一种简便的细菌基因敲除的方法
【专利摘要】本发明提供了一种细菌基因敲除的方法，包括以下步骤：pSIM19转化E.coliO56，得到含pSIM19的重组E.coliO56；制备含pSIM19的E.coliO56电感受态细胞；以质粒pKD4为模版，PCR扩增带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段，向电感受态细胞重组菌E.coliO56/pSIM19中加入带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高压电击完成后立即加入SOC液体培养基，培养，筛选得到目的基因已经被消除的阳性重组子。本方法非常简便，省去了诱导剂使用浓度摸索等繁琐的环节。
【专利说明】一种简便的细菌基因敲除的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体的是涉及一种简便的细菌基因敲除的方法。
【背景技术】
[0002]同源重组作为体内基因工程的新方法使DNA修饰变得更容易、更有效，它是功能基因组分析的高效方法，可以在没有限制性内切酶和DNA连接酶的情况下实现DNA修饰。
[0003]传统同源重组方法是利用RecA重组系统，但是以RecA同源重组为基础的基因敲除有很大的不足，如需要较长的靶基因同源臂，重组率很低，很难获得所需要的重组子等。1998年，Murphy首次报道了利用λ噬菌体Red重组系统在大肠杆菌染色体上进行基因替换的方法，将λ噬菌体的重组功能基因exo，bet, gam在多拷贝质粒上表达，用于野生型E.coli宿主菌的基因替换。近年来，Red重组以其较短的同源臂和较高的重组效率等优点广泛用于大肠杆菌的基因修饰中。Red同源重组由λ曬菌体的exo, bet, gam 3个基因组成，分别编码Exo、Beta、Gam 3种蛋白质。Exo作为双链核酸外切酶，可以结合在双链DNA.的末端，从5'向3'降解DNA单链，产生3'末端单链悬突(3' single strand DNAoverhangs)。Beta作为单链退火蛋白，结合在由核酸外切酶(Exo)外切产生的3'末端单链悬突上，促进DNA互补链的退火。Gam蛋白作为Exo、Beta的辅助蛋白，可与RecB⑶核酸外切酶结合，抑制RecBCD核酸外切酶活性，抑制体内的外源DNA的降解。RecBCD是高度ATP依赖的双链DNA核酸外切酶，在大肠杆菌中用于基因的同源重组和DNA复制叉的修复。研究表明，Gam蛋白对于反应进行中的RecBCD双链DNA核酸外切酶的抑制作用很小。事实上，Gam蛋白并不能抑制一个正在进行的反应，而是在ATP的存在下分离连在双链DNA末端的 RecBCD。
[0004]对于敲除细菌基因的Red重组系统共需要三种质粒:一种质粒是表达重组酶相关的Exo、Beta、Gam这3种蛋白质的辅助质粒；另一种质粒含有两侧带有翻转酶结合位点(flipase recognition target, FRT)的抗性基因,用作PCR模板；最后一种质粒是抗性基因消除质粒，其含有的重组酶能特异识别FRT位点，从而消除染色体上同源重组的抗性基因。对于整个基因敲除过程中，最重要的是控制同源所需的三个蛋白的表达。表达这三个蛋白的质粒如pKD46、pRedET。这两个质粒均含有温度敏感型复制起始点oriRlOl，在37°C培养时能够正常复制，而高于37°C时会自动丢失。此外，pKD46上还含有ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，它们通过L-阿拉伯糖诱导表达，并携带氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记。而PRedET上调控exo、bet、gam基因的表达的启动子则是Pbad启动子；同样是通过L-阿拉伯糖诱导表达；但是Pbad启动子比ParaB启动子的调控方式更严谨，Pbad启动子同时还受araC基因产物的正调控和负调控，araC作为转录阻遏物可以与L-阿拉伯糖形成复合物，从而启动转录。
[0005]对于敲除细菌基因组中的靶基因目前常选用Red重组系统。不同的质粒上λ噬菌体的重组功能基因exo，bet, gam的表达调控方式不一样。对于选用由L-阿拉伯糖诱导重组功能蛋白表达的质粒，敲除不同基因则需要摸索L-阿拉伯糖的诱导浓度，此过程耗时耗力。
