专利名称：对虾的G蛋白pvGα的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从对虾中克隆的G蛋白pvGαs基因。
背景技术：
细胞与细胞之间的信息和物质之间的交流最主要的一种方式就是G蛋白信号途径。该途径普遍存在于各种生物体内，各种胞外信号，包括化学药物、蛋白激素等都通过细胞膜上具有七重跨膜片断结构特征的G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCR)将信号传给细胞内的G蛋白(GTP-binding protein)，再由各种G蛋白亚基(α、β和γ亚基)通过不同的组合激活下游不同的效应功能蛋白，使细胞以至机体发生不同的生物学效应。
G蛋白是α、β和γ 3个不同的亚基结合而成的异源三聚体，可将七次跨膜受体接受的胞外信号传给胞内的效应生物功能蛋白。β和γ亚基总是紧密结合在一起作为一个功能单位，而α亚基可以与二磷酸鸟苷GDP或三磷酸鸟苷(GTP)结合。α亚基在结合GDP状态下比结合GTP更易与β/γ亚基复合体亲和。当配体与膜受体结合后，可引起与α亚基结合的GDP被GTP取代，并导致GTP-α亚基与β/γ亚基复合体的分离，进而各自调控相应的效应功能蛋白。α亚基具有内在的GTP酶活性，可将GTP水解成GDP，使GDP-α亚基和功能蛋白分开，并再度与β/γ亚基复合体形成紧密结合，从而恢复到非激活状态。
G蛋白α亚基是最主要的G蛋白成员之一。在哺乳动物中已被克隆的G蛋白α亚基有17个，根据它们的序列相似性，可分为四个家族，即Gαs、Gαi、Gαq和Gα12。Gαs家族包括Gαs和Gαolf，二者均可激活腺苷酸环化酶(Adenylyl Cyclase，AC)，进而导致胞内第二信使环腺甘酸cAMP的水平的升高并激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，引起一系列下游因子的磷酸化反应。这一信号途径在激素、神经递质、感觉刺激等信号刺激下调控的生理效应在真核生物的进化过程中都是十分保守的。有研究表明，Gαs能够促进钠、钙离子通道的开通，此二者在神经递质多巴胺及5-羟色胺发挥其生理活性中起着重要的作用。
目前，对G蛋白信号调控的研究多见于高等生物，对低等生物只限于酵母、真菌、线虫等，在甲壳类无脊椎动物中只有美国龙虾(Homarus americanus)中克隆到G蛋白，在对虾等无脊椎动物中还是空白。
发明内容
本发明的目的在于利用生物工程技术从对虾中克隆出的G蛋白新基因pvGαs，为对虾生长与发育提供理论基础，为对虾养殖、防病害以及新型配合饲料的研制奠定理论基础。
本发明所说的基因名称pvGαs(Penaeus vannamei heterotrimeric Gs protein alpha subunit)Genbank序列号AY626794序列特征长度1676个碱基类型核酸链型单链几何特征线性分子类型cDNA基因来源南美白对虾Penaeus vannamei(Litopenaeus vannamei)蛋白编码序列249-1388表达产物pvGαs翻译成蛋白的氨基酸序列379aaMGCFGSAGAKGDAEEHRRRKEANKKINKQIQQDKQVYRATHRLLLLGAGESGKSTIVKQMRILHVDGFSEDEKRDKIKAIRCNIRDAILTITGNMSTLTPPIALENPAHQFRVDYIQDVASSKDFDYPDEFYEHTEILWKDQGVQACYERSNEYQLIDCAKYFLDRVHIVRQNDYTPTEQDILRCRVLTLGIFETRFQVDKVNFHMFDVGGQRDERRKWIQCFNDVTAIIFVTACSSYNMVLREDPSQNRLRESLDLFKSIWNNRWLRTISIILFLNKQDLLAEKIRAGRSRLEDSFPDFARYQTPLDATVEPGEDPEVVRAKYFIRDEFLRISTASGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLRQYELLcDNA序列描述1 ggtgcaagtt gtgcagatga ttggcgatga tggtgaacga ctgagatcga gtgatatctg gaccatcgcc cggcatccat81 ggcccaggtg gctgccactt cactcagtga catgtagact ggatcccatg acctagtgac gcgagatcag ccgcaaaaat161 aggcaactgg tgcggaaacg agacagggcc gcgggacgtc cgcgcctgcc tgcggctagg agctttcttc caagagtgta241 ctaatgtcat