编码衍生自间日疟虫的输出蛋白1的核苷酸和氨基酸序列及其用途的制作方法

专利名称：编码衍生自间日疟虫的输出蛋白1的核苷酸和氨基酸序列及其用途的制作方法
编码衍生自间日疟虫的输出蛋白1的核苷酸和氨基酸序列
及其用途MM
本发明涉及尤其在诊断应用中有用的，衍生自间日疟虫(jnasmodium vivax)的输出抗原-7 {Exported Antigen-O (拟竹)基因的核酸序列和由其编码的氨基酸序列。背景
疟疾传播
疟疾是由寄生物引起的蚊媒疾病。至少4个疟原虫物种可以在自然条件下感染人 恶性疟虫(jnasmodium falciparum )、间日疟虫、卵形疟虫(A ο vale )和三日疟虫M 前2个物种引起全世界最多的感染。间日疟虫和卵形疟虫具有休眠肝阶段寄生物(休眠子)，其可以在感染蚊叮咬后几月或几年再活化(或“复发”)且引起疟疾；因此，这些物种在受感染个体中可以难以检测。在自然界中，疟原虫通过连续感染2类宿主传播人和雌性按蚊属iAnophelesm 子。在人中，寄生物首先在肝细胞且随后在红细胞中生长且繁殖。在血液中，寄生物的同窝 (broods)在红细胞内生长且破坏它们，从而释放子代寄生物(裂殖子)，其通过侵袭其他红细胞继续该周期。血液阶段寄生物引起疟疾的症状。当某些形式的血液阶段寄生物，配子母细胞，由雌性按蚊属蚊子在进食血液过程中吸收时，它们开始在蚊子中的另一个、不同的生长和增殖周期。在10-18天后，寄生物作为子孢子在蚊子的唾液腺中发现。当按蚊属蚊子从另一个人获得血餐时，子孢子由蚊子的唾液注射，并且当它们寄生肝细胞时，开始另一次人感染 (ffyler,1992)。疟疾症状和疾病
由疟原虫感染可以导致广泛多样的症状，范围从不存在或非常温和的症状到严重疾病和甚至死亡。疟疾疾病可以分类为非并发的或(并发的)严重的。一般而言，如果迅速诊断且治疗，那么疟疾是可治愈的。在感染性蚊叮咬后，在第一次症状出现前存在潜伏期。潜伏期通常从7到30天不等。对于恶性疟虫最频繁地观察到更短的时期，而对于间日疟虫观察到更长的时期。事实上，间日疟虫可以具有超过450天的延长的潜伏期(Lee等人，1998)。诊断
疟疾必须迅速被识别以便及时治疗患者且防止感染在社区中的进一步传播。因为关于间日疟虫的长潜伏期，所以诊断通过常规血涂片法可以是困难的，从而耽搁治疗。诊断和治疗中的耽搁是疟疾患者中的死亡主因。疟疾可以基于患者的症状和检查时的身体发现受到怀疑。然而，对于确定诊断，实验室测试必须证实疟原虫的存在。用于疟疾的现有诊断“黄金标准”取决于在显微镜下检查的在血涂片上寄生物的证实。疟虫属抗体的检测
针对无性疟原虫(即裂殖子)的抗体在寄生物侵入红细胞后数天到数周内出现，并且可以持续数月或甚至数年(Vinetz等人，1998)。然而，通常不推荐用于急性疟疾诊断的抗体检测，这是因为抗体的存在可以指示过去或近期感染。已开发了使用疟虫属(/^^ ο Τ/ )衍生的抗原(Newmarket Laboratories, UK ；Cellabs，澳大利亚)或恶性疟虫完整生物裂解物(DiaMed)的酶联免疫吸附测定(ELISA)，以检测人血清或血浆中的免疫球蛋白(IgG和/ 或IgM)。这些测定比IFA更容易执行，显示更高的通量和更佳的灵敏度与特异性(Kitchen 等人，2004 jeed等人，2005 ；Srivastava等人，1991 )。目前的商业ELISA测定不足够灵敏， 以检测针对4个疟虫属物种的每一个的抗体(She等人，2007)。用于捕获抗体的抗原已包括疫苗候选物。这些抗原对于诊断应用是有吸引力的， 这是因为这些抗原已知引发抗体应答，并且从而可能用于检测由受感染个体产生的抗体， 所述受感染个体起因于寄生物感染。此种抗原的例子包括间日疟虫和恶性疟虫的环子孢子蛋白(CSP)、顶端膜抗原1 (AMA-1)、裂殖子表面蛋白质(MSP) 1和2 (Kitchen等人，2004 ； Rodrigues等人，2003)。其他有价值的抗原是MSP-2、-3、-4、-5、-8 _9，富含谷氨酸的蛋白质，和丝氨酸重复抗原(Girard等人，2007)。输出蛋白质-1 (EXP1 ；也称为QF116，抗原5. 1，和环子孢子相关抗原(Meraldi等人，2002))已在疟虫属物种中进行研究，尽管它在间日疟虫中的直向同源物仍未得到阐明， 除通过序列注视(sequence gazing)外。在非间日疟虫物种中，多肽是被认为在寄生物蛋白质的细胞内转运中重要的小泡蛋白质(Simmons等人，1987)。在恶性疟虫中，EXPl作为 23 kD蛋白质在寄生物的红细胞前和无性血液阶段中表达(Hope等人，1984)。作为整合膜蛋白质，它在寄生泡的膜(保护细胞内寄生物的内质和网掩盖的泡)和宿主细胞细胞质内的小泡中发现(Kara等人，1990 ；Sherman, 1985 ；Tolle等人，1993)。使用EXPl鼠同源物的研究显示蛋白质在小鼠中可以诱导针对用约氏疟虫(A的致死攻击的保护性T细胞免疫(Charoenvit等人，1999)。针对恶性疟虫EXPl多肽产生的抗体已在检测疟疾感染中成功(Meraldi等人，2002)。一般地，C末端在人中是最抗原性的(Meraldi等人，2002)。已存在使用间日疟虫EXPl序列作为诊断间日疟虫感染的工具的报道(Kim等人， 2003 ；Son等人，2001);然而，这些早期努力看起来基于不正确序列，并且所产生的诊断最可能检测恶性疟虫EXPl序列。在Kim等人(2003)和Son等人(2001)报道中，作者使用显然使用由Simmons等人公开的序列开发的引物序列(Simmons等人，1987)。Simmons等人 (1987)报道了恶性疟虫EXPl序列，并且指出该序列在5个恶性疟虫系中是高度保守的 ’然而，Simmons等人(1987)未报道来自间日疟虫的任何EXPl序列。Kim等人(2003)和Son 等人(2001)引用如来自间日疟虫的GenBank登记号X05074 ；然而，GenBank的条目指出这个登记是恶性疟虫的部分。为了回避这点，Kim等人(2003)和Son等人(2001)用来自间日疟疾患者的血液作为模板，但数据分析暗示他们使用的引物将不扩增间日疟虫多核苷酸序列，这是因为如现今理解的，正向引物的最后3个核苷酸(3’)和反向引物的最后6个核苷酸(3’)不与推定的间日疟虫EXPl序列退火。在捐献的血清或血浆中抗体的检测可以用于鉴定个别供体，其已暴露于疟疾生物，并且可能是近期感染的，并且因此是潜在寄生的(parasitemic)。感染人的所有4个疟虫物种已经由输血传播，并且尽管输血后疟疾的发生率在美国是低的(Mimgai等人， 2001)，但供血者的可用性可以通过疟虫抗体筛选测定的实现得到增加，从而使得仅疟疾生物暴露的个体而不是已在疟疾地方性区域中旅行或生活的所有供体从献血中延期，如目前实践的那样。此种测定在理论上将检测针对感染人且引起疟疾的疟虫物种(恶性疟虫、间日疟虫、卵形疟虫和三日疟虫)的抗体。商业抗体ELISAs目前在使用中(英国、澳大利亚、法国)或在其他国家中正考虑用于延期供体的恢复(Elghouzzi等人，2008 ；Kitchen等人，2004 ； ked等人，2005)。在这些情况下，供体就在延期的几个月内针对疟虫衍生的抗原的抗体进行测试。来自Cellabs Pty. Ltd. (Brookvale，NSW，澳大利亚)的商业测定(泛疟疾抗体 (Pan Malaria Antibody)CELISA)要求检测针对所有4个疟虫物种的抗体，所述疟虫物种引起人中的疟疾，以及与免疫荧光测试(IFAT)(根据包装插页)比较94%的灵敏度。独立评价暗示当与IFAT相比较时，该测定对于恶性和非恶性疟疾抗体检测具有弱灵敏度(Mertens 等人，1999)。利用培养的恶性疟虫和间日疟虫重组蛋白质(环子孢子蛋白)提取物的混合物的，来自DiaMed AG (瑞士)的另一种测定的独立评价，证实用于检测具有显微镜证实的间日疟虫(18/M)的有症状个体的弱灵敏度，但的确检测在受卵形疟虫(2/2)感染或三日疟虫(2/2)感染的患者中的抗体(Doderer 等人，2007)。由 Newmarket Laboratories Ltd (Kentford, UK)制造的疟疾抗体测定要求检测负责人疟疾的所有4个疟虫物种，尽管它仅包含恶性疟虫和间日疟虫衍生的重组抗原。包装插页指出对于卵形疟虫和三日疟虫抗体检测分别仅80%和67%的灵敏度。在受卵形疟虫或三日疟虫感染的个体中抗体的检测可以是由于受恶性疟虫或间日疟虫的过去感染，并且从而反应性是由于针对这些抗原的持续抗体的检测。该测定的独立评价证实检测由于卵形疟虫感染具有急性疟疾的仅9/14 (64%) 个患者和具有间日疟虫疟疾的85% (15/18)患者(Kitchen等人，2004)。因此，这些测定所要求的检测由感染引发的对于恶性疟虫以及卵形疟虫、间日疟虫和三日疟虫的人抗体的能力是有问题的。对于其固相抗原组成已知的那些测定(例如，Newmarket, DiaMed)，卵形疟虫或三日疟虫特异性抗原的不存在暗示针对这些物种的抗体的检测可能是由于抗体交叉反应性，这产生关于测定特异性以及灵敏度的重要问题，或在卵形疟虫或三日疟虫样品中观察到的反应性是由于来自先前感染的恶性疟虫或间日疟虫抗体的存在。因此，目前存在关于来自间日疟虫的疟虫抗体的可靠检测的显著需要。本文提及的所有专利和公开物在此整体引入作为参考。发明概述
