CloningKit说明进行。
[023引实施例8结果分析
[023引 定点敲除WAXY基因的 5 对TALEN-L和TALEN-R组合中，WAXY-2A、WAXY-3、WAXY-4、 WAXY-7四对组合分别获得转基因抗性苗55、40、47、62株转基因阳性水稻苗，使用祀位点两 侧引物测序检测，均未发现祀位点发生突变。
[0237]WAXY-2B识别位点组合获得了38株具有潮霉素抗性的水稻植株。经过WAXY基因 革己位点检测，发现在编号0S25和0S18植株（测序峰图及序列见图4)中的space区域出现 Ibp和4bp碱基删除。
[023引突变体检测结果如图4所示（方框内表示spacer突变区域）。
[0239] 野生型目标区域正常序列如图4A所示。WAXY-2B位点的TALEN-L和TALEN-R组合 在0S25植株在Spacer区显示有1个碱基的敲除，如图4B所示。WAXY-2B位点的TALEN-L 和TALEN-R组合在0S18植株的Spacer区显示有4个碱基的敲除，如图4C所示。图4D显 示了0S25和0S18与WT植株在祀位点的序列比对结果。
[0240]植株个体水平基因敲除效率为2/38 = 5. 2%，个体水平打祀效率很高。
[0241]利用在线软件galaxy中的TALENoffer化ttp://galax;y2. informatik. uni-halle. de :8976/)程序预测了0S25植株的TALEN打祀位点的10个最有可能的潜在脱 祀位点（如下表所示）。经过PCR扩增，测序比对，发现潜在的脱祀位点均未发生脱祀现象， 表明该位点的特异性很高。
[0242] TALENoffer在水稻基因组中预测10个得分最高的潜在脱祀位点及检测引物如图 5A和图5B所示。
[0243] 上述实验结果表明，识别WAXY-2B位点的一对TALEN组合具非常高的打祀特异性。 为进一步获得WAXY基因纯和突变体，并且不含外源T-DNA成分的的优良水稻品系奠定了重 要的基础。
[0244] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考郝样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，送些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种分离的多肽1，其特征在于，所述的多肽1任选自下组： (1) 具有式la所示氨基酸序列的多肽、具有式lb所示氨基酸序列的多肽、或其组合； HDNINGNNNNNGNNNINGHDNGHDNGHDHDNG，式la; NNNNNGNINGHDHDHDNININNHDNNNGHDHDNGNG,式lb 各式中，NI、NG、HD、NN分别代表识别A、T、G、C碱基的TALEN短片段； (2) 与式la或式lb所示氨基酸序列的多肽同源性彡90%，较佳地彡95%，更佳地 彡98%，最佳地彡99%的多肽，且所述多肽特异性识别水稻Waxy基因的核苷酸序列。2. -种分离的多核苷酸1，其特征在于，所述的多核苷酸1选自下组： (1) 编码权利要求1所述多肽1的多核苷酸； (2) 由SEQIDNO. :5、6、7、8所示核苷酸序列拼接而成的编码权利要求1所述多肽的多 核苷酸； (3) 与（2)中所示核苷酸序列的同源性彡90%，较佳地彡95%，更佳地彡98%，最佳地 > 99%的多核苷酸； (4) 与上述（1)-(3)互补的多核苷酸。3. -种分离的多肽2,其特征在于，所述的多肽2包括：权利要求1所述的多肽1，和位 于所述多肽1两端的转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端； 优选地，所述转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端为天然的或人工改 造的序列； 较佳地，所述的多肽2选自下组： ⑴具有SEQIDN0:9或SEQIDN0:10所示氨基酸序列的多肽；或 (2)与SEQIDN0:9或SEQIDNO: 10所示氨基酸序列的多肽同源性彡90%，较佳地 彡95%，更佳地彡98%，最佳地彡99%的多肽。4. 一种分离的多核苷酸2,其特征在于，所述的多核苷酸2选自下组： (1) 编码权利要求3所述多肽2的多核苷酸； (2) 具有SEQIDNO: 11或SEQIDNO: 12所示核苷酸序列的多核苷酸； (3) 与SEQIDN0:11或SEQIDN0:12所示核苷酸序列的同源性彡90%，较佳地 彡95 %，更佳地> 98 %，最佳地> 99 %的多核苷酸； (4) 与上述（1)-(3)互补的多核苷酸。