gggttgtttt ggtagcgctg gggcgaaagg tgacgccgag gaacacagaa ggcggaaaga agctaacaag321 aagataaaca agcagattca gcaagacaaa caagtgtacc gagcgacgca cagattgtta ctattaggag ccggagaatc401 agggaagagc acaattgtaa aacagatgag aattctacat gtcgatggat tcagtgaaga tgagaagaga gacaagatta481 aagctattcg atgcaacatc cgcgacgcaa tcttgaccat caccggcaac atgtccacct tgacgccccc gatagcgcta561 gagaaccccg cccaccagtt ccgcgtcgac tacatccagg acgtggcctc cagcaaggac ttcgactacc ccgacgagtt641 ctacgagcac accgagatcc tgtggaagga ccagggagtc caggcgtgct acgagcgctc caacgagtac cagctcarag721 attgtgccaa gtatttcctc gaccgcgtcc acatagtgcg gcagaacgac tataccccga cggaacagga tattctccga
801 tgtcgagtcc tcaccttagg cattttcgag acaagatttc aagtagacaa agttaatttc catatgttcg acgtgggcgg881 tcaacgcgat gagaggcgga agtggatcca atgtttcaat gacgtcacgg ccatcatctt cgtcaccgct tgctcctctt961 acaacatggt ccttcgggaa gaccccagtc aaaaccggct gcgggagtcg ttagatctct tcaaaagtat atggaacaac1041 aggtggctac gcacaatcag catcatcctg tttctaaaca agcaagacct cctggctgag aagatccggg ctgggaggag1121 caggttagaa gattctttcc ctgactttgc tcggtatcag accccactcg atgctaccgt ggaaccagga gaagatccag1201 aggtggtgcg cgcaaagtac ttcatcaggg atgaatttct aaggataagc acggcaagtg gtgatggcaa gcattattgc1281 taccctcact tcacatgcgc cgtggacacg gaaaacatcc gccgagtgtt caatgactgc agggacataa tacaaaggat1361 gcacctcaga caatatgaac ttttgtgatg gccagtaggt gtgggtactg cgggcggcaa cagtatagct ccgtgcgagc1441 gagcgaggca ggcaggctgg gtggaatggg gcgggggatc cgggaggacg gagtgaccct ccccgtctag tctcctcaga1521 ggatggttct cgctccctca ggacttcctc cccccctctc cgcccatgaa agcttttcct gcgcctcaag cgtggcacaa1601 catcaacttt cctcaaccca gtttttggtt taggtcctcg ttttgttttc ttacaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa//pvGαs基因的提取和克隆过程如下1)从新鲜南美白对虾中取出脑、触角和眼，用Trizol试剂(Invitrogen)分别提取其中的总RNA，经反转录酶SuperScriptTMII Reverse Transcriptase(Invitrogen)反转录成cDNA；2)根据已知物种G蛋白α亚基的保守序列设计简并引物，GαF5’-AGCAGI(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG-3’，GαR5’-TTGAA(AG)CA(AGCT)TG(AGT)ATCCA(CT)TT-3’，进行简并PCR；3)简并PCR得到500bp的片断产物，将这些片段经Klenow和T4 DNA聚合酶处理后克隆到pBluescript经Sma I酶切、CIP去磷酸化后的载体上，测序分析发现，该片断序列与其他物种Gαs具有非常高的保守性；4)通过这段序列设计特异的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物为Gs5’，5’-CCTGTTCCGTCGGGGTATAGTCGTTCTG-3’，3’-RACE引物为Gs3’，5’-CATCCGCGACGCAATCTTGACCATCACC-3’。5’-和3’-RACE的PCR扩增产物分别克隆到pBluescript载体并测序，得到5’-和3’-两端序列，从而得到全长序列。