在第一个方面，本发明涉及分离的核酸序列或其片段，其包括编码多肽的核酸序列或与编码多肽的核酸序列互补，其中所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2_50的氨基酸序列具有至少70%同一性。核酸序列可以是例如SEQ ID N0:1的那种，或从间日疟虫中分离。在第二个方面，本发明涉及由核酸编码的纯化的蛋白质，所述核酸与SEQ ID N0:1 的核酸序列具有至少70%序列同一性。在第三个方面，本发明涉及包括氨基酸序列的纯化的蛋白质或其片段，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2_50的氨基酸序列具有至少70%同一性。在第四个方面，本发明涉及产生蛋白质的方法，其中所述方法包括步骤
(a)分离包括SEQID NO: 1的核苷酸序列的核酸序列；
(b)构建包括与调节序列可操作地连接的分离的核酸序列的载体；和
(c)在对于所述蛋白质表达足够的时间和条件下，将所述载体引入宿主细胞内。宿主细胞可以是原核或真核细胞。
在第五个方面，本发明涉及包括与调节序列可操作地连接的、包含SEQ ID N0:1的核酸序列的载体，和包括此种载体的宿主细胞。在第六个方面，本发明涉及在怀疑包含抗体的测试样品中检测针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤
(a)在对于抗体/抗原复合物形成足够的时间和条件下，使测试样品与包括氨基酸序列的抗原接触，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 JPSEQ ID N0:2的氨基酸 2-50 ；和
(b)通过检测抗体/抗原复合物的存在，检测测试样品中存在的抗体的存在。在第七个方面，本发明涉及在怀疑包含抗体的测试样品中检测针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤
(a)在足以允许抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使测试样品与包括氨基酸序列的抗原接触，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 JPSEQ ID N0:2的氨基酸 2-50 ；
(b)在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体；和
(c)通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中存在的抗体的存在。在第八个方面，本发明涉及在怀疑包含抗体的测试样品中检测针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤
(a)在足以允许抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使测试样品与包括氨基酸序列的抗原接触，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 JPSEQ ID N0:2的氨基酸 2-50 ；
(b)在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的、包含氨基酸序列的抗原，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2-50 ；和
(c)通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中存在的抗体的存在。在第九个方面，本发明涉及在怀疑包含抗体的测试样品中检测间日疟虫抗体的存在的方法，其包括步骤
(a)在足以允许抗抗体/间日疟虫抗体复合物形成的时间和条件下，使测试样品与抗抗体接触；
(b)在足以允许抗原与结合的抗体结合的时间和条件下，将抗原添加到所得到的抗抗体/间日疟虫抗体复合物中，其中所述抗原包括选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列；
(c)将缀合物添加到所得到的抗抗体/间日疟虫抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括组合物，所述组合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的、针对间日疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体；和(d)通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中可以存在的抗体的存在。在另外第十个方面，本发明涉及在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、恶性疟虫、间日疟虫和卵形疟虫的抗体的方法，其包括步骤
(a)在对于三日疟虫抗体/抗原复合物、恶性疟虫抗体/抗原复合物、间日疟虫抗体/ 抗原复合物、和卵形疟虫抗体/抗原复合物形成足够的时间和条件下，使测试样品与下述接触(i)包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，(ii)来自恶性疟虫的抗原，(iii)来自卵形疟虫的抗原，和(iv)来自三日疟虫的抗原；和
(b)通过检测一种或多种复合物的存在，检测测试样品中存在的抗体的存在。在第十一个方面，本发明涉及在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的方法，其包括步骤
(a)在足以允许三日疟虫抗体/抗原复合物、卵形疟虫抗体/抗原复合物、间日疟虫抗体/抗原复合物、和恶性疟虫抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使测试样品与下述接触(i)包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，( )卵形疟虫抗原，(iii)三日疟虫抗原，和(iv)恶性疟虫抗原；
(b)在足以允许每种缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将4种缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中第一种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的，包括选自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 3、和SEQ ID NO: 2的氨基酸2_50的氨基酸序列的抗原；第二种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的卵形疟虫抗原；第三种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成信号附着的三日疟虫抗原， 并且第四种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的恶性疟虫抗原；和
(c)通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中可以存在的针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在。在第十二个方面，本发明涉及在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的方法，其包括步骤
