一种产氨肽酶菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物筛选及发酵技术领域，具体涉及一种产氨肽酶菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8及其应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白酶是一类能够水解蛋白质肽键的酶，与人类的生活息息相关。食物蛋白质经 蛋白酶控制酶解可以改善蛋白质的营养特性和功能特性，制备生物活性肽，从而大大提高 了蛋白质的应用价值。目前已经有较丰富的商业蛋白酶种类，如木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、 碱性蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶等。碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶已被较多研究 者报道对水产品、动物蛋白质有较好的水解效果，但这些蛋白酶对植物蛋白质的水解效果 并不理想，存在水解度低、蛋白质回收率低、苦味重等问题。这些问题主要是由蛋白酶的酶 切位点的限制造成的。蛋白酶根据其作用方式可分为内切蛋白酶和外切蛋白酶：内切蛋白 酶主要从肽链的内部切割肽键，生成小分子的多肽;外切蛋白酶分为氨肽酶和羧肽酶，分别 从肽链的N端或C端顺序水解氨基酸、使氨基酸逐个释放出来。上述商业蛋白酶除了风味蛋 白酶、胰蛋白酶是内切蛋白酶与外切蛋白酶的混合物外，大部分都是内切蛋白酶，作用于植 物蛋白质时仅能从内部切割肽键，生成较大分子量的多肽，且使疏水基团大量暴露苦味加 重。因此加强外切蛋白酶的开发对提高植物蛋白质的应用有重要意义。
[0003] 微生物来源的氨肽酶一直受到了研究者们的关注。Johnson等于1936年首次从 Aspergillus parasiticus的代谢产物中发现了氨肽酶；1996年，Choi等利用 Lactobacillus casei ssp.casei产氨肽酶水平为0.16LAP.II1L-1左右；张金虎等利用 Bacillus cereus CZ生产氨肽酶达94.28U·!!!!/1，江南大学田亚平教授团队选育的枯草芽 孢杆菌Zj016产氨肽酶达到5500U · ml/1。已报道的菌株氨肽酶差异比较大，这可能与测定方 法和酶活定义单位不同有一定的关系，且不同微生物所产氨肽酶的酶学性质也有较大的区 另 1J。本发明中涉及的Bacillus axarquiensis SWJSX8野生菌株从深海沉积物中分离得到， 经过初步优化培养条件，产氨肽酶的活力在达2.8LAP · ml/1左右，遗传性质稳定。菌属 Bacillus axarquiensis的相关报道还比较少，关于其产氨肽酶的研究在本文是首次报道， 可以为氨肽酶产品的开发提供新的生产菌种及理论基础。
【发明内容】
[0004] 基于以上现有技术，本发明的首要目的在于提供一种深海来源、产氨肽酶的微生 物菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述微生物菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8在 液体发酵产氨肽酶中的应用。
[0006] 本发明目的通过以下技术方案实现：
[0007] 一种深海来源、产氨肽酶的微生物菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8,该菌株 分离自南海深海沉积物样品，采用酪蛋白平板初筛和摇瓶发酵氨肽酶活性测定复筛得到， 分类命名为Bacillus axarquiensis SWJSX8。该菌株已于2015年6月10日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院 微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 10974。
[0008] 经形态鉴定及生物生化特性研究，保藏编号为CGMCC No. 10974的菌株在酪蛋白平 板上菌落形态如下：菌落呈圆形，直径较小，光滑湿润，边缘整齐，浅黄色，黏稠状；⑵细胞 形态:革兰氏染色阳性，杆状，产芽孢；（3)生理生化特征:需氧生长，能利用葡萄糖、蔗糖、麦 芽糖、乳糖、甘露醇、D-山梨醇和肌醇，不能利用鼠李糖，淀粉水解阳性、明胶液化阳性、甲基 红试验阴性、V-P试验阳性、靛基质试验阴性、脲酶阴性、氧化酶阳性，不产H 2S。
[0009] 对保藏编号为CGMCC No. 10974菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增与序列测定，测 得16S rDNA基因片段长度为1440bp，具体序列见序列表。该基因序列与Genbank中已登录的 基因序列进行分析得知，该菌株与数据库中Bacillus axarquiensis strain BPRIST011相 似性最高，同源性达99%，鉴定该菌株为Bacillus axarquiensis。
[0010] 上述微生物菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8在液体发酵产氨肽酶中的应用。
[0011] 本发明具有如下优点及有益效果：
[0012] 本发明筛选得到深海来源的产氨肽酶的菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8,其 培养条件简单，遗传性质稳定，所产氨肽酶有较强的底物特异性。该菌株可能成为新型氨肽 酶的生产菌种或提供新的氨肽酶编码基因，值得继续加强理论研究和基础应用研究。
【附图说明】
[0013] 图1为不同发酵温度对菌株SWJSX8产氨肽酶的影响曲线图；
[0014] 图2为不同培养基初始pH对菌株SWJSX8产氨肽酶的影响曲线图；
[0015]图3为不同装液量对菌株SWJSX8产氨肽酶的影响曲线图；
[0016]图4为不同发酵时间对菌株SWJSX8产氨肽酶的影响曲线图；
[0017] 图5为菌株SWJSX8所产氨肽酶的底物特异性对比图。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0019] 富集及种子培养基:蛋白胨5g，酵母粉lg，人工海水lL，pH7.4。
[0020] 酪蛋白培养基:酪蛋白l〇g，牛肉浸膏3g，磷酸二氢钾2g，琼脂粉15g，人工海水1L， pH 7.2左右。
[0021] 发酵培养基:甘油3g，葡萄糖5g，酵母粉10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，硫酸铵 lg，氯化钙lg，海盐10g，pH7.2左右。
[0022] 产氨肽酶的CGMCC No. 10974的分离筛选：
[0023]富集培养:称取2g深海海泥样品样于50mL灭菌离心管中，加15mL无菌蒸馏水，充分 混合，在摇床中振摇30min，静置后取上清液lmL于富集培养基中（25mL/250mL)，37°C， 120rpm，培养 48h。
[0024]初筛：取富集后的培养液lmL加入9mL无菌生理水中，用倍比法稀释到不同梯度 (1〇4-10〃）。选取10'1〇4，1〇'1〇〃稀释度，各吸取〇.11^，加入已凝固的酪蛋白培养基中， 涂布均匀。倒置放在37 °C培养箱中培养24-48h。
[0025]分离纯化:挑选上述酪蛋白平板中有明显水解圈的菌落，在新的酪蛋白