一对高效编辑水稻waxy基因的talen其识别打靶位点及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和基因工程领域，具体地说，本发明涉及一对高效编辑水稻 WAXY基因的TALEN其识别打祀位点及其应用。
【背景技术】
[0002] 稻米在世界上的种植可追溯到10000年前，有着悠久的历史，同时稻米养活了世 界人口的50%。随着社会生活水平的提高，人民生活水平的不断改善，人们对稻米的要求 从量上逐步转向为质的要求，所W稻米的品质性状越来越受到人们的关注。稻米品质主要 由碼磨品质、外观品质、蒸煮食味品质和营养品质组成。其中蒸煮食味的品质是消费者最为 关必的指标。稻米食用品质的优劣很大程度上与稻米胚乳中直链淀粉和支链淀粉的相对含 量有关。直链淀粉含量高的稻米，米饭回生性大，米粉难W糊化，其米饭质地过硬，巧嚼有渣 感，无弹性，光泽度变差。水稻胚乳中直链淀粉的合成主要是由WAXY基因编码的淀粉颗粒 结合型淀粉合成酶（Granule-boundstarchsynthase,GBSS)控制的。我国科学家在863计 划转基因专项等项目的资助下利用我国自克隆的水稻蜡质（waxy)基因，构建了反义WAXY 基因，并将其成功导入水稻，获得了表现优良的含低直链淀粉含量的高产梗稻或梗懦新品 系。但是反义干扰技术是转录后水平的调控，干扰的效果不彻底，后代中也不稳定。
[0003]近年兴起的TALE(TranscriptionActivator-UkeEffector)基因组编辑 技术可W对基因组特定位点进行精确修饰。TALE最早发现于植物病原体黄单胞菌 狂anthomonas)在感染植物的过程中能特异性结合到DNA上，从而实现对植物基因的相关 调控。TALEN(Transc;riptionActivator-UkeEffectorNucleases),是人工地将带有不 同C-末端TALE的短片段串联起来，并连接到核酸酶化kl的催化结构域上而实现特异序列 的剪切。TALEN由两侧的N-末端及C-末端序列组成和中间十几个串联"蛋白模块"组成， 而送些蛋白模块能特异性识别某段DNA。每个"蛋白模块"包含34个氨基酸，第12和第23 位残基被称作重复可变的RVD值i-Resi化es)位点，每个RVDs仅能识别一个碱基，即NG识 别T，皿识别C，NI识别A，順识别G。不同于其他NHEJ通路基因编辑技术，DSB修复通常 不够精确，并且很容易引入突变而干扰基因功能。由于化kl在二聚体的情况下才表现出活 性，所WTALE化很少出现脱祀效应，但是仍然具有脱祀的报道。
[0004] 目前TALE化技术已经成功应用于酵母、果觸、动物和人类细胞系、拟南芥、烟草和 水稻中。尽管已经应用于多种生物，但是由于选择的识别位点的染色体结构抑制，DNA修饰 或无效表达或者部分TALE化折叠等因素的影响，很多祀点仍然不能被检测到基因修饰或 者效率很低，应用于个体水平上的基因敲除非常有限。本研究通过设计一对TALE化识别水 稻waxy基因的特定位点，能够高效特异性在水稻个体植株中筛选获得定点敲除waxy基因 的植株，从而降低水稻中的直链淀粉含量，通过后代的分离纯化，可W进一步获得纯和waxy 基因突变的水稻新品系，为提高我国的稻米品质奠定了重要的技术基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一对高效编辑水稻WAXY基因的TALEN，其识别打祀位点及 其应用。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种分离的多肤1，所述的多肤1任选自下组：
[0007] (1)具有式la所示氨基酸序列的多肤、具有式Ib所示氨基酸序列的多肤、或其组 合；
[0008] 皿NING順順NG順NING皿NG皿NG皿皿NG,式la;
[0009] 順順NGNING皿皿皿NINI順皿順NG皿皿NGNG,式扣
[0010] 各式中，NI、NG、皿、順分别代表识别A、T、G、C碱基的TALEN短片段；
[0011] (2)与式la或式扣所示氨基酸序列的多肤同源性>90%，较佳地>95%，更佳地 > 98%，最佳地> 99%的多肤，且所述多肤特异性识别水稻Waxy基因的核巧酸序列。
[0012] 在另一优选例中，NI的氨基酸序列如SEQIDNO. : 1所示；NG的氨基酸序列如SEQ IDNO. : 2所示；皿的氨基酸序列如SEQIDNO. : 3所示；順的氨基酸序列如SEQIDNO. : 4 所示。
[0013] 优选地，所述的多肤1具有选自下组的功能：
