专利名称：Attractin(Atrn)和Attractin like 1(AtrnL1)基因双敲除小鼠心脏病模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及用基因敲除的方法建立Attractin like 1 (atrnLl)基因敲除小鼠， 并把它和Attractir^atrn)自然突变的小鼠杂交，得到双基因敲除，即基因为atrn-/-; atrnLl-/"的小鼠，这种动物除了有象atrn-/- ；atrn-/-小鼠一样的中枢神经系统海绵状空泡变性，它们的心脏也出现了严重的病变。本发明为我们研究人的心脏病的发病机理、抗心脏病药物筛选和心脏疾病的治疗方法提供了一个非常有价值的动物模型。本发明还涉及所述的基因在心脏病变发生中的作用。
背景技术：
Attractin基因变异的小鼠也被称为Mahogany，首先被用作描写Agouti小鼠基因变异所引起的毛发颜色的改变现象。近来定位克隆mahogany小鼠的变异基因，发现它们是一个由14 个氨基酸组成的富含胱氨酸的I型跨膜蛋白，具有一个很大的细胞外微区，跨膜微区和一个较小的细胞内微区。细胞外微区具有轴突诱导和细胞粘连分子的特征； 目前我们还不了解细胞内微区的具体功能。Duke-Cohan和他的同事在人体血浆内发现和 Mahogany细胞外微区相似的分泌性糖蛋白，在体外能激活T淋巴细胞和单核细胞之间的相互作用，因而命名为吸引素(Attractin，Atrn)。进一步研究发现人体能够产生二种Atrn蛋白一种是和小鼠的Mahogany分子非常相似的I型跨膜蛋白，这种Atrn的组织分布和小鼠的Mahogany —样，包括脑，心，胃，肺，肾和睾丸；而另一种则是没有跨膜和细胞内微区的分泌型Atrn，它们的分布则更为广泛，几乎表达于所有受检组织内。由于结构的相似，所以小鼠的Mahogany亦被称之为Atrn。I. Atrn在免疫系统中的作用实验证明，Atrn能够介导单核细胞和T淋巴细胞之间的结合反应，而这并非通过简单的连接作用，其作用机制还不太清楚。当T淋巴细胞向单核细胞运动时，单核细胞还处于静止状态。这可能是由于atrn能稳定和维持细胞外的单核细胞到T淋巴细胞的趋化性， 也可能是通过某些趋化因子，或atrn本身和细胞外的基质成分相互结合而形成的一种趋化作用。II. Atrn在毛发色素信息调控系统方面的作用机制根据Atrn的结构特点，它们可能在细胞-细胞之间的相互反应中发挥重要作用， 但我们现在对它们特异的生物化学功能还知之甚少。Mahogany变异首先是由于它能改变 Agouti小鼠的毛发颜色而被认知的。黑色素的信号传导通路为探讨Atrn的作用提供了一个较好的系统，使我们能利用现代遗传学、分子生物学和生物化学的方法着手研究Atrn的多方面生物学功能。在正常毛发生长过程中，黑色素细胞刺激素(a -melanocyte stimulating hormone, α -MSH)作用于黑色素细胞的膜受体(melanocortin-lrec印tor，Mclr)，一个与G蛋白偶联的具有7个