(a)在足以允许三日疟虫抗体/抗原复合物、卵形疟虫抗体/抗原复合物、间日疟虫抗体/抗原复合物、和恶性疟虫抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使测试样品与下述接触(i)包括选自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，(ii)三日疟虫抗原，(iii)间日疟虫抗原，和(iv)恶性疟虫抗原；
(b)在足以允许每种缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体；和
(c)通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中可以存在的针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫抗体的抗体的存在。在第十三个方面，本发明涉及用于在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的方法，其包括步骤
(a)在足以允许抗抗体/间日疟虫、抗抗体/三日疟虫、抗抗体/卵形疟虫、和抗抗体/ 恶性疟虫复合物形成的时间和条件下，使测试样品与抗抗体接触；(b)在足以允许抗原与结合的抗体结合的时间和条件下，将第一种抗原、第二种抗原、 第三种抗原和第四种抗原添加到所得到的抗抗体/间日疟虫、抗抗体/三日疟虫、抗抗体/ 卵形疟虫、和抗抗体/恶性疟虫复合物中，其中(i)所述第一种抗原包括选自SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2_50的氨基酸序列；(ii)所述第二种抗原包括卵形疟虫抗原；(iii)所述第三种抗原包括三日疟虫抗原；和(iv)所述第四种抗原包括恶性疟虫抗原；
(c)在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将第一种缀合物、第二种缀合物、第三种缀合物和第四种缀合物添加到所得到的抗抗体/抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物各与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着；并且(i)所述第一种缀合物包括包含针对间日疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体的组合物；(ii)所述第二种缀合物包括包含针对卵形疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体的组合物；(iii)所述第三种缀合物包括包含针对三日疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体的组合物；(vi)所述第四种缀合物包括包含针对恶性疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体的组合物；和
(d)通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中可以存在的抗体的存在。在第十四个方面，本发明涉及用于在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的方法，其包括步骤
(a)使测试样品与抗抗体接触，以允许形成抗抗体/抗体复合物；
(b)在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将第一种缀合物、第二种缀合物、第三种缀合物和第四种缀合物添加到所得到的抗抗体/抗体复合物中，其中所述第一种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的，包含选自SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2_50的氨基酸序列的抗原，其中所述第二种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的卵形疟虫抗原，其中所述第三种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的间日疟虫抗原，并且其中所述第四种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的恶性疟虫抗原；和
(c)通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在。在第十五个方面，本发明涉及包括下述的疫苗(a)选自下述的至少一种抗原 (i)包括SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2_50的氨基酸序列的抗原， 或其表位。此种疫苗可以进一步包括选自恶性疟虫、卵形疟虫和三日疟虫的抗原；和药学可接受的佐剂。在第十六个方面，本发明涉及用于测定测试样品中针对间日疟虫的抗体的存在的试剂盒，其包括(a)包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50 的氨基酸序列的抗原，和(b)包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体的缀合物。在第十七个方面，本发明涉及用于测定测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的试剂盒，其包括(a)包括选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3、 和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，卵形疟虫抗原，三日疟虫抗原和恶性疟虫抗原，和(b)包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体的缀合物。在第十八个方面，本发明涉及用于检测测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的试剂盒，其包括a)抗抗体和b)包括选自SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3 JPSEQ ID NO: 2的氨基酸2_50的氨基酸序列的抗原，卵形疟虫抗原，三日疟虫抗原和恶性疟虫抗原，和b)包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体的缀合物。在第十九个方面，本发明进一步涉及用于检测测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的试剂盒，其包括(a)抗抗体和(b)包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的，包含选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 JPSEQ ID N0:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原的第一种缀合物，包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的卵形疟虫抗原的第二种缀合物；包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的三日疟虫抗原的第三种缀合物，和包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的恶性疟虫抗原的第四种缀合物。在第二十个方面，本发明涉及在怀疑包含抗体的测试样品中检测间日疟虫抗体的存在的方法，其包括步骤
(a)在足以允许抗抗体/间日疟虫抗体复合物形成的时间和条件下，使测试样品与抗抗体接触；
(b)在足以允许抗原与结合的抗体结合的时间和条件下，将抗原添加到所得到的抗抗体/间日疟虫抗体复合物中，其中所述抗原包括选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列，其中所述抗原与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着；和
(c)通过检测由信号生成化合物生成的信号的存在，检测测试样品中可以存在的抗体的存在。附图
简述