[0014] (1)式la多肤特异性地识别序列如SEQIDNO:20所述的多核巧酸，或如SEQID N0:20所述的多核巧酸经一个或多个（较佳地2个）核巧酸取代所衍生的多核巧酸；其中， 所述衍生的多核巧酸是其他水稻植株中对应于SEQIDNO:20的多核巧酸；或
[001引 似式扣多肤特异性地识别序列如SEQIDNO:21所述的多核巧酸，或如SEQID N0:21所述的多核巧酸经一个或多个（较佳地2个）核巧酸取代所衍生的多核巧酸；其中， 所述衍生的多核巧酸是其他水稻植株中对应于SEQIDN0:21的多核巧酸。
[0016] 本发明的第二方面，提供了一种分离的多核巧酸1，所述的多核巧酸1选自下组：
[0017] (1)编码权利要求1所述多肤1的多核巧酸；
[0018] (2)由SEQIDNO. :5、6、7、8所示核巧酸序列拼接而成的编码权利要求1所述多肤 的多核巧酸；
[001引 做与似中所示核巧酸序列的同源性>90%，较佳地>95%，更佳地>98%，最 佳地> 99%的多核巧酸；
[0020] (4)与上述（1)-(3)互补的多核巧酸。
[0021] 本发明的第Η方面，提供了一种分离的多肤2,所述的多肤2包括；本发明第一方 面所述的多肤1，和位于所述多肤1两端的转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的Ν端和 C端；
[0022] 优选地，所述转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的Ν端和C端为天然的或人 工改造的序列；
[002引较佳地，所述的多肤2选自下组：
[0024] (1)具有SEQIDΝ0:9或SEQIDNO: 10所示氨基酸序列的多肤；或
[002引 似与569 10^:9或569 10^:10所示氨基酸序列的多肤同源性>90%，较佳 地> 95%，更佳地> 98%，最佳地> 99%的多肤。
[0026] 本发明的第四方面，提供了一种分离的多核巧酸2,所述的多核巧酸2选自下组：
[0027] (1)编码权利要求3所述多肤2的多核巧酸；
[0028]似具有SEQIDNO: 11或SEQIDNO: 12所示核巧酸序列的多核巧酸；
[002引 做与SEQIDNO: 11或SEQIDNO: 12所示核巧酸序列的同源性> 90%，较佳地 > 95 %，更佳地> 98 %，最佳地> 99 %的多核巧酸；
[0030] (4)与上述（1)-(3)互补的多核巧酸。
[0031] 本发明的第五方面，提供了一种位点特异性的核酸酶，所述的核酸酶包括：
[0032](i)识别元件，所述识别元件选自下组；权利要求1所述的多肤1，或权利要求3所 述的多肤2,W及
[003引（ω与上述识别元件ω可操作性相连的DNA切割元件；
[0034] 优选地，所述的核酸酶选自下组：
[00对 （1)具有SEQIDNO: 13或SEQIDNO: 14所示氨基酸序列的多肤；或
[003引 似与SEQIDNO: 13或SEQIDNO: 14所示氨基酸序列的多肤同源性> 90%，较 佳地> 95%，更佳地> 98%，最佳地> 99%的多肤。
[0037] 在另一优选例中，所述的DNA切割元件为DNA内切酶。
[0038] 在另一优选例中，所述的DNA切割元件为天然的或人工改造的化klDNA内切酶。
[0039] 在另一优选例中，所述的核酸酶，包括第一核酸酶和第二核酸酶，其中第一核酸酶 的识别元件为式la，而第一核酸酶的识别元件为式扣。
[0040] 本发明的第走方面，提供了一种分离的多核巧酸3,所述的多核巧酸3选自下组：
[0041] (1)编码权利要求5所述核酸酶的多核巧酸；
[0042] 似具有SEQIDNO: 17或SEQIDNO: 18所示核巧酸序列的多核巧酸；
[0043] (3)与沈QIDNO: 17或沈QIDNO: 18所示核巧酸序列的同源性>90%，较佳地 > 95 %，更佳地> 98 %，最佳地> 99 %的多核巧酸；
[0044] (4)与上述（1)-(3)互补的多核巧酸。
[0045] 本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核巧酸1， 和/或本发明第四方面所述的多核巧酸2,和/或本发明第走方面所述的多核巧酸3。
[0046] 本发明的第九方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第八方面 所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核巧酸1，和/或本发明第四方面 所述的多核巧酸2,和/或本发明第走方面所述的多核巧酸3。
[0047] 在另一优选例中，所述的宿主细胞来源于禾本科植物，较佳地，所述的宿主细胞为 水稻细胞。