3垮膜微区的细胞膜受体，激活腺苷酸环化酶，使细胞内的cAMP升高，从而产生黑色素。正常的C;3h/fej小鼠毛发是Agouti颜色(棕黄色)，Agouti等位基因A在毛发生长过程中能够短暂地表达Agouti蛋白，作用于黑色素细胞表面的受体Mclr，降低细胞内的cAMP的水平，在黑色素细胞合成黑色素的的某个阶段暂时抑制黑色素的产生，转而合成黄色色素，然后在合成黑色素，从而产生一种特有的毛发，即在黑色毛发的毛尖下端的一段呈黄色，从而使小鼠整体上看来呈现棕黄色。然而，在丧失了 atrn基因变异的小鼠，Agouti 失去了产生黄色色素的功能，因此小鼠的毛发呈黑色，所以Atrn基因自然丢失的小鼠被称为 Mahogany。我们用转基因的方法，能在小鼠黑色素细胞特异性地表达atrn，能纠正 atrn, _/_小鼠的表型，这亦提示它是Mclr的一个低亲和力的复合受体。利用生物化学的方法在体外去检查atrn和Agouti蛋白之间的相互反应，发现Agouti蛋白的N-端能够和 atrn相结合，而C-端则和Mclr有一定的亲和力。这个研究结果从分子水平为Atrn在色素改变中的作用提供了解释。从遗传学角度来说，在毛发色素信息调控系统中，Atrn位于 Agouti和MClR之间。总之，这些发现显示，在黑色素细胞，Atrn是Agouti蛋白的辅助受体。III. Atrn与能量平衡的调节位于下丘脑的一个调节中心的作用和色素转换的调控非常相似，它们主要控制能量代谢的平衡。α -MSH作用于下丘脑神经元的膜受体Mc4r (melanocortin-4receptor)，能够降低能量的摄取。而Agrp (Agouti Related Protein)则能够通过作用于神经细胞膜受体Mc4r，增加能量的摄取。Mc4r丧失功能(Mc4r+)或Agrp的异位高表达都可以引起一种和Ay小鼠相似的肥胖综合症。因为在体外Agouti能够作为Mclr和Mc4r的拮抗剂，从而导致一种假设Ay小鼠的肥胖是由于Agouti蛋白在下丘脑的异位表达，模拟Agrp的作用所致。正常情况下，Agouti蛋白仅表达于皮肤，毛囊的真皮乳头细胞分泌的Agouti蛋白是一种细胞旁的信息分子，能够使黑色素细胞产生黄色素，并只影响毛发的颜色。但是，如果它们在脑组织的异常表达能够模拟Agrp的作用，刺激能量调节中枢神经细胞的受体Mclr，则能引起肥胖。Atrn在饮食和能量平衡方面的作用来源于对Ay小鼠的研究。用atrn变异小鼠和 Ay小鼠交配，纯合子Ay小鼠的atrn基因丧失功能后，它们的毛发由黄色变成棕黑色，而且也不再肥胖。因此，Atrn的丢失抑制了异位表达的Agouti在体重和色素方面的效果；但如果用atrn小鼠和Mclr或Mc4r变异的小鼠交配，则atrn基因丧失功能后并不影响Mclr和 Mc4r变异的小鼠在色素和肥胖方面的表型。所以从遗传学的角度来说，在色素和能量平衡的调节通路上，Atrn位于Agouti的下游，而在Mclr和Mc4r的上游。Agouti蛋白和AGRP 羧基端的氨基酸序列是基本相似的，Agouti蛋白的氨基端能够和吸引素细胞外微区特异性地结合，而AGRP则不能与吸引素起反应。与这些结果相一致，我们发现Atrn丧失功能可完全地抑制Agouti引起的肥胖，但是对AGRP所诱导的肥胖则没有效果。IV. Atrn变异所致的动物神经变性在进行的广泛组织学研究中，出人意料地发现Atrn丧失功能突变的动物具有进行性中枢神经系统的海绵状变性，其脑组织有广泛的空泡变和神经元的丧失，它们的组织学特征和朊蛋白有关的疾病非常相似。
在最初研究Atrn变异小鼠时，我们曾报道脑组织的灰质和白质有空泡样变，尤以脑干、小脑髓质和颗粒层、延脑、丘脑、海马(CA2和CA!3)、尾状核和苍白球为明显，躯体感觉的大脑皮质和脊髓的灰质更为严重。最近，我们发现空泡变开始出现于皮质的深层，在疾病的较晚阶段逐渐发展到白质。Atrn变异小鼠的神经变性伴随着行为的异常年幼的小鼠有时出现轻微的震颤，较年老的小鼠活动过度，某些种族的小鼠Atrn变异会导致神经肌肉衰弱及共济失调。