5)利用Genedoc软件对pvGαs与其它物种Gαs序列进行alignment分析，比较pvGαs与其它物种Gαs的同源性。
6)利用DNAstar软件对Gαs做进化树分析，确定对虾在进化中的地位。
对虾是我国主要的海水养殖产品之一，对虾的感觉系统发达，而且感觉系统在其简单的生命活动中起着非常关键的作用，本发明发现Gαs蛋白在对虾的感觉器官中有大量分布也证实了G蛋白在对虾生命活动中的重要性。本发明发现Gαs蛋白的结构和功能在进化上有极强的保守性，为G蛋白功能分子在进化上的同源性研究提供了分子与结构基础。所以对对虾Gαs蛋白的研究可能为对虾的生命活动规律、对虾抗病害和养殖的研究打下理论基础。
图1为对虾G蛋白pvGαs与其它物种Gαs的alignment分析结果。
图2为对Gαs的进化树分析结果。
图3为Western blot检测对虾各器官组织中pvGαs的表达。
图4为免疫共沉淀结果电泳图。
图5为细胞内cAMP浓度测定结果示意图，灰色柱为霍乱毒素CTX(Choleratoxin)刺激处理，空白柱为不处理对照。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1克隆pvGαs1.从市场买来新鲜对虾，鉴定为南美白对虾(Penaeus vannamei)。从新鲜对虾中取出脑、触角和眼，用Trizol试剂(Invitrogen)分别提取其中的总RNA，经反转录酶SuperScriptTMII Reverse Transcriptase(Invitrogen)反转录成cDNA。
2.根据已知物种G蛋白α亚基的保守序列设计简并引物，GαF5’-AGC AGI(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG-3’，GαR5’-TTGAA(AG)CA(AGCT)TG(AGT)ATCCA(CT)TT-3’。进行简并PCR，PCR在25μl体系中进行，其中单链cDNA 1.5μl，两端引物各20pmol，dNTP 0.24mM，Taq聚合酶(Promega，USA)1.25 U和相应缓冲液2.5μl。运行程序如下94℃退火3分钟，接着94℃，30秒，42℃60秒，72℃60秒40个循环，最后72℃延伸3分钟。
3.简并PCR得到500bp的片断产物，将这些片段经Klenow和T4 DNA聚合酶处理后克隆到pBluescript经Sma I酶切，CIP去磷酸化后的载体上，测序分析发现，该片断序列与其他物种Gαs具有非常高的保守性。
4.通过这段序列设计特异的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物为Gs5’，5’-CCTGTTCCGTCGGGGTATAGTCGTTCTG-3’，3’-RACE引物为Gs3’，5’-CATCCGCGACGCAATCTTGACCATCACC-3’。5’-和3’-RACE的PCR扩增产物分别克隆到pBluescript载体并测序，得到5’-和3’-两端序列，从而得到全长序列。
5.利用Genedoc软件对pvGαs与其它物种Gαs序列进行alignment分析，比较pvGαs与其它物种Gαs的同源性，发现该基因与其它物种Gαs有高达90％以上的同源性。
6.通过从对虾中获得的该基因的序列与其它物种Gαs序列利用DNAstar软件对Gαs进行alignment分析和进化树分析(如图1，2)，发现该基因与其它物种(从无脊椎动物线虫、甲壳类龙虾到脊椎动物小鼠和人类)都具有很高的同源性，而且具有其他物种保守的功能位点。与龙虾具有最近的亲缘关系，确定了该基因就是Gαs，我们给它命名pvGαs。
实施例2pvGαs的功能鉴定1.按文献Sternweis(Sternweis，P.C.，Robishaw，J.D.，1984.J.Biol.Chem.295，13806-13813.)公开的方法提取对虾各器官中膜蛋白，取10μg膜蛋白进行Western blot分析。发现pvGαs在对虾的各组织中都有少量分布，尤其在脑、眼和鳃上有非常丰富的表达(图3)。
