一种Bt蛋白Cry1Dd1、其编码基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种化蛋白及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素。据FA0 统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14%，病害损失达12%，草害损失达 11%。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。为了减少送 些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的 长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康 带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态 平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来 的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽抱杆 菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。
[0003] 苏云金芽抱杆菌(《acinusiAyrin知eftsis,简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它 的分布极为广泛，在芽抱形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又 名杀虫晶体蛋白（Insectididalciystalproteins,简称ICPs)，ICPs是由C巧^基因编码 的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。目前在农田害虫、森林害虫及卫生 害虫的防治中化已成为化学合成农药的有力替代品，化还是转基因抗虫工程植物重要的 基因来源。
[0004] 自1981年Schn巧f从菌株皿-1中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因W来，人 们已经分离克隆了 500多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它 们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类（CrickmoreN,eiai.MicrobiolMolBiol Rev, 1998, 62:807-813;ht1:p://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/)。一 般而言，CoA 和Cr抑等毒蛋白对鱗翅目害虫有效；其中研究的最多的是和 类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应 用于植物的鱗翅目害虫的防治。苏云金芽胞杆菌W色列亚种化iAyri化?ieftsissubsp. israe知化iis，简称化i)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛用于蚊虫的防 治。同时，分?蛋白具有溶细胞性，对某些Cjt蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性。
[0005]W化杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有 检测到昆虫对化的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试 验中得到证实（McGau曲巧，W.H. 1985.Science. 229:193-195)，原因主要是持续使用 单品种及亚致剂量的化W及化转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的 选择压力。1985年，McGau曲巧报道仓库谷物害虫印度谷頓(/7〇扣3in妃 在Dipel度tsubsp.左化nsiai左皿-1的商品制剂）的选择压力下，繁殖15代后，抗性增 加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中 的小菜蛾对化杀虫剂产生了明显的抗性（T油ashnA,B.E. ,eiai. 1994.Proc.化tl. Acad. Sci. USA.91:4120-4124),上世纪90年代W来，在我国应用化杀虫剂时间较长的深 圳、广州、上海等地，发现化杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯 夏.1996.昆虫学报，39 (3) :238-244;Hofte,比，1988.Appl.化viron. Microbiol. 54: 2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对化及其杀虫晶体蛋白产 生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将 会产生抗性（Schnepf, E.，et al.1998.Mol. Biol. Rev.65 (3):77 5-806)。另外， 有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题，但是蚊虫对其抗性问题不断在实 验室中得到证实，送种情况也可能会在大田中出现（Geor曲iou GP, 1997.Applied and Environmental Microbiology,63: 1095-1101.)。
[0006] 为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力化基因资源是解决送个问题的 有效途径，送对我国的生物防治有着十分重要的意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个目的在于针对上述不足提供一种新的化毒力蛋白资源。
[000引本发明的第二个目的在于提供编码所述蛋白的基因。
[0009] 本发明的第Η个目的在于提供上述蛋白及基因的应用。
[0010] 本发明从四川省成都市地区±壤中分离得到的苏云金芽抱杆菌新菌株ΒΝ23-5， 该菌株已于2014年7月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中必(简称 CGMCC，地址；北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101) 保藏，分类命名为苏云金芽抱杆菌iAyrin知eftsis)，保藏号为CGMCCNo. 9448。
[0011] 通过对BN23-5的毒力测试表明，BN23-5对鱗翅目害虫等具有极高的毒力。根据 C1T7类基因保守序列设计一对特异引物，扩增其基因组DNA，结果表明该菌株中存在C1T7 类基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到基因，其核巧酸序列如序列表 SEQIDNo. 1所示，全长为35(nbp，分析表明，GC含量为39. 62%，编码1167个氨基酸组成 的蛋白。经测定，其氨基酸序列如沈QIDNo. 2所示。在sof忧erry网站采用bacterial sigma7. 0promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化 位点的序列，将其命名为蛋白的氨基酸组成如表1。
[0012] 应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白斯氨基酸序列（SEQ IDNo. 2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋 白的突变序列。例如在非活性区段，将第24位的Gly替换为Ala,在第1122处插入Lys，在 第1120处缺失Gly，而不影响其活性。因此，本发明的化蛋白还包括SEQIDNo. 2 所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与化蛋白同等 活性的由CrWZW/衍生得到的蛋白质。
[0013] 本发明基因包括编码所述蛋白斯核巧酸序列。
[0014] 本发明提供了编码上述化蛋白的基因，其核巧酸序列为： (1) 序列表SEQIDNO. 1所示的核巧酸序列，或 (2) SEQIDNo. 1所示核巧酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核巧酸。
[0015] 此外，应理解，考虑到密码子的简并性W及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术 人员可W根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
[0016] 本发明的基因和蛋白质可W从化菌株BN23-5中克隆或分离得到，或者通过DNA 或肤合成的方法得到。
[0017] 可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达 载体，进而可W通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表 达载体导入宿主，得到转化//基因的转化体，例如农作物或者果树等植物，使其具备抗 虫活性。
[001引在本发明的一个实施例中，化蛋白重组表达载体的获得是通过将 化//基因插入到表达载体祀T-28a(+)上构建得到重组表达载体祀T-1D。
[0019] 此外，还可W通过发酵本发明菌株BN23-5,得到含有估片化//蛋白的发酵液，将其 制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还可W将上述基因转化细菌或真 菌，通过大规模发酵生产本发明化蛋白。
[0020] 本发明还提供了化蛋白在提高植物抗虫性中的应用。
[0021] 本发明提供了化蛋白在培育转基因植物中的应用。
[0022] 本领域技术人员还可W根据本发明公开的基因，将其转化棉花、玉米、水 稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。例如；利用密码子的简并性，将基因 设计具有水稻偏好密码子的基因序列，再将合成的基因序列与载体PCAMBIA1300 连接，通过农杆菌介导转入到水稻基因组中，从而得到具有抗虫活性的转基因水稻品种。
[0023] 本发明提供蛋白是