5. -种位点特异性的核酸酶，其特征在于，所述的核酸酶包括： (i) 识别元件，所述识别元件选自下组：权利要求1所述的多肽1，或权利要求3所述的 多肽2,以及 (ii) 与上述识别元件（i)可操作性相连的DNA切割元件； 优选地，所述的核酸酶选自下组： (1) 具有SEQIDNO: 13或SEQIDNO: 14所示氨基酸序列的多肽；或 (2) 与SEQIDNO: 13或SEQIDNO: 14所示氨基酸序列的多肽同源性彡90%，较佳地 彡95%，更佳地彡98%，最佳地彡99%的多肽。6. 如权利要求5所述的核酸酶，其特征在于，所述核酸酶包括第一核酸酶和第二核酸 酶，其中第一核酸酶的识别元件为式Ia，而第一核酸酶的识别元件为式lb。7. -种分离的多核苷酸3,其特征在于，所述的多核苷酸3选自下组： (1) 编码权利要求5所述核酸酶的多核苷酸； (2) 具有SEQIDNO: 17或SEQIDNO: 18所示核苷酸序列的多核苷酸； (3) 与SEQIDN0:17或SEQIDN0:18所示核苷酸序列的同源性彡90%，较佳地 彡95 %，更佳地> 98 %，最佳地> 99 %的多核苷酸； (4) 与上述（1)-(3)互补的多核苷酸。8. -种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸1，和/或权利要求4所 述的多核苷酸2,和/或权利要求7所述的多核苷酸3。9. 一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求8所述的载体或基因组 中整合有权利要求2所述的多核苷酸1，和/或权利要求4所述的多核苷酸2,和/或权利 要求7所述的多核苷酸3。10. 权利要求1的多肽1，和/或权利要求3所述的多肽2,和/或权利要求5所述的核 酸酶，和/或权利要求2所述的多核苷酸1，和/或权利要求4的多核苷酸2,和/或权利要 求7所述的多核苷酸3的用途，其特征在于，用于制备试剂，所述试剂用于水稻WAXY基因的 定点突变。11. 一种产生权利要求5所述核酸酶的方法，其特征在于，包括步骤：在适合表达的条 件下，培养权利要求9所述的宿主细胞，从而表达出权利要求5所述的核酸酶；和分离所述 核酸酶。12. -种制剂组合物，其特征在于，所述组合物含有：(a)活性成分，以及（b)载体，其 中，所述活性成分（a)选自： (i) 权利要求5所述的核酸酶；或 (ii) 用于表达所述核酸酶的多核苷酸或载体。 优选地，所述载体为水。13. -种水稻WAXY基因打靶方法，其特征在于，包括步骤： (1) 将权利要求2所述的多核苷酸1，和/或权利要求4所述的多核苷酸2,和/或权 利要求7所述的多核苷酸3,和/或权利要求8所述的载体导入水稻靶细胞，获得转化的细 胞；和 (2) 培养步骤（1)所述的转化的细胞，获得靶位点发生突变的水稻细胞，即打靶成功的 细胞。14. 一种水稻植物改良方法，其特征在于，包括步骤： (1) 将权利要求2所述的多核苷酸1，和/或权利要求4所述的多核苷酸2,和/或权 利要求7所述的多核苷酸3,和/或权利要求8所述的载体导入水稻靶细胞，获得转化的细 胞；和 (2) 培养步骤（1)所述的转化的细胞，获得Waxy基因的靶位点发生突变的水稻细胞； (3) 将上一步骤所述的WAXY基因的靶位点发生突变的水稻细胞再生成植株，从而获得 性状改良的水稻植株。15. -种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子选自下组： (1) 序列如SEQIDNO. : 20所示的多核苷酸； (2) 序列如SEQIDNO. : 21所示的多核苷酸； (3) 序列如SEQIDNO. : 22所示的多核苷酸； (4)与（1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。16.权利要求15所述核酸分子的用途，其特征在于，用于提供位点特异性的核酸酶识 别位点。
【专利摘要】本发明提供了一对高效编辑水稻WAXY基因的TALEN其识别打靶位点及其应用。具体地，本发明提供了一种可以对水稻内源的WAXY基因高效打靶的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)基因的，以及用含有该基因的重组质粒进行定向打靶的方法。本发明提供的转录激活子样效应因子核酸酶含有一对转录激活子样效应因子(TALEs)蛋白及分别与其融合的DNA内切酶的催化亚基，具有分别识别并切割水稻内源的WAXY基因上的两个相邻位点的功能。在对TALEs的氨基酸序列进行设计的基础上，合成了编码该TALEN的核苷酸序列及构建了包含该核苷酸序列的载体，通过用TALENs质粒转染细胞，可以大大地提高细胞打靶的效率。
【IPC分类】C12N15/11, C07K14/00, A01H5/00, C12N9/22, C12N15/55, C12N5/04
【公开号】CN105367628
【申请号】CN201410412179
【发明人】王磊, 许奇武, 原辉, 刘远红
【申请人】深圳华大基因科技有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2014年8月19日