一种促红细胞生成素模拟肽以及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，设及一种促红细胞生成素模拟肤，具体地说，本发明设 及一种能够和促红细胞生成素受体结合并激活促红细胞生成素受体或者能起促红细胞生 成素激动作用的促红细胞生成素模拟肤及其制备方法，本发明还设及所述模拟肤在制备治 疗W缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 促红细胞生成素（&ryt虹opoietin，EP0)是一种糖蛋白激素，分子量约34kD。血 浆中存在的促红细胞生成素由165个氨基酸组成，糖基化程度很高，糖的成分主要是唾液 酸。根据碳水化合物含量不同，天然存在的促红细胞生成素分为两种类型即α型和0 型，其中，α型含34%的碳水化合物，β型含26%的碳水化合物。两种类型在生物学特 性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类促红细胞生成素基因位于7号染色体长22区。 1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重组技术开始大批量生产重组人促红细胞生成 素（recombinanthumaner}ftbopoietin,rH证P0)，广泛用于临床。应用重组DNA技术已 经生物合成出促红细胞生成素巧grie，JC，Strickland,TW，Lane,J等（986)免疫生物学 (Immunobiol)72:213-224)，其是插入到中国仓鼠的卵巢组织细胞（CH0细胞）中并且表达 的克隆的人促红细胞生成素基因的产物。天然存在的人促红细胞生成素首先翻译成含有 166个氨基酸并且166位是精氨酸的多肤链。在翻译后修饰中，用径肤酶裂解掉166位精氨 酸。没有糖基的人邸0的多肤链的分子量是1823抓曰，在完整的促红细胞生成素分子中，糖 基占整个分子量的大约40% (J.Biol.Chem. 262:12059)。
[0003] 促红细胞生成素是最早应用于临床的细胞因子，是迄今所知作用最单一、且安全 可靠的升血红蛋白制剂。对于肾贫血、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤及阵发性夜间血尿等 均有一定疗效；此外，应用促红细胞生成素还可减少手术中的输血量，并能在一定程度上纠 正由恶性肿瘤、化疗及类风湿性关节炎引起的贫血。由于促红细胞生成素主要由肾小管内 皮细胞产生，肾性疾患引起的贫血是促红细胞生成素的首选适应证；促红细胞生成素纠正 肾性贫血的疗效几乎100%，但并不能改善肾功能。促红细胞生成素的治疗安全、有效，适合 长期治疗，也能避免血源紧张。在2006年的全球生物技术药市场上，促红细胞生成素类的 重组药物占了 119亿美元，有巨大的市场容量。
[0004] 早在1989年，美国抑A就正式批准重组人促红素巧P0GEN)用于肾性贫血的治疗， 但直到1992年才在我国上市。我国慢性肾炎的年发病率约为0. 25%，其中相当一部分患者 最终会转为肾衰，每年的肾性贫血患者约50-60万。根据保守的用药量估算，如果按当前的 价格30-40元/支，加上癌症相关性贫血等其他病人的用药，国内市场容量约12-16亿元甚 至更大（病人平均体重按50Kg计算）。自20世纪90年代后期，促红细胞生成素已进入我 国重点城市医院杨销药品行列，2003年在全国重点城市样本医院用药金额6213万元，排名 第56位。2004年，全国重点城市样本医院购药金额增长到8049万元，同比增长了 30%。 阳〇化]促红细胞生成素作为一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化，最终 成熟的内分泌激素，对机体供氧状况发挥重要的调控作用。在胚胎早期，促红细胞生成素由 肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。
[0006] 在促红细胞生成素诱导红祖细胞分化过程中，球蛋白被诱导，运能使细胞吸收更 多的铁合成功能性的血红蛋白，运种功能性的血红蛋白可W和成熟的红血球中的氧结合， 因此，红血球和血红蛋白在提供机体氧方面扮演了极其重要的角色。运一过程是由促红细 胞生成素与红祖细胞的表面受体之间的相互作用引起的。
