[0048] 本发明的第十方面，提供了本发明第二方面所述的多核巧酸1，和/或本发明第四 方面所述的多核巧酸2,和/或本发明第走方面所述的多核巧酸3的用途，用于制备试剂，所 述试剂用于水稻WAXY基因的定点突变。
[0049] 本发明的第十一方面，提供了本发明第一方面所述的多肤1，和/或本发明第Η方 面所述的多肤2,和/或本发明第五方面所述的核酸酶的用途，用于制备试剂，所述试剂用 于水稻WAXY基因的定点突变。
[0050] 在另一优选例中，所述的定点突变包括定点缺失。
[0051] 本发明的第十二方面，提供了一种产生本发明第五方面所述的核酸酶的方法，包 括步骤；在适合表达的条件下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞，从而表达出本发明第 五方面所述的核酸酶；和分离所述核酸酶。
[0052] 本发明的第十Η方面，提供了一种制剂组合物，所述组合物含有；(a)活性成分， W及化）载体，其中，所述活性成分（a)选自：
[0053] (i)本发明第五方面所述的核酸酶；或
[0054] (ii)用于表达所述核酸酶的多核巧酸或载体。
[00巧]优选地，所述载体为水。
[0056] 本发明的第十四方面，提供了一种水稻WAXY基因打祀方法，包括步骤：
[0057] (1)将本发明第二方面所述的多核巧酸1，和/或本发明第四方面所述的多核巧酸 2,和/或本发明第走方面所述的多核巧酸3,和/或本发明第八方面所述的载体导入水稻祀 细胞，获得转化的细胞；和
[0058] (2)培养步骤（1)所述的转化的细胞，获得祀位点发生突变的水稻细胞，即打革己成 功的细胞。
[0059] 在另一优选例中，所述水稻WAXY基因打祀的目标序列如SEQIDNO. 或SEQID NO. : 23 所示。
[0060] 在另一优选例中，所述祀位点发生突变是指在SEQIDNO. : 23中的第9-12位核巧 酸中的一个或多个缺失。
[0061] 优选地，在SEQIDNO. : 23中的第9位核巧酸缺失或者第9-12位核巧酸全部缺失。
[0062] 本发明的第十五方面，提供了一种水稻植物改良方法，包括步骤：
[0063] (1)将本发明第二方面所述的多核巧酸1，和/或本发明第四方面所述的多核巧酸 2,和/或本发明第走方面所述的多核巧酸3,和/或本发明第八方面所述的载体导入水稻祀 细胞，获得转化的细胞；和
[0064] 似培养步骤（1)所述的转化的细胞，获得Waxy基因的祀位点发生突变的水稻细 胞；
[0065] (3)将上一步骤所述的WAXY基因的祀位点发生突变的水稻细胞再生成植株，从而 获得性状改良的水稻植株。
[0066] 在另一优选例中，所述的性状改良包括提高的稻米的懦性。
[0067] 在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
[0068] (4)对上一步骤的再生植株进行选育和传代，从而选出去除步骤（1)中所述外源 基因的水稻植株。
[0069] 在另一优选例中，在步骤（2)中，包括步骤；对转化的细胞检测其Waxy基因是否发 生碱基缺失，并将发生碱基缺失的细胞作为Waxy基因的祀位点发生突变的水稻细胞。
[0070] 本发明的第十六方面，提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子选自下组：
[0071] (1)序列如SEQIDNO. : 20所示的多核巧酸；
[0072] (2)序列如SEQIDNO. : 21所示的多核巧酸；
[007引 （3)序列如SEQIDNO. : 22所示的多核巧酸；
[0074] (4)与（1)-(3)任一所述的多核巧酸互补的多核巧酸。
[0075] 本发明的第十走方面，提供了本发明第十六方面所述的核酸分子的用途，用于提 供位点特异性的核酸酶识别位点。
[0076] 在另一优选例中，所述核酸酶为本发明第五方面所述的所述的核酸酶。
[0077] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可w互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0078] 图1显示了PTAL3载体图谱信息。
[0079] 图2显示了植物表达载体PCMBIA1301的图谱信息。
[0080] 图3显示了TALE化在载体上的位置信息。
[0081] 图4显示了测序峰图及比对结果，其中图4A显示了野生型（WT)的测序峰图，图4B 显示了 0S25植株的测序峰图，图4C显示了 0S18植株的测序峰图，图4D显示了野生型、 0S25和0S18植株的序列比对结果。
