0109] (2)特异性地识别序列如SEQIDNO: 21所述的多核巧酸，或如SEQIDNO: 21所述 的多核巧酸经一个或多个（较佳地2个）核巧酸取代所衍生的多核巧酸。
[0110] CATGGTGATCTCTCCT(SEQIDNO. :20)；
[011"GGTATCCCAAGCGTCCTT(沈QIDNO. : 21)。
[0112] 优选地，式la能够识别SEQIDNO. :20所示的核巧酸序列；式Ib够识别SEQID NO. :21所示的核巧酸序列。
[0113] 本发明还提供编码多肤1的多核巧酸。
[0114] 本发明还提供了一种多肤2,所述的多肤2包括；多肤1和位于多肤1两端的转录 激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端。在另一优选例中，转录激活子样效应因 子氨基酸序列框架的N端和C端为天然的，或人工改造的序列。
[0115] 在本发明的一个优选例中，多肤2任选自下组；具有SEQIDNO:9或SEQIDNO: 10 所示氨基酸序列的多肤；或与SEQIDN0:9或SEQIDN0:10所示氨基酸序列的多肤同源性 > 90%，较佳地> 95%，更佳地> 98%，最佳地> 99%的多肤。
[0116]
[0117]
[0118] 本发明还提供编码多肤2的多核巧酸。
[0119] 在本发明的一个实施方式中，编码所述多肤2的多核巧酸序列如SEQIDNO. : 11 或沈QIDNO. : 12所示。
[0120] 本发明还提供了一种位点特异性的核酸酶及其二元组合物，所述的核酸酶包括： 多肤2和DNA切割元件。所述的DNA切割元件为DNA内切酶，较佳地，DNA切割元件为天然 的或人工改造的化klDNA内切酶。
[0121] 在本发明的一个优选例中，所述的化klDNA内切酶的氨基酸序列如下：
[0122]
[01巧]在本发明的一个优选例中，所述的核酸酶选自下组；具有SEQIDNO: 13或SEQID NO: 14所示氨基酸序列的多肤；或与SEQIDNO: 13或SEQIDNO: 14所示氨基酸序列的多 肤同源性> 90 %，较佳地> 95 %，更佳地> 98 %，最佳地> 99 %的多肤。
[0126]
[0127]
[012引在本发明的一个优选例中，所述的核酸酶二元组合物由2个位点特异性的核酸酶 组成。
[0129] 本发明还提供了编码所述位点特异性的核酸酶及其二元组合物的核巧酸。在本发 明的一个优选例中，所述的核酸酶的编码多核巧酸序列如SEQIDNO. : 17或SEQIDNO. : 18 所示。
[0130] 根据本文所述的多核巧酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本 发明的核酸序列。送些方法例如但不限于；PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨 姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。
[0131] 作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核巧酸序列再进行重叠延伸PCR的 方法来构建本发明的编码核酸序列。
[0132] 本发明还提供了一种载体，它含有多核巧酸1，和/或多核巧酸2,和/或多核巧酸 3。载体可W含有编码本发明的核酸酶的序列W及与之操作性相连的表达调控序列。所述 的"操作性相连"或"可操作地连于"指送样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调 节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，郝么它就 是可操作地连于编码序列。优选地，所述的表达调控序列可W是3flag肤，或用于定位的和 定位信号（化巧。表达载体可采用市售的例如但不限于；PUC18、pIRES、pDR等可用于真核 细胞系统表达的载体。本领域技术人员可W根据宿主细胞来选择合适的表达载体。根据已 知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接， 将本发明的核酸酶编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。
[0133] 本发明还提供了一种宿主细胞，它含有所述的载体或基因组中整合有多核巧酸1， 和/或多核巧酸2,和/或多核巧酸3。所述的宿主细胞可W是原核细胞（如农杆菌细胞） 和真核细胞，优选的是真核细胞，例如但不限于化rkat细胞，CHO,cos细胞，293T细胞，RSF细胞，水稻细胞等。作为本发明的优选方式，所述的宿主细胞为水稻细胞。
[0134] 本发明还提供一种用重组DNA制备本发明核酸酶的方法，包括步骤：
[0135] 1)提供编码本发明核酸酶的核巧酸序列；
[0136] 2)将1)的核巧酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；
[0137] 3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；
[013引4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；
[0139] 5)收集上清液，并纯化核酸酶产物。