图IA显示最佳化间日疟虫“输出蛋白1”(EXPl)基因(SEQ ID N0:1)的多核苷酸序列。图IB显示由图IA中所示的EXPl基因(SEQ ID NO: 1)编码的EXPl蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID N0:2)。图IC显示构成图IB中所示EXPl蛋白质(SEQ ID NO: 2)的C末端部分的合成片段(SEQ ID N0:3)。图2显示实施例9中所述的测定形式。发明详述
本发明涉及由间日疟虫设计的新核酸和多肽序列。此种核酸序列和多肽可以用于诊断以及治疗目的。多核苷酸序列和所编码的多肽
本发明人发现抗EXPl抗体在间日疟虫感染后数天或数周内存在。这些抗体看起来不持久，因为它们在得自数年前从疟疾恢复的个体的血清样品中难以检测到。因此，抗EXPl IgG是近期感染的标记，这对于在近期到疟疾地方性地区旅行的供血者中的抗体鉴定是关键的。本发明部分涉及例如对于检测受试者的间日疟虫感染有用的新多核苷酸和多肽。 本发明的多核苷酸和多肽对于鉴定近期受间日疟虫感染的那些受试者特别有用。因此，本发明提供了诊断工具，以及筛选来自受试者的样品例如组织包括例如血液的工具。检测近期间日疟虫感染允许从血液供给中去除不适宜的采集的血液，从而保护接受受试者。本发明具有下述优点EXP1重组多肽可以用于在感染数天或数周内特异性检测受间日疟虫感染的个体的血清或血浆中的抗体。因此，作为早期(急性)期感染的标记，EXPl 多肽具有鉴定近期暴露于间日疟虫的个体的能力。因为这些个体可能是供血者，所以在血清转变后不久的抗体检测减少了输血传播的疟疾的危险。本发明人通过下述完成本发明精确预测编码间日疟虫EXPl多肽的C末端部分的多核苷酸序列，且随后测试所编码的多肽结合抗EXPl抗体包括来自从受试者中收获的样品的那些抗体的能力。在一个实施方案中，与氨基末端CKS序列融合且在间接ELISA中使用的重组EXPl 多肽检测受间日疟虫感染的个体中的抗EXPl IgG和IgM抗体。在一个实施方案中，将本发明的重组EXPl多肽包被到固相支持体上且用于捕获血清或血浆中存在的抗体。抗免疫球蛋白缀合物用于检测结合的免疫球蛋白。通过与恶性疟虫和约氏疟虫蛋白质的序列同源性，且通过鉴定来自间日疟虫基因组序列的潜在剪接位点，预测对于间日疟虫编码EXPl蛋白质的序列。关于间日疟虫EXPl合成基因的本发明多核苷酸序列显示于图IA (SEQ ID NO: 1)中，并且所编码的氨基酸序列显示于图IB (SEQ ID N0:2)中；这些序列也显示于表A中，所述表A还指出特异性特征。该基因包含5’-EcoRI位点，随后为起始密码子(有下划线的)，编码间日疟虫EXPl的预测的C 末端氨基酸序列的基因主体，编码组氨酸标签的序列(M体的\终止密码子(粗体)和BamHI 位点。限制酶位点用于克隆到表达载体内，并且包括组氨酸标签以促进所表达蛋白质的后续纯化。本发明的组合物和方法包括其中去除组氨酸标签的未修饰的多核苷酸和多肽序列，以及缺乏起始甲硫氨酸和His标签的那些多肽，例如SEQ ID N0:3的那种。本发明还涉及包括氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID N0:2或3的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:2的残基2-50至少约70%等同、优选至少约80%等同、且更优选至少约90%等同。本发明包含本文描述的全长多肽的“片段”和“肽”。此种肽代表具有例如特异性免疫原性或结合特性的多肽部分。片段长度可以是3-10个氨基酸、10-20个氨基酸、20-40 个氨基酸、40-56个氨基酸或甚至更长。与本文描述的片段具有至少70%氨基酸同一性、优选至少80%氨基酸同一性、且更优选至少90%同一性的氨基酸序列也包括在本发明的范围内。“表位”是多肽的抗原决定簇。表位可以包括对于表位独特的在空间构象中的至少 3个氨基酸。一般地，表位由至少5个此种氨基酸组成，并且更通常地，由至少8 - 10个氨基酸组成。此外，本发明涵盖本发明的核酸序列的片段和衍生物，以及本发明的氨基酸序列的片段和部分。本发明还涵盖本发明的序列的功能等价物(即编码具有例如所编码蛋白质相同的结合亲和力、表位等的蛋白质的多核苷酸序列)。本发明还涉及检测近期间日疟虫感染的方法，其中就抗间日疟虫EXPl抗体的存在分析来自受试者的测试样品。使用抗EXPl抗体检测近期间日疟虫感染是有效的，这是因为抗EXPl多肽抗体处于其最高滴度且在近期感染的受试者中最容易检测，但滴度随着时间过去降低至通常无法检测的水平。使测试样品与EXPl多肽接触，并且随后检测EXPl多肽通过测试样品中存在的抗体的结合。在一个实施方案中，EXPl多肽与底物连接。定义
“特异性杂交”指核酸与第二种核酸可检测且特异性结合的能力。在使通过非特异性核
酸的可检测结合的可估计量降到最低的杂交和洗涤条件下，多核苷酸与靶核酸链特异性杂 、-父。“靶序列，，或“靶核酸序列，，意指编码间日疟虫EXPl多肽的核酸序列或其互补体， 其使用例如互补多核苷酸扩增、检测或两者。另外，虽然术语靶序列有时指双链核酸序列； 但靶序列还可以是单链的。在其中靶是双链的情况下，本发明的多核苷酸引物序列优选扩增靶序列的2条链。“测试样品”意指得自受试者的样品或生物学流体，其中样品可以包含间日疟虫多肽或抗间日疟虫多肽抗体。测试样品可以得自任何来源，例如组织、血液、唾液、痰、粘液、 汗、尿、尿道拭子、子宫颈拭子、泌尿生殖或肛门拭子、结膜拭子、眼睛晶状体流体、脑脊液等。测试样品可以(i)如得自来源那样直接使用；或(ii)在预处理后使用，以修饰样品的特征。因此，测试样品可以在使用前进行预处理，通过例如由血液制备血浆或血清，破裂细胞或病毒颗粒，由固体材料制备液体，稀释粘性流体，过滤液体，添加试剂，纯化核酸等。“受试者”包括哺乳动物、鸟类或爬行动物。受试者可以是牛、马、犬、猫或灵长类动物。受试者还可以是人。受试者可以是活的或死的。“多核苷酸”是核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、修饰的RNA或DNA、或RNA或 DNA模拟物(例如PNAs)及其衍生物和其同源物的核酸聚合物。因此，多核苷酸包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(主链)键组成的聚合物，以及相似作用的具有非天然存在部分的聚合物。此种修饰或取代的核酸聚合物是本领域众所周知的且用于本发明的目的， 被称为“类似物”。寡核苷酸一般是约10到最高达约160或200个核苷酸的短多核苷酸。“变体多核苷酸”或“变体核酸序列”意指与SEQ ID NO: 1的核酸序列具有至少约 60%核酸序列同一性，更优选至少约 61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、 70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 核酸序列同一性，且更加优选至少约99%核酸序列同一性的多核苷酸。变体不包含天然核苷酸序列。 其他变体多核苷酸包括这样的，其与SEQ ID NO :1不同，但由于遗传密码的冗余，编码SEQ ID No 2或3、或SEQ ID No 2的氨基酸2_50的多肽，其变体的片段。一般地，变体多核苷酸长度至少约8个核苷酸，经常长度至少约9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 30、35、40、45、50、55、60 个核苷酸， 或甚至长度约75-200个核苷酸或更多。就核酸序列而言的“百分比(％ )核酸序列同一性”定义为，在比对序列和若需要则引入缺口，以达到最大限度的百分比序列同一性后候选序列中与目的序列中的核苷酸等同的核苷酸百分比。为了测定％核酸序列同一性目的的比对可以以在本领域技术内的各种方式达到，例如使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括达到在被比较的序列全长上的最大限度比对所需的任何算法。当比对核苷酸序列时，对于、关于或针对给定核酸序列D的给定核酸序列C的％核酸序列同一性(其可以可替代地用短语表示为具有或包括对于、关于或针对给定核酸序列D 的特定％核酸序列同一性的给定核酸序列C)可以如下计算
%核酸序列同一性=W/Z ■ 100 其中
W是通过序列比对程序或算法的C和D比对评分为等同匹配的核苷酸数目禾口
