一种染色体基因的敲除方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，公开了一种染色体基因敲除的方法，与传统的方法 相比，具有快速敲除关键但不致死的基因。利用本发明可W构建基因工程菌，用于医药、生 物工程、环境保护等行业。
【背景技术】
[0002] 基因工程特别是染色体操作是构建具有特殊或特定功能的菌株的关键步骤，是工 业化生产的关键步骤。将相关基因整合到染色体上后才能形成可满足工业上对生产菌株稳 定性的要求，而且可W免除在使用质粒时需要在培养基中加入抗生素的需求及避免由此引 起的相关危害。只有构建送些菌株才能完成自然界先前不存在的一些功能，如生产蛋白质、 肤类药物、糖类和手性化合物等。
[0003] 目前染色体操作主要是利用同源重组技术，将具有某种可筛选的标记如抗生素抗 性等的基因片段整合到染色体上，而达到基因敲除或敲入的目的，但送会将抗生素抗性标 记残留在染色体上。如果不使用抗性标记，则在送一过程中需要进行大量的菌落PCR才能 知道郝些菌落中的染色体基因片段已经被改变或敲除，即达到实验的目的，而且关键基因 敲除或置换的概率很低。有些方法利用瞻菌体的重组酶进行染色体上基因的敲除，尽管送 种方法直接可W用PCR片段进行染色体基因敲除，但会在染色体上留下瞻菌体重组酶的半 个辨认位点及其抗生素标记。用同一方法进行下一轮基因敲除时，会造成随意的基因敲除， 而无法控制所改造菌株的遗传特征，且由于抗生素标记的残留，使对细菌染色体操作的次 数受到限制。
[0004] 根据基因在个体中所起的作用不同，有些基因很容易被敲除或置换，有些基因则 无法敲除，敲除该基因后个体会死亡。有些基因虽然可W被敲除，但因在个体中所起的关键 作用，获得敲除菌株的概率很低，需要进行大量的菌落PCR才能获得所需要的菌株，不仅费 时，而且需要花费大量的人力和物力。
【发明内容】
[0005] 发明的目的在于提供一种方法，可W比较快速的敲除关键但非致死的基因，W构 建具有不同功能的菌株，用于医药、生物工程、环境保护等行业。
[0006] 为了达到上述目的，改造了一种自杀质粒，使其克隆位点仅为Notl，Notl是具有 识别8个碱基的II型内切酶；在同源重组的上下游片段的克隆过程中除了 5'端的Notl位 点外，在3'端设计了甜al和BamHI，用于插入筛选性标记抗生素耐药基因；确定了可W在革 兰氏阳性和阴性细菌均可驱使筛选标记表达的启动子序列；先构建不含有筛选标记的同源 重组质粒获得第一个质粒，然后再将筛选性标记抗生素耐药基因插入其中的甜al和BamHI 位点，获得第2个质粒，用于基因的同源重组置换或敲除。
[0007] 所构建的质粒先通过同源重组的方法，将筛选标记抗生素耐药基因整合到染色体 上，然后通过第二次同源重组将筛选标记抗生素耐药基因从染色体上置换出来，使目的基 因得到改变，且不在染色体上留下然后残留。如此可w进行多个基因的依次敲除或置换。在 本实验的筛选过程中，只通过抗生素耐药标记的获得或丢失就可W提供初步的结果判断， 只有在最后确定结果时，才对少数的几株细菌进行菌落PCR或Southern杂交印迹确证。
[0008] 本发明提供的技术可W比较快速的敲除或置换关键但非致死的染色体基因，且可 W在染色体进行多轮操作，完成对相关基因或代谢通路的改造，构建的菌株可用于医药、生 物工程、环境保护等行业。
【具体实施方式】
[0009]W下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0010] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 实施例中，所涉及到的百分比（％)，若未特别指出，液体之间的百分比为体积百分比，固 体之间的百分比为重量百分比，固体与液体之间的百分比为重量体积比（10%即表示每 100ml液体中含固体lOg)。
[0011] W敲除大肠杆菌的α-丽戊二酸脱氨酶复合体的编码基因敲除为例，说明本发明 的【具体实施方式】。
[001引1.自杀质粒PDS132NT的构建：
[0013] 设计下列引物：
[0014]序列 1 ;5,GCCGAGCGGCCGCTCCCGGGAATTCCACAAATTGTTATCC
[0015]序列 2;5，GCCGAGCGGCCGCCTGGAAGAAGCAGACCGCTAACA
[0016]WPDS132为模板，进行下列扩增反应：
[0017] 10 X Pfu缓冲液 5.0 μ1 dNTP 2mM 5.0 μ1 序列1 2μΜ 5.0 μ1 序列2 2μΜ 5.0 μ1 PDS132 DNA 10纳克/微巧 5.0 μ1 无菌水 24.5 μ1 Pfu(2.5 μ/μL) 0.5μ1
[001引反应程序；94°C2分钟；然后94°C15砂，5(TC15砂，72°C8分钟，循环15次；最后 在72 °C延伸10分钟。
[0019] 所获得的PCR片段经纯化后，用Notl酶切，连接产物转化到细菌中，经过Notl和 化〇1酶切鉴定，酶切获得二个片段者为所需质粒，命名为PDS132NT。
[0020] 2.可在大肠杆菌和枯草杆菌中表达的启动子和卡郝霉素基因的构建。
[002。 设计下列引物，W获得枯草杆菌opuA的启动子：
[0022] 序列 3 ;5,GGATCTCTAGAGAATTCAATTCCAATAAAAGCGTTTTCAAC
[0023]序列 4 ;5,GGATCCATATGATTTTCCCTCCATATTAAGCAATCTTTATTAC
[0024]W枯草杆菌染色体DNA为模板，进行下列扩增反应：
[00巧] 10 X Pfu缓冲液 5.0 μ1 dNTP 2mM 5.0 μ1 序列3 2μΜ 5.0 μ1 序列4 2μΜ 5.0 μ1 染色体DNA 10纳克/徹升 5.0 μ1 无茵水 24.5 μ1 Pfu(2.5 μ/μ^ 0.5μ1
[0026] 反应程序；94°C2分钟；然后94°C15砂，5(TC15砂，72°C1分钟，循环25次；最后 在72 °C延伸10分钟。
[0027] 所获得的PCR片段经纯化，甜al和Ndel酶切后，克隆到经同样酶切处理的祀T32a 质粒中。所获得的质粒命名为祀T32a-〇puA。
[002引序列5 (OpuA启动子）的序列为：
[0029]gaattcAATTCCAATAAAAGCGTTTTCAACTAAAGGTAGGAGAAAAATCACCCGTAAAATACAATCATA TAGGAGGATTACAGAGCATTTAGAAGCATAAATAAGATCATGTGGTCACATGGATGTTTATAAAGAAATGGTACAGA ATAAAAGAGAATATGCTGTTTGTGTGGGAAGTTACATAAATGTTACGGTAATAAAGATTGCTTAATATGGAGGGAAA AT
[0030] W祀T-26b为模板，设计下列引物，克隆其中的卡郝霉素抗性基因：
[0031]序列 6;5，GGATCCATATGAGCCATA