发明内容
心脏疾病是目前威胁人类健康的最主要的疾病之一，心脏病作为全球高致病率、 高死亡率的疾病，很大程度上是由不良的生活习惯造成的。食用脂肪过多、缺乏运动和吸烟会使动脉血管中的有害胆固醇含量上升，这些胆固醇附着在血管壁上，会引起人体自然的免疫反应，使血管壁发炎肿胀造成动脉硬化，切断流向心脏的动脉血供应，从而引发心脏病。为了更好的防治心脏病，我们必须有很好的动物模型，目前所用的最多的动物模型是手术结扎，部分梗阻冠状动脉的分支以造成心肌的局部缺血，这种模型的缺点显而易见。为了更有效地提供心脏病研发、防治所需要的动物模型，克服现有动物模型的缺陷，本发明通过发明者的创造性研究，提供了一种不仅能够大量、而且病变稳定的基因敲除小鼠的心脏病的动物模型。本发明的第一个方面，是Atrn基因自然丢失的小鼠作为生产小鼠心脏病模型的基础，如果没有atrn基因的变异，和对照组的小鼠相比较，仅仅atrn Ll基因的敲除没有任何异常的表现型；在本发明的实施方案中，只有atrn和atrnLl两个基因完全丢失，才能产生小鼠的心脏的异常，尽管atrn小鼠有许多其他的异常的表型，如中枢神经系统的变性等。在本发明中，我们发现利用atrn和atrn Ll的双基因丢失的小鼠作为心脏病的动物模型，是建立在C3H/Fej种系小鼠的背景上。纠正实验中，表达atrn或atrn Ll都可以纠正小鼠心脏的病变。^X本发明所述术语“双基因敲除小鼠”是指atrn和atrn Ll两个基因都完全丢失的小鼠；“小鼠的心脏病模型”指这两个基因丢失的小鼠的心脏发生的病变即早期的心肌细胞坏死、钙沉积而导致的心肌钙化、左心室和室间隔肥大，心力衰竭等心脏病变; "atrn-/-"是指小鼠完全失去的atrn基因；“atrn-/- ；atrn Ll-/- “指这两种基因都完全丢失的小鼠。本发明所述术语“对照组”指正常的C3H/Fej种系的小鼠。小鼠心脏病变的建立具体实施方法1，建立小鼠的心脏病的模型必须要有l)atrn基因自然丢失的小鼠，从美国的Jackson lab订购；2) atrn Ll基因敲除的小鼠，我们用IRES-LacZ-Neo取代了 atrn Ll基因的外显子2，从而敲除了小鼠的这个基因，建立了 atrn Ll缺失的小鼠系，敲除基因的质粒如图1所示；3)杂交这两个系的小鼠，以得到这两个基因都完全丢失的小鼠系，由于这种小鼠失去了生殖的能力，所以必须用杂合子atrn-/-;atrn Ll+/-来交配来维持种系。2，这种模型要建立在C3h/Fej小鼠的品系上。心脏病变的发牛及结构说明1，杂交atrn-/-;atrn Ll+/-所得到的子代(Fl)小鼠，它们的基因型有可能是 atrn-/" ；atrnLl，_/_(25% ), atrn-/" ；atrnLl+/"(50% )禾口 atrri_/_ ；atrnLl+/+ (25% )。 其中仅仅基因atrn-/- ；atrnLl, -/-(25% )的小鼠呈现心脏病变。2，在心脏的大体标本，4周的小鼠呈现心脏病变，无一例外的左心室的左上后方可以看到一个病灶，呈白色小灶状。然后逐渐地迅速向周围延伸，在40天左右累及整个左心室和室间隔，和右心室(2个月)，从而导致心脏衰竭(图2)。3，组织学，3周左右开始出现个别心肌细胞的坏死，炎症细胞侵润，钙化及纤维化 (图幻。电子显微镜下显示心肌纤维之间大量的线粒体堆积，水肿和巨大线粒体(图4)。