Z是D中的核苷酸总数目。当核酸序列C的长度不等同于核酸序列D的长度时，C与D的％核酸序列同一性将不等同于D与C的％核酸序列同一性。“基本上由具有％序列同一性的多核苷酸组成”意指多核苷酸在长度中没有相当大不同，但在序列中可能相当大地不同。因此，基本上由与100个核苷酸的已知序列“B”具有至少80%序列同一性的多核苷酸组成的多核苷酸“A”意指多核苷酸“A”约IOOfnts 长，但最高达20个nts可以与“B”序列不同。正被讨论的多核苷酸序列可以更长或更短， 这是由于末端的修饰，例如1-15个核苷酸的添加，以产生特定类型的探针、引物和其他分子工具等，例如当添加基本上非等同的序列以产生预期二级结构时的情况。当序列通过“基本上由……组成”修饰时，此种非等同核苷酸在序列同一性计算中不予以考虑。单链DNA与互补片段杂交的特异性由反应条件的严格性决定。杂交严格性随着形成DNA双链体的倾向降低而增加。在核酸杂交反应中，可以选择严格性以支持特异性杂交 (高严格性)。较不特异的杂交(低严格性)可以用于鉴定相关但并非确切的DNA分子(同源但并非等同)或区段。DNA双链体通过下述得到稳定(1)互补碱基对数目，(2)碱基对类型，(3)反应混合物的盐浓度(离子强度)，(4)反应温度，和(5)降低DNA双链体稳定性的特定有机溶剂例如甲酰胺的存在。通常方法是改变温度更高的相对温度导致更严格的反应条件。(Ausubel 等人，1987)提供杂交反应的严格性的极佳解释。在“严格条件”下的杂交意指其中彼此至少60%同源的核苷酸序列保持杂交的杂交规程。多核苷酸可以包括其他附加基团，例如肽(例如用于在体内靶向宿主细胞受体)， 或促进跨越细胞膜的转运的试剂。此外，寡核苷酸可以用杂交触发的切割试剂(van der Krol等人，1988)或嵌入剂(intercalating agents) (Zon，1988)进行修饰。寡核苷酸可以与另一种分子缀合，例如肽、杂交触发的交联剂、转运试剂、杂交触发的切割试剂等。有用的多核苷酸类似物包括具有修饰的主链或非天然核苷间键的聚合物。修饰的主链包括保留主链中的磷原子的那些，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、 磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，以及不再具有磷原子的那些，例如通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。修饰的核酸聚合物(类似物)可以包含一种或多种修饰的糖部分。其中核苷酸单位的糖和核苷间键由新基团替换的作为RNA或DNA模拟物的类似物也是有用的。在这些模拟物中，维持碱基单位用于与靶序列杂交。已显示具有极佳杂交性质的此种模拟物的例子是肽核酸(PNA) (Buchardt等人，1992 ；Nielsen等人，1991)。核苷酸的范畴包括其中核酸分子已通过取代、化学、酶促或其他合适方法用除天然存在的核苷酸外的部分共价修饰的衍生物。SEQ ID NO: 1的多核苷酸可以通过常规技术进行制备，例如使用商购可得设备的固相合成，例如可从 Applied Biosystems USA Inc. (Foster City, CA ；USA), DuPont (Wilmington, DE ；USA)或 Milligen (Bedford, MA ；USA)获得的那种。修饰的多核苷酸例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物还可以通过本领域已知的相似方法容易地制备(Fino，1995 ； Mattingly,1995 ；Ruth,1990)。“2个氨基酸序列之间的同一性”定义为在2个序列中一系列确切相同或不变的氨基酸残基的存在(参见上文关于核酸序列之间的同一性的定义)。“互补性”和“同一性”的定义是本领域普通技术人员众所周知的。“由……编码”指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分包含来自由核酸序列编码的多肽的至少3个氨基酸、更优选至少8个氨基酸、且甚至更加优选至少15 个氨基酸的氨基酸序列。本发明还涵盖分离的多核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID Nos:2和3的那种相似的功能活性的多肽，并且在中等严格条件下可与具有这样的核酸序列的多核苷酸杂交，所述核酸序列包括上文描述的核苷酸序列或与上文描述的核苷酸序列互补。术语“其为功能上等价的片段或亚片段”和“功能上等价的片段或亚片段”在本文中可互换使用。这些术语指分离的核酸片段的部分或子序列，其中改变基因表达或产生某一表型的能力被保留，无论片段或亚片段是否编码活性酶。例如，片段或亚片段可以用于嵌合构建体的设计中，以在转化的植物中产生所需表型。通过在相对于启动子序列的合适方向中连接核酸片段或其亚片段，可以设计嵌合构建体用于在共抑制或反义中使用，无论它是否编码活性蛋白质。术语“同源性”、“同源的”、“基本上相似的”和“基本上对应”在本文中可互换使用。 它们指核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基中的改变不影响核酸片段介导基因表达或产生某一表型的能力。这些术语还指本发明的核酸片段的修饰，例如一个或多个核苷酸的缺失或插入，其基本上不改变所得到的核酸片段相对于最初的、未修饰的片段的功能特性。因此理解如本领域技术人员将认识到的，本发明涵盖超过本文描述的具体示例性序列。“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，包括在编码序列前(5’非编码序列)和后 (3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”指如在自然界中与其自身调节序列一起发现的基因。相比之下，“嵌合构建体”指在自然界中正常未一起发现的核酸片段的组合。因此，嵌合构建体可以包括衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或衍生自相同来源但以与自然界中正常发现的那种不同的方式排列的调节序列和编码序列。(术语“分离的”意指序列从其天然环境中取出。)
“外来”基因指在宿主生物中正常未发现，但通过基因转移引入宿主生物内的基因。外来基因可以包含插入非天然生物内的天然基因，或嵌合构建体。“转基因”是已通过转化程序引入基因组内的基因。如本文使用的，“探针”或“引物”是长度至少8个核苷酸且与靶序列形成杂交体结构的多核苷酸，这是由于探针或引物中的至少一个序列与靶区域中的序列的互补性。探针的多核苷酸区可以由DNA和/或RNA和/或合成核苷酸类似物组成。优选地，探针不包含与在聚合酶链反应过程中用于引发靶序列的一个或多个序列互补的序列。“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调节序列”指定位于编码序列上游(5’非编码序列)、之内或下游(3’非编码序列)，并且影响所结合的编码序列的转录、RNA 加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括但不限于启动子、翻译前导序列、 内含子和聚腺苷酸化识别序列。“启动子”(或“调节序列”)指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。启动子序列例如由近侧和更远侧的上游元件组成，后面一种元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的固有元件或插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。调节序列(例如启动子)还可以定位于基因的转录部分内，和/或转录的序列的下游。启动子可以整体衍生自天然基因，或可以由衍生自在自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包括合成DNA区段。本领域技术人员应当理解不同启动子可以指导在不同组织或细胞类型中，或在不同发育阶段，或响应不同环境条件的基因表达。导致基因在大多数宿主细胞类型中、在大多数时间表达的启动子通常称为 “组成型启动子”。在植物细胞中有用的各种类型的新启动子不断被发现；众多例子可以在 Okamura等人(1989) (Okamura和Goldberg，1989)中的汇编中找到。进一步认识到因为在大多数情况下调节序列的确切边界仍未完全限定，所以具有一些变异的DNA片段可以具有等同的启动子活性。“内含子”是在基因中不编码蛋白质序列的部分的间插序列。因此，此种序列转录成RNA但随后被切割且不翻译。该术语还用于切割的RNA序列。“外显子”是被转录且在衍生自基因的成熟信使RNA中发现的基因序列的部分，但不一定是编码最后基因产物的序列部分。“翻译前导序列”指定位于基因的启动子序列和编码序列之间的DNA序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可以影响初级转录物加工为mRNA，mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的例子已得到描述(Turner和 Foster,1995)。