2.免疫共沉淀取适当浓度的HEK293T细胞铺于60mm细胞培养板，在含10％小牛血清的DMEM(Gibco)培养液中培养24小时后，用聚醚酰亚胺PEI(Polyethylenimine)将pCMV5-HA-pvGαs分别与pCMV5、pCMV5-Flag-pvGβ1和同样载体的人类Gβ1(hGβ1)各2μg，共转染到细胞中。36小时后收细胞，按照Sternweis等人的方法(Sternweis，P.C.，Robishaw，J.D.，1984.J.Biol.Chem.295，13806-13813.)提取细胞膜蛋白。将膜蛋白重悬于缓冲液(Hepes30mM，MgCl21mM，EDTA 10mM，DTT 0.1mM，NaCl 150mM，GDP 0.1mM，Lubrol-PX0.1％)中，取800μl浓度为4mg/ml的膜蛋白，冰上放置30分钟，然后离心20分钟后去掉不溶物，在上清溶液中加入抗HA的抗体(Santa Cruz)1μg，Protein-A/G beads 5μl，于4℃混和器上转过夜，1000rpm 4℃离心收集沉淀产物，同上缓冲液洗三次，然后SDS-PAGE电泳，用抗Flag的一抗(Santa Cruz)进行western blot分析，发现在GDP存在的情况下它能结合对虾G蛋白pvGβ1，也能结合人Gβ1(图4)。
3.细胞内cAMP浓度的测定用瞬时转染空载体和pCMV5-HA-pvGαs的HEK293细胞进行分析，1μg/ml霍乱毒素CTX刺激，按Amersham公司产品号90-0001-01说明书进行分析。分析结果表明HEK293细胞中过量表达pvGαs使细胞内cAMP浓度升高(见图5)。
权利要求
1.对虾的G蛋白pvGαs基因，其特征在于其基因名称为pvGαs(Penaeus vannameiheterotrimeric Gs protein alpha subunit)，Genbank序列号AY626794序列特征长度1676个碱基类型核酸链型单链几何特征线性分子类型cDNA基因来源南美白对虾Penaeus vannamei(Litopenaeus vannamei)蛋白编码序列249-1388表达产物pvGαs翻译成蛋白的氨基酸序列379aaMGCFGSAGAKGDAEEHRRRKEANKKINKQIQQDKQVYRATHRLLLLGAGESGKSTIVKQMRILHVDGFSEDEKRDKIKAIRCNIRDAILTITGNMSTLTPPIALENPAHQFRVDYIQDVASSKDFDYPDEFYEHTEILWKDQGVQACYERSNEYQLIDCAKYFLDRVHIVRQNDYTPTEQDILRCRVLTLGIFETRFQVDKVNFHMFDVGGQRDERRKWIQCFNDVTAIIFVTACSSYNMVLREDPSQNRLRESLDLFKSIWNNRWLRTISIILFLNKQDLLAEKIRAGRSRLEDSFPDFARYQTPLDATVEPGEDPEVVRAKYFIRDEFLRISTASGDGKHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLRQYELLcDNA序列描述1 ggtgcaagtt gtgcagatga ttggcgatga tggtgaacga ctgagatcga gtgatatctg gaccatcgcc cggcatccat81 ggcccaggtg gctgccactt cactcagtga catgtagact ggatcccatg acctagtgac gcgagatcag ccgcaaaaat161 aggcaactgg tgcggaaacg agacagggcc gcgggacgtc cgcgcctgcc tgcggctagg agctttcttc caagagtgta241 ctaatgtcat gggttgtttt ggtagcgctg gggcgaaagg tgacgccgag gaacacagaa ggcggaaaga agctaacaag321 aagataaaca agcagattca gcaagacaaa caagtgtacc gagcgacgca cagattgtta ctattaggag ccggagaatc401 agggaagagc acaattgtaa aacagatgag aattctacat gtcgatggat tcagtgaaga tgagaagaga gacaagatta481 aagctattcg atgcaacatc cgcgacgcaa tcttgaccat caccggcaac atgtccacct tgacgccccc gatagcgcta561 gagaaccccg cccaccagtt ccgcgtcgac tacatccagg acgtggcctc cagcaaggac ttcgactacc ccgacgagtt641 ctacgagcac accgagatcc