细胞，取6×104个细胞于Eppendorf管，500g离心3分钟，用Hanks平衡盐溶液HBSS洗细胞3次，于10μM的FLUO-3/AM(CalBiochem)中37℃孵育30分钟，加HBSS(含1％FBS)400μl，继续孵育30分钟，再用HEPES缓冲液(HEPES 10mM，Na2HPO41mM，NaCl 137mM，KCl 5mM，CaCl21mM，MgCl20.5mM，glucose 5mM，BSA 0.1％，pH7.4)洗两次，加180μl HEPES缓冲液，将细胞转移到黑色96孔板，加入10mM的LiCl 20μl，30uM AlCl3与10mM NaF的混合物30μl，分别孵育5min、10min、20min后加入高氯酸终止反应。最后酶标仪分析，485nm激发，526nm吸收波长检测。结果显示在哺乳类细胞中过量表达pvGβ1，能使细胞内游离钙离子和IP3浓度上升(图5)。
2.4细胞内三磷酸肌醇浓度的测定细胞转染、G蛋白激活同钙离子浓度测定方法，测定IP3具体过程见Amersham公司产品号90-0037-01说明书。
权利要求
1.对虾的G蛋白pvGβ1基因，其特征在于其基因名称为pvGβ1(Penaeus vannameiheterotrimeric G protein beta 1 subunit)，Genbank序列号AY626793序列特征长度1272个碱基类型核酸链型单链几何特征线性分子类型cDNA基因来源南美白对虾Penaeus vannamei(Litopenaeus vannamei)蛋白编码序列27-1049表达产物pVGβ1翻译成蛋白的氨基酸序列340aaMNDLDSLRQEAERLKNTIRDARKNALDTTLVQATSGMDPIGRIQMRTRRTLRGHLAKIYAMHWGSDSRNLVSASQDGKLIVWDSYTTNKVHAIPLRSSWVMTCAYAPSGSYVACGGLDNICSIYNLKTREGNVRVSRELPGHTGYLSCCRFLDDNQIVTSSGDMTCALWDIETGQQCTQFTGHTGDVMSLSLSPNMNTFTSGACDASAKLWDIRDGMCRQTFPGHESDINAVTFFPNGHAFATGSDDATCRLFDIRADQELAMYSHDNIICGITSVAFSKSGRLLLAGYDDFNCNVWDSMRTERAGVLAGHDNRVSCLGVTEDGMAVATGSWDSFLKIWNcDNA序列描述1 attttttagt tttgtaattt ttagaaatga atgatttgga tagtttacga caagaagcag aaagactaaa gaacacaata81 cgagatgctc gcaaaaatgc acttgacacg accttggtcc aagccacatc cggcatggac cctattggcc gaattcagat161 gcgaaccagg agaacgctta gaggacactt agccaaaata tatgccatgc actgggggtc ggactctagg aatttggtat241 ctcatagtat gggacagtta cactacaaac aaggtgcatg cagcatctca agacggcaag ccattcccct tcggtccagc321 tgggtcatga cctgtgccta tgctccctcg ggcagttacg ttgcctgtgg tggccttgat aacatctgtt ctatatacaa401 cttaaagaca agagaaggca atgtgagagt gagtagggag ttgcctggtc acactggtta cctaagttgc tgtcggttcc481 tagacgacaa ccaaatagtc acaagctcgg gagacatgac ctgtgccctc tgggatatag agacgggtca gcagtgcacg561 caattcacag gccatacagg ggatgtgatg tccctgtccc tgtcaccgaa catgaacaca ttcacatcag gtgcctgtga641 tgcgtctgct aagctatggg acattcgtga tgggatgtgc cgccagacct tcccaggaca cgaatctgac attaatgcag721 ttacattctt ccccaatggg catgcatttg ccacgggatc agatgatgcc acatgccgcc tatttgacat tcgtgcagac801 caggagcttg ccatgtactc tcatgacaac attatttgtg gcatcacctc agtggcattc agcaagtctg gcagactcct881 gctggctggt tacgatgact ttaattgtaa cgtttgggac tccatgagga cagaaagagc tggtgttctg gcgggccatg961 acaaccgcgt cagttgcctg ggtgttacag aagatggcat ggcagtggcc acaggctcat gggatagctt cctcaagatc1041 tggaactaag cttgtcatgc caccaccact ccagtatcaa catcagtatc ttcccaagga accaaattcc ctccaccgtc1121 cctgggactt gcacactgtt atatgaggga tttttcaatt gattccgact ccggttgtag cttatgaagt ctcgtttgtg1201 aatttgtcat gtaagtaact atctgacttg tccaataaag ctatttgtct ttacaaaaaa aaaaaaaaaa aa//
2.对虾的G蛋白pvGβ1基因的提取方法，其特征在于其步骤为1)从新鲜对虾中取出脑、触角和眼，用Trizol试剂(Invitrogen)分别提取其中的总RNA，经反转录酶SuperScriptTMIIReverse Transcriptase(Invitrogen)反转录成cDNA；2)根据已知物种G蛋白β亚基的保守序列设计简并引物，GβF，5’-TGGGT(AGCT)ATG(AG)C(AC)TGTGCITA-3’，GβR，5’-AACTTG(AG)(ACT)I(GC)(AT)(AG)GCATCACA-3’，进行简并PCR；3)简并PCR得到330bp的片断产物，将这些片段经Klenow和T4 DNA聚合酶处理后克隆到pBluescript经Sma I酶切，然后CIP去磷酸化后的载体上，测序；4)将这段序列设计特异的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物为Gβ5’，5’-CCTGATGTGAATGTGTTCATGTTCG-3’；3’-RACE引物为Gβ3’，5’-GTCACACTGGTTACCTAAGTTGCTGT-3’，5’-和3’-RACE的PCR扩增产物分别克隆到pBluescript载体并测序，得到5’-和3’-两端序列，从而得到全长序列；5)利用Genedoc软件对pvGβ1与其它物种Gβ1序列进行alignment分析，比较pvGβ1与其它物种Gβ1的同源性；6)利用DNAstar软件对Gβ1做进化树分析，确定对虾在进化中的地位。
全文摘要
对虾的G蛋白pvGβ
文档编号C12N15/10GK1769451SQ20041009201
公开日2006年5月10日 申请日期2004年11月3日 优先权日2004年11月3日
发明者金利华, 林圣彩 申请人:厦门大学