“3’非编码序列”指定位于编码序列下游的DNA序列，且包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。聚腺苷酸化信号通常通过影响聚腺苷酸区(tract)添加到mRNA前体的3’末端进行表征。不同3’非编码序列的使用由 hgelbrecht 等人，(1989)/ ^ Cell 1:671-680 例示。"RNA转录物”指起因于RNA聚合酶催化的DNA序列转录的产物。当RNA转录物是 DNA序列的绝对互补拷贝时，它称为初级转录物，或它可以是衍生自初级转录物的转录后加工的RNA序列且称为成熟RNA。“信使RNA (mRNA)”指不含内含子且可以通过细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补且使用酶逆转录酶由mRNA模板合成的DNA。cDNA 可以是单链的或使用DNA聚合酶I的克列诺(Klenow)片段转变成双链形式。“有义”RNA指包括mRNA且可以在细胞内或在体外翻译成蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补且阻断靶基因表达的RNA转录物(美国专利号5，107，065)。 反义RNA的互补性可以是与特异性基因转录物的任何部分的，即在5’非编码序列、3’非编码序列、内含子或编码序列。“功能RNA”指反义RNA、核酶RNA或可以不被翻译但仍对细胞过程有作用的其他RNA。术语“互补体”和“反向互补体”就mRNA转录物而言在本文中可互换使用，并且意欲限定信息的反义RNA。“内源RNA”指在用本发明的重组构建体转化，无论是天然存在还是非天然存在的， 即通过重组方法、诱变等引入前，由宿主的基因组中存在的任何核酸序列编码的任何RNA。“非天然存在的”意指人工的，与在自然界中正常发现的那种不一致。“可操作地连接的”指在单个核酸片段上核酸序列的结合，从而使得一种的功能由另一种调节。例如，当启动子能够调节编码序列的表达时，启动子与那种编码序列可操作地连接(即编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以在有义或反义方向与调节序列可操作地连接。在另一个例子中，本发明的互补RNA区可以直接或间接地在靶mRNA 5’，或在靶mRNA 3’，或在靶mRNA内可操作地连接，或第一个互补区在靶mRNA 5’，并且它的互补体在靶 mRNA 3’。如本文使用的，“表达”指功能终产物的产生。基因的表达涉及基因的转录和mRNA 翻译成前体或成熟蛋白质。“反义抑制”指能够抑制靶蛋白质表达的反义RNA转录物的产生。“共抑制”指能够抑制等同或基本上相似的外来或内源基因表达的有义RNA转录物的产生(美国专利号5，231,020)。“成熟”蛋白质指翻译后加工的多肽；即，初级翻译产物中存在的任何前肽或肽原已去除的那种。“前体”蛋白质指mRNA翻译的初级产物；即其中前肽和肽原仍存在。前肽和肽原可以是但不限于细胞内定位信号。“稳定转化”指核酸片段转移到宿主生物的基因组内，从而导致遗传上稳定的遗传。相比之下，“瞬时转化”指核酸片段转移到宿主生物的核或含DNA细胞器内，从而导致无整合或稳定遗传的基因表达。包含转化的核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物。如本文使用的，术语“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，且在Sambrook等人(1989) (Sambrook, 1989)(下文“Sambrook”)中更全面地描述。“重组体”指2个否则分离的序列区段的人工组合，例如通过化学合成或通过经由基因工程技术操作核酸的分离的区段。
“PCR”或“聚合酶链反应”是用于合成大量特定DNA区段的技术，由一系列重复的循环组成(Perkin Elmer Cetus hstruments，Norwalk，CT)。一般地，使双链 DNA 热变性， 与靶区段的3’边界互补的2个引物在低温退火，并且随后在中间温度延伸。一组这3个连续步骤被称为循环。PCR是通过模板的反复复制，在短时间段内用于将DNA扩增数百万倍的强大技术。 ((Mullis等人，1986);Erlich等人，欧洲专利申请号50，424 ；欧洲专利申请号84，796 ；欧洲专利申请号258，017，欧洲专利申请号237，362 ；欧洲专利申请号201，184，美国专利号 4，683，202 ；美国专利号4，582，788 ；和美国专利号4，683，194)。该方法利用特定体外合成的寡核苷酸组以引发DNA合成。引物的设计取决于待分析的DNA序列。该技术通过在高温使模板解链、允许引物与模板内的互补序列退火，并且随后用DNA聚合酶复制模板的许多循环(通常20-50个)执行。PCR反应的产物通过在琼脂糖凝胶中分离随后为溴化乙锭染色和用UV透照显现进行分析。可替代地，放射性dNIPs可以添加到PCR中，以将标记掺入产物内。在这种情况下，PCR的产物通过使凝胶暴露于χ射线片进行显现。放射性标记的PCR产物的添加的优点是可以定量个别扩增产物的水平。“重组构建体”、“表达构建体”和“重组表达构建体”在本文中可互换使用。这些术语指可以使用本领域技术人员众所周知的标准方法插入细胞的基因组内的遗传材料的功能单位。此种构建体可以自身是载体或可以与载体结合使用。如果使用载体，那么载体的选择取决于将用于转化宿主植物的方法，如本领域技术人员众所周知的。例如，可以使用质粒。技术人员充分知道必须存在于载体上的遗传元件，以成功转化、选择且繁殖包括本发明的任何分离的核酸片段的宿主细胞。技术人员还将认识到不同的独立转化事件将导致不同水平和模式的表达(Jones等人，1985) ;De Almeida, 1989 #47 )，并且因此必须筛选多个事件，以获得展示所需表达水平和模式的系。此种筛选可以通过DNA的Southern分析、 mRNA表达的Northern分析、蛋白质表达的^iestern分析、或表型分析完成。多肽变体
一般而言，多肽变体保持抗原功能，且包括其中在序列中的特定位置上的残基已由其他氨基酸取代的任何变体，并且进一步包括将另外的一个或多个残基插入亲本多肽的2个残基之间的可能性，以及缺失来自亲本序列的一个或多个残基的可能性。“多肽变体”意指与全长天然序列或全长多肽序列的片段具有至少约70%氨基酸序列同一性的，包括SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3、或SEQ ID NO:2的残基2_50的氨基酸序列的多肽。例如，多肽变体包括其中一个或多个氨基酸残基在全长天然氨基酸序列的N或C 末端上添加或缺失的那些。多肽变体将与全长序列具有至少约71% -75%氨基酸序列同一性；至少约76% -79%氨基酸序列同一性；至少约80%氨基酸序列同一性，至少约81%氨基酸序列同一性，至少约 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%氨基酸序列同一性和至少约99%氨基酸序列同一性。通常地，变体多肽长度为至少约10个氨基酸，经常长度至少约20个氨基酸，更经常长度至少约 30、40、50、60、70、80、90、100、150、200 或 300 个氨基酸或更多。“百分比(％ )氨基酸序列同一性”定义为，当比对2个序列时，与候选序列中靶序列中的氨基酸残基等同的氨基酸残基百分比。为了测定％氨基酸序列同一性，比对序列和若需要则引入缺口，以达到最大限度的％序列同一性；保守取代不视为序列同一性的部分。 测定百分比同一性的氨基酸序列比对程序是本领域技术人员众所周知的。可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign (DNASTAR)可以用于比对多肽序列。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括达到在被比较的序列全长上的最大限度比对所需的任何算法。当比对氨基酸序列时，对于、关于或针对给定氨基酸序列B的给定氨基酸序列A 的％氨基酸序列同一性(其可以可替代地用短语表示为具有或包括对于、关于或针对给定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)可以计算为％氨基酸序列同一性=X/Y100