【发明内容】
[0006]基于此，本发明提供一种简便的细菌基因敲除的方法。
[0007]实现上述目的的技术方案如下。
[0008]一种细菌基因敲除的方法，包括以下步骤:(l)pSM19转化E.coli 056得到含PSIM19 的重组 E.coli 056 ；
[0009](3)制备含pSM19的E.coli 056电感受态细胞:挑取重组E.coli 056的阳性克隆，培养，菌体浓度0D_为0.4-0.5时放入42°C水浴摇床中，震荡摇匀后置于冰上冷却后，离心后，用预冷的无菌三蒸水悬浮菌体，分装至2-3管预冷的无菌的EP管中；然后用预冷的无菌超纯水水洗EP管中菌体四次，最后每管加入无菌水，制备到电感受态细胞E.coli056/pS頂19 ；
[0010](3)以质粒PKD4为模版，PCR扩增带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段，向电感受态细胞重组菌E.coli056/pSIM19中加入所述带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高压电击完成后立即加入SOC液体培养基，370C，培养1.5 ±0.2h后，离心后倒掉部分上清，取适量菌体悬浮液涂布含50±2g/mL的卡那霉素抗性平板，培养，长出单菌落，将单菌落划线于含50±2g/mL的卡那霉素抗性平板中，长出较浓菌苔，筛选得到目的基因已经被消除的阳性重组子。
[0011]在其中一个实施例中，所述PSM19转化E.coli 056的步骤为:将质粒加入到E.coli 056感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴；42°C水浴热激90s，迅速转移至冰上，继续冰浴2 ± Imin ;无菌条件下，加入LB培养基，37°C，100 ± IOrpm慢摇，恢复培养I ±0.2h ;离心培养物后取适量培养物涂布含100±2g/mL Amp的固体LB琼脂平板上，待液体被固体培养基吸收后，将平板倒置，37±2°C恒温培养，12-16h，得到含pSM19的重组E.coli 056。
[0012]在其中一个实施例中，步骤(2)中用预冷的无菌超纯水水洗EP管中菌体时，每次均在12000±20rpm，4±l°C的条件下离心1±0.1min以除去超纯水。
[0013]在其中一个实施例中，步骤(3)中PCR扩增带有目的基因WfaQ同源臂的kana基因片段的扩增引物为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2。
[0014]在其中一个实施例中，所述无菌超纯水为MiliQ超纯水。
[0015]对于敲除细菌基因组中的靶基因目前常选用Red重组系统。不同的质粒上λ噬菌体的重组功能基因exo，bet, gam的表达调控方式不一样。对于选用由L-阿拉伯糖诱导重组功能蛋白表达的质粒，敲除不同基因则需要摸索L-阿拉伯糖的诱导浓度，此过程耗时耗力。本发明选用由温度诱导重组功能蛋白表达的温度敏感型质粒PSIM19，从而省去了诱导剂使用浓度摸索这一繁琐的环节。同时，本发明选用MiliQ超纯水作为线性DNA电转缓冲液，洗涤菌体时12000rpm离心lmin，洗涤4_5次即可，相比用10%甘油作为电转缓冲液节省了很多时间。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为pSM19质粒图谱；
[0017]图2为图1菌落PCR验证阳性重组子056/AwfaQ/kana;其中，1:以野生型E.coli056模板；3-11和13:以阳性重组子056/Δ wfaQ/kana为模板；2和12:以假阳性重组子为模板。
【具体实施方式】
[0018]为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0019]本发明选用的质粒pSIM19由Donald L Court实验室馈赠，该质粒可从许多实验室无偿获得。参见文献:Sharan K S, et al.Recombineering:ahomologousrecombination-based method of genetic engineering.Nat Pr0.2009(4).,如Donald LCourt (conrtQmai 1.ncifcrf.gov)。本领域的技术人员也可以根据现有技术，根据图谱自行构建得到。其图谱请见图1。