[0140] 将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磯 酸巧沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，瞻菌体转导法，碱金属离 子法，腺病毒载体，腺相关病毒载体，慢病毒载体。
[0141] 有关宿主细胞的培养和表达采用常规方法。当采用分泌表达时，可通过离必去除 悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。还可通过琼脂糖凝胶电泳等技术进行鉴定。
[0142] 可将上述制备获得的核酸酶纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈 单一条带。例如，当核酸酶为分泌表达时，可W采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如 采用Millipore、化llicon等公司产品对表达上清进行浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方 法进一步纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析值EAE等）或阳离 子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚醜胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基 团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用居基磯灰石吸附层析，金属莖合层析，疏水相 互作用层析和反相高效液相色谱（RP-HHX)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述 所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。
[0143] 可利用含有所述核酸酶的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的核酸酶 进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变抑等方法 洗脱结合在亲和柱上的融合性多肤。可选择地，所述的核酸酶的氨基端或駿基端还可含有 一个或多个多肤片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可W用于本发明。例如，所述的标 签可W是化AG，HA，HA1，c-Myc，6-His或8-His等。送些标签可用于对核酸酶进行纯化。
[0144] 本方面还提供了一种人WAXY基因打祀方法，包括步骤；将所述的多核巧酸1，和/ 或多核巧酸2,和/或多核巧酸3,和/或所述的载体导入祀细胞，获得转化的细胞；培养所 述的细胞，获得祀位点发生突变的细胞，即打祀成功的细胞。
[0145] 在另一优选例中，所述水稻WAXY基因打祀的目标序列如SEQIDNO. 或SEQID NO. : 23 所示，
[0146]CGGTACGACCAGTAC(沈QIDNO. : 23)。
[0147] 本发明还提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子为任选自下组的多核巧酸： [014引 （1)序列如SEQIDNO. : 20所示的多核巧酸；
[014引 似序列如SEQIDNO. : 21所示的多核巧酸；
[0150] (3)序列如SEQIDNO. : 22所示的多核巧酸；
[0151] (4)与（1)-(3)任一所述的多核巧酸互补的多核巧酸。
[0152]CATGGTGATCTCTCCTCGGTACGACCAGTACAAGGACGCTTGGGATACC(SEQIDNO. :22)
[0153] 本发明还提供了上述核酸分子的用途，用于提供位点特异性的核酸酶识别位点。
[0154] 在另一优选例中，所述核酸酶为根据本发明的核酸酶。
[01巧]试剂组合物
[0156] 本发明还提供了一种组合物，它含有有效量（如0. 000001-90wt% ;较佳的 0.l-50wt% ;更佳的，5-40wt% )的本发明的核酸内切酶单体或二聚体，W及载体。
[0157] 通常，可将本发明的核酸内切酶单体或二聚体配制于无毒的、惰性的和药学上可 接受的水性载体介质中，其中抑通常约为5-8,较佳地，抑约为6-8。
[015引本发明的主要优点在于：
[0159] (1)本发明提供的转录激活子样效应因子核酸酶含有一对转录激活子样效应因子 (TALES)蛋白及分别与其融合的DNA内切酶的催化亚基，具有分别识别并切割水稻WAXY基 因上的位点的功能，并且个体水平打祀效率高；
[0160] 似在对TALES的氨基酸序列进行设计的基础上，本发明还合成了编码该TALEN的 核巧酸序列，构建了包含该核巧酸序列的载体，通过用TALE化质粒转染细胞，可W大大地 提高细胞打祀的效率，直接获得敲除的植株个体。
[0161] (3)本发明的本发明提供的一对转录激活子样效应因子核酸酶在水稻细胞中进行 定点敲除过程中，特异性强，经检测不存在潜在的脱祀效应。
[0162] 下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，送些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条 件如Samb