其中
X是通过序列比对程序或算法的A和B比对评分为等同匹配的氨基酸残基数目禾口
Y是B中的氨基酸残基总数目。如果氨基酸序列A的长度不等同于氨基酸序列B的长度时，那么A与B的％氨基酸序列同一性将不等同于B与A的％氨基酸序列同一性。有用的保守取代显示于表B，“示例性取代”中。由此一个类别的氨基酸由相同类型的另一个氨基酸替换的保守取代属于本发明的范围，只要取代不大大改变化合物的生物学活性。如果此种取代导致生物学活性中的改变，那么引入在表C中作为示例指出的更基本的改变，并且就靶序列生物学活性筛选产物。
影响(1)多肽主链的结构，例如β折叠或α螺旋构象、(2)电荷或(3)疏水性、或 (4)靶位点侧链的体积的非保守取代可以修改多肽功能。残基基于如表B中指示的共同侧链特性分成组。非保守取代要求把这些类别之一的成员换成另一个类别。取代可以引入保守取代位点内或更通常引入非保守位点内。
权利要求
1.一种分离的核酸序列或其片段，其包括编码多肽的核酸序列或与编码多肽的核酸序列互补，其中所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 JPSEQ ID N0:2的氨基酸2-50的氨基酸序列具有至少70%同一性。
2.一种分离的核酸序列或其片段，其包括核酸序列或与核酸序列互补，所述核酸序列与包括SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的核酸序列具有至少70%同一性。
3.权利要求1的分离的核酸序列，其中所述序列从间日疟虫中分离。
4.一种纯化的蛋白质，其通过权利要求1的核酸序列编码。
5.一种包括氨基酸序列的纯化的蛋白质或其片段，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2_50的氨基酸序列具有至少70%同一性。
6.一种产生蛋白质的方法，其包括步骤(a)分离包括SEQID NO: 1的核苷酸序列的核酸序列；(b)构建包括与调节序列可操作地连接的分离的核酸序列的载体；和(c)在对于所述蛋白质表达足够的时间和条件下，将所述载体引入宿主细胞内。
7.权利要求6的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
8.一种载体，其包括与调节序列可操作地连接的、包含SEQ ID NO: 1的核酸序列。
9.一种宿主细胞，其包括权利要求8的载体。
10.一种在怀疑包含抗体的测试样品中检测针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤(a)在对于抗体/抗原复合物形成足够的时间和条件下，使所述测试样品与包括氨基酸序列的抗原接触，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2-50 ；和(b)通过检测所述抗体/抗原复合物的存在，检测所述测试样品中存在的抗体的存在。
11.一种在怀疑包含抗体的测试样品中检测针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤(a)在足以允许抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使所述测试样品与包括氨基酸序列的抗原接触，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2-50 ；(b)在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体；和(c)通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中存在的抗体的存在。
12.—种在怀疑包含抗体的测试样品中检测针对间日疟虫的抗体的方法，其包括步骤(a)在足以允许抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使所述测试样品与包括氨基酸序列的抗原接触，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2-50 ；(b)在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的、包含氨基酸序列的抗原，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2-50 ；和(c)通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中存在的抗体的存在。
13.一种在怀疑包含抗体的测试样品中检测间日疟虫抗体的存在的方法，其包括步骤(a)在足以允许抗抗体/间日疟虫抗体复合物形成的时间和条件下，使所述测试样品与抗抗体接触；(b)在足以允许抗原与结合的抗体结合的时间和条件下，将抗原添加到所得到的抗抗体/间日疟虫抗体复合物中，其中所述抗原包括选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列；(c)将缀合物添加到所得到的抗抗体/间日疟虫抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括组合物，所述组合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的单克隆或多克隆抗体；和(d)通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中可以存在的抗体的存在。
14.一种在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、恶性疟虫、间日疟虫和卵形疟虫的抗体的方法，其包括步骤(a)在对于三日疟虫抗体/抗原复合物、恶性疟虫抗体/抗原复合物、间日疟虫抗体/ 抗原复合物、和卵形疟虫抗体/抗原复合物形成足够的时间和条件下，使所述测试样品与下述接触(i)包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，(ii)来自恶性疟虫的抗原，(iii)来自卵形疟虫的抗原，和(iv)来自三日疟虫的抗原；和(b)通过检测一种或多种复合物的存在，检测所述测试样品中存在的抗体的存在。
15.一种在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的方法，其包括步骤(a)在足以允许三日疟虫抗体/抗原复合物、卵形疟虫抗体/抗原复合物、间日疟虫抗体/抗原复合物、和恶性疟虫抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使所述测试样品与下述接触(i)包括选自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，( )卵形疟虫抗原，(iii)三日疟虫抗原，和(iv)恶性疟虫抗原；(b)在足以允许每种缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将4种缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中第一种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的，包括选自SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2_50的氨基酸序列的抗原；第二种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成信号附着的卵形疟虫抗原；第三种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成信号附着的三日疟虫抗原， 并且第四种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的恶性疟虫抗原；和(c)通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中可以存在的针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在。