[0007] 当人体处于健康状态时，组织可W从已经存在的红血球中吸收足够多的氧，此时 体内的促红细胞生成素浓度很低，运种正常的较低的促红细胞生成素浓度完全可W剌激促 进由于年龄的问题而正常损失的红细胞。当循环系统中的依靠红细胞进行氧输送的水平被 降低进而出现缺氧情况时，促红细胞生成素在体内的数量将会增加，机体缺氧状态可W由 W下原因引起的：过量的福射、因高缔度或长期昏迷造成的氧摄入量减少、各种类型的贫血 等等。作为对组织处于缺氧压力的应答，促红细胞生成素水平的提高可W刺激红祖细胞的 分化达到提高红细胞生成的能力。当体内的红细胞的数量大于正常组织的需求时，循环系 统中促红细胞生成素的水平被降低。正是由于促红细胞生成素对于红细胞的生成有着至关 重要的作用，因此运类激素对于治疗和诊断W红细胞生成低下和缺陷为特征的血液病方面 有着很广泛的前景。最近的研究为推测促红细胞生成素疗法在多种疾病、素乱和血液学异 常情况中的效用提供了基础，运些疾病包括：慢性肾衰竭（CR巧患者贫血症的治疗中使用 促红细胞生成素和在艾滋病和接受化疗的癌症患者贫血症的治疗中使用促红细胞生成素 值anna,RP，Ru化ick，SA，Abels,RI，于：MB，Garnick编著，临床应用中的促红细胞生成素一 国际展望巧rythropoietininClinicalApplications-AnInternationalPerspective. MarcelDekker; 1990:p301_324)。
[0008] 促红细胞生成素的部分生物学效应可W通过和细胞膜表面的受体内在作用来 调节。起先，使用从小鼠的脾脏里分离出的未成熟的红细胞来研究细胞表面结合的促 红细胞生成素蛋白时发现，运种蛋白是由两种多聚肤组成，其分子量大约为85000~ 100000邸（Sawyer, et al.(1987)Proc.化tl. Acad. Sci. USA84:3690-3694)由比较详细的 叙述。促红细胞生成素的结合位点的数目也被计算出来了，大约每个细胞膜含有800~ 1000个位点。在运些结合位点中大约有300个结合位点的Kd水平为90pM，而剩下的结合 位点的结合力比较弱，大约有57化M。有研究表明从感染了化iend病毒贫血株的小鼠的脾 脏红细胞对EP0的响应情况发现，大约有400个结合位点，其中Kd水平高的为10化M，Kd水 平低的为8(K)pM。
[0009] 随后的工作就是两种促红细胞生成素受体被单个基因翻录，运个基因已经被克 隆。例如，小鼠和人的促红细胞生成素受体的DNA序列W及编码肤的序列在W090/08822中 已经有叙述。目前的模型表明促红细胞生成素结合到促红细胞生成素受体导致了两个促红 细胞生成素受体的活化和二聚，运种二聚进一步导致了信号传导的开始。
[0010] 促红细胞生成素克隆基因的应用更有助于帮助寻找运些重要受体的激动剂和括 抗剂。某种程度上能够作用促红细胞生成素受体的肤已经被确定和叙述。特别是确定了一 组含有主要肤段的肤，运些肤可W和促红细胞生成素受体结合并能剌激促红细胞生成素细 胞的分化增殖。但是能够刺激红细胞增殖分化的肤的EC50却很低，在20nM和250nM之间， 因此运些肤在临床应用上受到了较大的限制。
【发明内容】
[0011] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种生物活性更好、生物利用度更高的 促红细胞生成素模拟肤或其可药用盐W及它们的制备方法。
[0012] 一方面，本发明的目的是提供一种具有长效促红细胞生成功能的促红细胞生成素 模拟肤或其可药用盐。
[0013] 另一方面，本发明还提供了本发明促红细胞生成素模拟肤的制备方法W及其在用 于制备治疗W缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。
[0014] 本发明的又一方面还提供一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的促红细胞 生成素模拟肤。
[0015] 优选地，本发明药物组合物为注射剂；更优选地，本发明药物组合物为冻干粉针或 溶液注射剂。
[0016] 在一个优选实施方案中，本发明药物组合物还包含药学上可接受的辅料成分。
[0017] 本发明提供了一种具有体内生物活性的促红细胞生成素模拟肤或其可药用盐。
[0018] 所述促红细胞生成素模拟肤是由通式中的赖氨酸（K)通过侧链游离氨基与烷基 酸的簇基缩合而成的，通式如下式I所示；
[0019] GGLYACHMGP口化IVCQPLRSarK-X
[0020] 式I 阳02U 其中， 阳02引化1为3-(1-糞基）A-丙氨酸，其结构式如下：
[0023]
[0024] Sar为肌氨酸，其结构式如下： 阳0巧]
[00%] 两个半脫氨酸形成二硫键，N末端乙酷化，X表示不同长度的氨基酸，如十二烧酸、 十六烧酸等。
[0027] 本发明还提供了所述促红细胞生成素模拟肤的制备方法，所述方法包括W下步 骤：
[0028] 1)根据沈QIDNO: 1选择氨基酸；
[0029] 2)采用DDE保护赖氨酸，使用Fmoc固相多肤合成法合成模拟肤单体；
[0030] 3)采用孤E专用脱保护剂脱去赖氨酸的孤E基团；
[0031] 4)利用赖氨酸侧链上游离的氨基与烧酸偶联。
[0032] 其中，所述的Fmoc固相多肤合成方法是指W聚合物树脂作为固相反应基质，将氨 基端Fmoc保护的氨基酸在偶联