[0020]实施例一:用RED重组系统敲除E.coli 056中的基因wfaQ。[0021]一、pSM19 转化 Ε.coli 056
[0022]①将2L质粒加入到IOOL E.coli 056感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min ；
[0023]②42°C水浴热激90s，迅速转移至冰上，继续冰浴2min ；
[0024]③无菌条件下，加入900L LB培养基，37°C，IOOrpm慢摇，恢复培养Ih ；
[0025]④5000rpm离心培养物，5min后取适量培养物涂布含100g/mL Amp的固体LB琼脂平板上，待液体被固体培养基吸收后，将平板倒置，37°C恒温培养12-16h，得到含pSM19的重组 E.coli 056。
[0026]二、制备含pSM19的E.coli 056电感受态细胞
[0027]挑取重组E.coli 056(含有温度敏感性质粒pSM19)的阳性克隆，30°C，200rpm过夜培养。次日，取I %过夜培养物转接50mL SOB液体培养基(该培养基的配方为:将2g胰蛋白胨，0.5g酵母粉，0.0585g氯化钠，0.0186g氯化钾溶解到纯水中，混匀后定容至IOOmL,121 °C湿热灭菌20min备用。)，同时加入500L浓度为IM的无菌MgCl2，待菌体浓度OD6tltl为0.4-0.5 (大约生长2h)后将其放入42°C水浴摇床中，200rpm震荡15min，然后立刻将摇瓶置于冰上,5-10min后开始制作电感受态细胞。4°C, 12000rpm离心7min后,用2mL预冷的无菌三蒸水悬浮菌体，分装至2-3管预冷的无菌的1.5mLEP管中。然后用预冷的无菌超纯水(MiliQ超纯水)水洗管中菌体四次(每次均在12000rpm，4°C的条件下离心Imin以除去超纯水)，最后每管加入无菌水至终体积为50-60L,由此制备的电感受态细胞(命名为E.coli056/pSIM19)可以于 _80°C存放一周。
[0028]三、带有wfaQ同源臂的抗性基因电转进上述电感受态细胞E.coli056/pSIM19中
[0029]先以质粒pKD4(商业化质粒)为模版，以引物056-wfaQ-k-F/wfaQ-k-R为敲除引物(序列见表1)通过聚合酶链式反应PCR的方法(PCR反应体系请参考fermentas货号S#EP0502(Pfu DNA polymerase)给出的反应体系；本实验扩增条件为98°C预变性2min，98°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸1.5min，共30个循环；最后72°C延伸5min。)扩增带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段。向电感受态细胞重组菌E.coli 056/pSIM19中加入40L浓度为200-300ng/L的基因片段(即上述带有目的基因wfaQ (GeneBank号为:DQ220293.1)同源臂的kana基因片段(卡那霉素核苷酸转移酶基因，其GeneBank号为:NC_002952))，混匀后转移至预冷的无菌的厚度为2mm的电转杯中，2.5kV高压电击完成后立即加入ImL SOC液体培养基(即加入了终浓度为20mM葡萄糖的SOB液体培养基)，37°C, IOOrpm恢复培养1.5h后，6000rpm离心5min后倒掉部分上清，取适量菌体悬浮液涂布含50g/mL的卡那霉素抗性平板(含终浓度为50g/mL卡那霉素的琼脂糖固体培养基)。将平板放于37°C培养箱中，约16-20h长出单菌落，将单菌落划线于含50g/mL的卡那霉素抗性平板中，12h后长出较浓菌苔。通过菌落PCR(PCR反应体系请参考Transgene货号为APlll (EasyTaq DNA polymerase)给出的反应体系；本实验扩增条件为94°C预变性4min,94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，共30个循环；最后72°C延伸5min。)鉴定的方法判断目的基因的敲除情况，琼脂糖凝胶电泳图请见图2。