16.一种在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的方法，其包括步骤(a)在足以允许三日疟虫抗体/抗原复合物、卵形疟虫抗体/抗原复合物、间日疟虫抗体/抗原复合物、和恶性疟虫抗体/抗原复合物形成的时间和条件下，使所述测试样品与下述接触(i)包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，(ii)三日疟虫抗原，(iii)间日疟虫抗原，和(iv)恶性疟虫抗原；(b)在足以允许每种缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将缀合物添加到所得到的抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体；和(c)通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中可以存在的针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫抗体的抗体的存在。
17.一种用于在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的方法，其包括步骤(a)在足以允许抗抗体/间日疟虫、抗抗体/三日疟虫、抗抗体/卵形疟虫、和抗抗体/ 恶性疟虫复合物形成的时间和条件下，使所述测试样品与抗抗体接触；(b)在足以允许抗原与结合的抗体结合的时间和条件下，将第一种抗原、第二种抗原、 第三种抗原和第四种抗原添加到所得到的抗抗体/间日疟虫、抗抗体/三日疟虫、抗抗体/ 卵形疟虫、和抗抗体/恶性疟虫复合物中，其中(i)所述第一种抗原包括选自SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2_50的氨基酸序列；(ii)所述第二种抗原包括卵形疟虫抗原；(iii)所述第三种抗原包括三日疟虫抗原；和(iv)所述第四种抗原包括恶性疟虫抗原；(c)在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将第一种缀合物、第二种缀合物、第三种缀合物和第四种缀合物添加到所得到的抗抗体/抗体/抗原复合物中，其中所述缀合物各与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着；并且(i)所述第一种缀合物包括包含针对间日疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体的组合物；(ii)所述第二种缀合物包括包含针对卵形疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体的组合物；(iii)所述第三种缀合物包括包含针对三日疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体的组合物；(vi)所述第四种缀合物包括包含针对恶性疟虫抗体/抗原复合物产生的单克隆或多克隆抗体的组合物；和(d)通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中可以存在的抗体的存在。
18.一种用于在怀疑包含至少一种抗体的测试样品中检测针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的方法，其包括步骤(a)使所述测试样品与抗抗体接触，以允许形成抗抗体/抗体复合物；(b)在足以允许缀合物与结合的抗体结合的时间和条件下，将第一种缀合物、第二种缀合物、第三种缀合物和第四种缀合物添加到所得到的抗抗体/抗体复合物中，其中所述第一种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的，包含选自SEQ ID NO:2、 SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2_50的氨基酸序列的抗原，其中所述第二种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的卵形疟虫抗原，其中所述第三种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的间日疟虫抗原，并且其中所述第四种缀合物包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的恶性疟虫抗原；和(C)通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在。
19.一种疫苗，其包括选自包括SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 JPSEQ ID N0:2的氨基酸 2-50的氨基酸序列的抗原的至少一种抗原，或其表位。
20.权利要求19的疫苗，其进一步包括选自恶性疟虫、卵形疟虫和三日疟虫的至少一种另外的抗原；和药学可接受的佐剂。
21.一种用于测定测试样品中针对间日疟虫的抗体的存在的试剂盒，其包括(a)包括选自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2_50的氨基酸序列的抗原；和(b)包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体的缀合物。
22.一种用于测定测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的存在的试剂盒，其包括(a)包括选自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，卵形疟虫抗原，三日疟虫抗原和恶性疟虫抗原；和(b)包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的抗体的缀合物。
23.一种用于检测测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的试剂盒，其包括(a)抗抗体；和(b)包括选自SEQID N0:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列的抗原，卵形疟虫抗原，三日疟虫抗原和恶性疟虫抗原。
24.—种用于检测测试样品中针对三日疟虫、卵形疟虫、间日疟虫和恶性疟虫的抗体的试剂盒，其包括(a)抗抗体，和(b)包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的，包含选自SEQID NO:2,SEQ ID N0:3 JPSEQ ID NO:2的氨基酸2_50的氨基酸序列的抗原的第一种缀合物，包括卵形疟虫抗原的第二种缀合物；包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的三日疟虫抗原的第三种缀合物，和包括与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着的恶性疟虫抗原的第四种缀合物。
25.—种在怀疑包含抗体的测试样品中检测间日疟虫抗体的存在的方法，其包括步骤(a)在足以允许抗抗体/间日疟虫抗体复合物形成的时间和条件下，使所述测试样品与抗抗体接触；(b)在足以允许抗原与结合的抗体结合的时间和条件下，将抗原添加到所得到的抗抗体/间日疟虫抗体复合物中，其中所述抗原包括选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3、和SEQ ID NO:2的氨基酸2-50的氨基酸序列，其中所述抗原与能够生成可检测信号的信号生成化合物附着；和(c)通过检测由所述信号生成化合物生成的信号的存在，检测所述测试样品中可以存在的抗体的存在。
全文摘要
本发明涉及针对间日疟虫的EXP1的新多核苷酸和多肽，和在受试者中的间日疟虫抗体或抗间日疟虫抗体的检测中使用这些多核苷酸和多肽的方法。本发明发现在鉴定近期暴露于间日疟虫中特别有用的应用。
文档编号C07K14/445GK102439033SQ201080022571
公开日2012年5月2日 申请日期2010年3月23日 优先权日2009年3月27日
发明者S. 米尔霍夫 A., J. 迪尔 B., J. 道森 G., G. 伯肯迈尔 L., E. 科菲 R., M. 德塞 S. 申请人:雅培制药有限公司