图1 =AtrnLl基因敲除小鼠的质粒，A 敲除atrnLl基因的质粒；B Southern blot 显示clone 3的atrn Ll被敲除；C :atrn Ll敲除小鼠被敲除的基因和蛋白序列。图2:Atrn和Atrn L 1双基因敲除小鼠的心脏，左心室左后靠心房的部分坏死，纤维化，呈现白色的版块状；左上心脏前面观，右上背面观(6x)，左下Gx)和右下(IOx) 心室的横断面。图3 40天的Atrn和Atrn L 1双基因敲除小鼠的心脏，左心室肌纤维坏死，纤维化，炎细胞侵润和钙盐沉积。上图40x，左下图ΙΟΟχ，右下图，200x。图4，Atrn和AtrnLl小鼠心肌病变的电镜下改变左上图未正常对照，其他显示心
肌纤维变形，之间堆满线粒体，右的线粒体肿胀，形成巨大线粒体。
权利要求
1.为了获得Attractin(atrn)和Attractinlike 1 (atrn Li)基因双敲除小鼠心脏病的模型，必须是经过如下步骤第一步，购买atrn-/-自然突变的小鼠，其基本特征是此小鼠的种系背景是C3h/fej， 2-3个月时开始在脑组织内出现海绵状变性；第二步，设计atrnLl基因敲除小鼠的质粒，其分子结构具有附图IA所示的特征；第三步，转染atrnLl质粒进入小鼠的胚胎干细胞(ES) 内，并筛选正常的atrn Ll基因被敲除的ES细胞。第四步，用这种ES细胞生产atrn Ll基因敲除的小鼠，传代获得atrn Ll-/-的纯合子小鼠。第五步，杂交atrn和atrn Ll基因敲除的小鼠，获得双基因敲除的小鼠，即心脏病模型小鼠。
2.如权利要求1所述，atrn自然突变小鼠，用于心脏病动物心脏病的模型制作。
3.如权利要求1所述，atrnLl基因敲除小鼠的质粒，其分子结构具有附图IA所示的特征。
4.如权利要求1所述，转染atrnLl质粒进入小鼠的胚胎干细胞(ES)内，并筛选正却的 atrn Ll基因被敲除的ES细胞，其DNA杂交结构如附图1B，第3株ES细胞所示。
5.如权利要求1所述，用这种ES细胞生产atrnLl基因敲除的小鼠，传代获得atrn Ll-/-的纯合子小鼠。
6.如权利要求1所述，杂交atrn和atrnLl基因敲除的小鼠，获得双基因敲除的小鼠， 即心脏病模型小鼠。
7.权利要求1-6中任一权利要求所述的任何步骤和产物，在制备各种动物心脏病模型的作用和用途。
全文摘要
Attractin和Attractin like 1基因双敲除小鼠心脏病模型本发明在世界上首次建立了Attractin like 1(atrnL1)基因敲除小鼠，把这种小鼠和Attractin(atrn)自然突变的小鼠杂交，其后代中双基因敲除，即基因为atrn-/-；atrnL1-/-的小鼠的中枢神经系统海绵状空泡变性和atrn-/-；atrn-/-小鼠一样，没有明显加重的变化，但这种小鼠的心脏出现了严重的病变。本发明为我们研究人的心脏病的发病机理、治疗方法和抗心脏病药物筛选提供了一个非常有价值的动物模型。本发明还涉及所述的基因在心脏病变发生中的作用。
文档编号C12N15/85GK102399817SQ20101027926
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月13日 优先权日2010年9月13日
发明者沈士亮, 沈赞 申请人:上海众申生物科技有限公司