[0030]在E.coli 056基因组中，表1所示的敲除引物056-wfaQ-k-F/wfaQ-k-R之间相距1149bp,检测引物wfaQ-t-F/wfaQ-t-R(序列见表1)之间相距1250bp,因此用检测引物进行菌落PCR验证O 56/ Δ wfaQ/kana阳性重组子时，以野生型056 (阴性对照)菌液为模板的PCR产物大小应为1250bp ;而阳性重组子056/Λ wfaQ/kana的敲除引物之间由于重组了大小为1496bp的kana抗性基因，因此阳性重组子的检测引物之间应相距1760bp。所以，以检测引物wfaQ-t-F/wfaQ-t-R为引物，以E.coli 056为阴性对照，通过菌落PCR验证阳性重组子056/Awfa0/kana，电泳结果由图2可知，编号为3_11和13为阳性重组子，即E.coli056中的目的基因wfaQ已经被消除。
[0031]表1:扩增引物
[0032]
【权利要求】
1.一种细菌基因敲除的方法，其特征是，包括以下步骤:
(1)pSIM19转化 E.coli056，得到含 pSIM19 的重组 E.coli056 ； (2)制备含pSM19的E.coli056电感受态细胞:挑取重组E.coli 056的阳性克隆，培养，菌体浓度OD6tltl为0.4-0.5时放入42°C水浴摇床中，震荡摇匀后置于冰上冷却后，离心后，用预冷的无菌三蒸水悬浮菌体，分装至2-3管预冷的无菌的EP管中；然后用预冷的无菌超纯水水洗EP管中菌体三至五次，最后每管加入无菌水，制备到电感受态细胞E.coli056/PSIM19 ； (3)以质粒pKD4为模版，PCR扩增带有目的基因WfaQ同源臂的kana基因片段，向电感受态细胞重组菌E.coli 056/pSIM19中加入所述带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高压电击完成后立即加入SOC液体培养基，37 ±0.5°C，培养1.5±0.2h后，离心后倒掉部分上清，取适量菌体悬浮液涂布含50±2g/mL的卡那霉素的抗性平板，培养，长出单菌落，将单菌落划线于含50±2g/mL的卡那霉素的抗性平板中，长出较浓菌苔，筛选得到目的基因已经被消除的阳性重组子。
2.根据权利要求1所述的细菌基因敲除的方法，其特征是，所述PSIM19转化E.coli056的步骤为:将质粒加入到E.coli056感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴；42°C水浴热激90±2s，迅速转移至冰上，继续冰浴2±lmin ;无菌条件下，加入LB培养基，37±0.5 °C，100± IOrpm慢摇，恢复培养1±0.2h ;离心培养物后取适量培养物涂布含100±2g/mL Amp的固体LB琼脂平板上，待液体被固体培养基吸收后，将平板倒置，37±0.5°C恒温培养，12-16h，得到含 pSM19 的重组 E.coliO 56。
3.根据权利要求1所述的细菌基因敲除的方法，其特征是，步骤(2)中用预冷的无菌超纯水水洗EP管中菌体时，每次在12000±20rpm，4±l°C的条件下离心1±0.1min以除去超纯水。
4.根据权利要求1-3任一项所述的细菌基因敲除的方法，其特征是，所述无菌超纯水是MiliQ超纯水。
5.根据权利要求1-3任一项所述的细菌基因敲除的方法，其特征是，步骤(3)中PCR扩增带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段的扩增引物为SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2。
6.根据权利要求1-5任一项所述的细菌基因敲除的方法所制备得到的目的基因wfaQ被敲除的阳性重组子E.coli056。
【文档编号】C12N1/21GK103898143SQ201210572241
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月25日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】万晓春, 党利君, 金言 申请人:深圳先进技术研究院