tgtggaagga ccagggagtc caggcgtgct acgagcgctc caacgagtac cagctcatag721 attgtgccaa gtatttcctc gaccgcgtcc acatagtgcg gcagaacgac tataccccga cggaacagga tattctccga801 tgtcgagtcc tcaccttagg cattttcgag acaagatttc aagtagacaa agttaatttc catatgttcg acgtgggcgg881 tcaacgcgat gagaggcgga agtggatcca atgtttcaat gacgtcacgg ccatcatctt cgtcaccgct tgctcctctt961 acaacatggt ccttcgggaa gaccccagtc aaaaccggct gcgggagtcg ttagatctct tcaaaagtat atggaacaac1041 aggtggctac gcacaatcag catcatcctg tttctaaaca agcaagacct cctggctgag aagatccggg ctgggaggag1121 caggttagaa gattctttcc ctgactttgc tcggtatcag accccactcg atgctaccgt ggaaccagga gaagatccag1201 aggtggtgcg cgcaaagtac ttcatcaggg atgaatttct aaggataagc acggcaagtg gtgatggcaa gcattattgc1281 taccctcact tcacatgcgc cgtggacacg gaaaacatcc gccgagtgtt caatgactgc agggacataa tacaaaggat1361 gcacctcaga caatatgaac ttttgtgatg gccagtaggt gtgggtactg cgggcggcaa cagtatagct ccgtgcgagc1441 gagcgaggca ggcaggctgg gtggaatggg gcgggggatc cgggaggacg gagtgaccct ccccgtctag tctcctcaga1521 ggatggttct cgctccctca ggacttcctc cccccctctc cgcccatgaa agcttttcct gcgcctcaag cgtggcacaa1601 catcaacttt cctcaaccca gtttttggtt taggtcctcg ttttgttttc ttacaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa//
2.对虾的G蛋白pvGαs基因的提取方法，其特征在于其步骤为1)从新鲜南美白对虾中取出脑、触角和眼，用Trizol试剂(Invitrogen)分别提取其中的总RNA，经反转录酶SuperScriptTMII Reverse Transcriptase(Invitrogen)反转录成cDNA；2)根据已知物种G蛋白α亚基的保守序列设计简并引物，GαF5’-AGCAGI(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG-3’，GαR5’-TTGAA(AG)CA(AGCT)TG(AGT)ATCCA(CT)TT-3’，进行简并PCR；3)简并PCR得到500bp的片断产物，将这些片段经Klenow和T4 DNA聚合酶处理后克隆到pBluescript经Sma I酶切、CIP去磷酸化后的载体上，测序分析发现，该片断序列与其他物种Gαs具有非常高的保守性；4)通过上述序列设计特异的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物为Gs5’，5’-CCTGTTCCGTCGGGGTATAGTCGTTCTG-3’，3’-RACE引物为Gs3’，5’-CATCCGCGACGCAATCTTGACCATCACC-3’，5’-和3’-PACE的PCR扩增产物分别克隆到pBluescript载体并测序，得到5’-和3’-两端序列，从而得到全长序列；5)用Genedoc软件对pvGαs与其它物种Gαs序列进行alignment分析，比较pvGαs与其它物种Gαs的同源性；6)用DNAstar软件对Gαs做进化树分析，确定对虾在进化中的地位。
全文摘要
对虾的G蛋白pvGα
文档编号C12N15/10GK1769452SQ20041009201
公开日2006年5月10日 申请日期2004年11月3日 优先权日2004年11月3日
发明者金利华, 林圣彩 申请人:厦门大学