[0082] 图5A显示了TALENoffer在水稻基因组中预测10个得分最高的潜在脱祀位点及 检测引物，图5B续图5A。
【具体实施方式】
[0083] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次提供了一种可W对水稻内源的WAXY基因 高效打祀的转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN)基因的人工合成方法，W及用含有该基 因的重组质粒进行定向打祀的方法。
[0084] 本发明提供的转录激活子样效应因子核酸酶含有一对转录激活子样效应因子 (TALES)蛋白及分别与其融合的DNA内切酶的催化亚基，具有分别识别并切割水稻内源的 WAXY基因上的两个相邻位点的功能。在对TALES的氨基酸序列进行设计的基础上，合成了 编码该TALEN的核巧酸序列及构建了包含该核巧酸序列的载体，通过用TALE化质粒转染细 胞，可W大大地提高细胞打祀的效率。在此基础上完成了本发明。
[0085] 术语
[0086] 如本文所用，术语"核酸酶"和"核酸内切酶"可W互换使用，都是指一种人工改造 的核酸内切酶。所述核酸内切酶为单体形式或二聚体形式，其中所述二聚体由二个核酸内 切酶单体所构成。
[0087] 较佳地，所述的、核酸内切酶包括单体1和单体2,每个单体都具有识别元件和切 割元件。其中，DNA识别元件赋予核酸酶的特异性，使核酸酶在DNA特定位点结合，而非特 异性核酸内切酶元件（切割元件）具有剪切功能，使得核酸酶可在DNA特定位点进行定点 断裂。
[0088]当识别结构识别并结合到其特异的祀标位点时，两个融合核酸酶结构域相互靠 近，当两个互补的核酸酶分子间相距适当的距离时化~8bp)，对双链进行切割，形成双链 断裂缺口（doublestrandbreak，DSB)。当细胞内源的非同源末端连接或者通过DNA同源 重组对送一损伤进行修复时，目的基因的有效敲除就可W实现。
[0089] 本发明提供了一种特异性的介导WAXY祀向敲除的核酸酶单体和二聚体，所 述的核酸内切酶单体能够专一性识别沈QIDNO: 20 (CATGGTGATCTCTCCT)，和沈QID NO: 21 (GGTATCCCAAGCGTCCTT)，或其反向互补序列。
[0090] 本发明提供了一种分离的多肤1，所述的多肤1具有选自下组的功能：
[0091] 特异性地识别序列如SEQIDN0:20所述的多核巧酸；特异性地识别序列如SEQID NO:20所述的多核巧酸经一个或多个核巧酸取代所衍生的多核巧酸；特异性地识别序列如SEQIDNO:21所述的多核巧酸；特异性地识别序列如SEQIDNO:21所述的多核巧酸经一 个或多个核巧酸取代所衍生的多核巧酸。
[0092] 在本方面的一个优选例中，所述的多肤1任选自下组；具有式la或式Ib所示氨基 酸序列的多肤；或与式la或式Ib所示氨基酸序列的多肤同源性> 90 %，较佳地> 95 %，更 佳地> 98%，最佳地> 99%的多肤。
[0093] WAXY-2B
[0094] TALEN-L(RVD)
[0095] 皿NING順順NG順NING皿NG皿NG皿皿NG,式la;
[0096] 順順NGNING皿皿皿NINI順皿順NG皿皿NGNG,式扣
[0097] 式中，NI、NG、皿、順分别代表多肤片段，NI的氨基酸序列如SEQIDNO. : 1所示； NG的氨基酸序列如SEQIDNO. : 2所示；皿的氨基酸序列如SEQIDNO. : 3所示；順的氨基 酸序列如沈QIDNO. : 4所示。
[0098] LTPDQVVAIASNIGGKQALETVQ化LP化CQD服（SEQIDNO. :1);
[0099] LTPDQVVAIASNGGGKQALETVQ化LP化CQD服（SEQIDNO. :2);
[0100] LTPDQVVAIAS皿GGKQALETVQ化LP化CQD服（SEQIDNO. :3);
[010" LTPDQVVAIASNNGGKQALETVQ化LP化CQD服（SEQIDNO. : 4)。
[0102] 在本发明的另一实施方式中，式la或式Ib中，NI的编码多核巧酸序列如SEQID NO. : 5所示；NG的编码多核巧酸序列如SEQIDNO. : 6所示；皿的编码多核巧酸序列如SEQ IDNO. : 7所示；順的编码多核巧酸序列如SEQIDNO. :8所示。
[0107] 优选地，所述的多肤1具有选自下组的功能：
[0108] (1)特异性地识别序列如SEQIDNO: 20所述的多核巧酸，或如SEQIDNO: 20所述 的多核巧酸经一个或多个（较佳地2个）核巧酸取代所衍生的多核巧酸；
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