单子叶植物，更优选为玉米。
[0021] 本发明的有益效果在于： 阳02引本专利构建了含有从烟草中克隆的MR序列（M17)的单侧和双侧植物表达载体， 研究了MR序列转入异源受体（尤其是玉米）后的功能表达，证实了MR序列增强转基因玉 米外源基因高效稳定表达的作用。为进一步分析验证MR序列对外源抗虫、抗除草剂基因 在玉米等单子叶粮食作物中表达的效率奠定基础，W分析如何增强玉米品作物的抗性。因 此，通过转基因技术将MR序列与外源基因结合构建表达载体后，转化玉米等重要的粮食 作物，W获得高效、稳定抗逆性转基因玉米等重要的粮食作物具有重要意义，也为W后提高 玉米等重要粮食的产量提供了研究方向。
【附图说明】
[0023] 图1为M17的测序结果分析图。序列中A/T含量较高，序列大小在674bp。其中 含有A-box，T-box，DNA解旋序列，复制起始点0RI等MR序列特有的特征基序。
[0024] 图2为植物表达载体的酶切鉴定图，1为化〇1单酶切P3301-M17-N，2为Bs巧II单 酶切P3301-M17-B，3为化〇1单酶切双侧构建载体P3301-M17-N-B，4为Bs巧II单酶切双侧 构建载体P3301-M17-N-B。选用的Marker为MarkerIII。
[00巧]图3为用包裹金粉的质粒轰击玉米愈伤组织，在N正培养基培养一个星期后的照 片，所采用的质粒为PCAMBIA3301空载体（标记为3301-空），在Bs巧II酶切位点插入M17 的PCAMBIA3301载体（标记为3301-B)，在化〇1酶切位点插入M17的PCAMBIA3301载体（标 记为3301-脚，W及在Bs巧II和化〇1酶切位点同时插入M17片段的双侧构建PCAMBIA3301 载体（标记为3301-双或3301-N-B)。
[00%]图4为用包裹金粉的质粒轰击玉米愈伤组织后，在含有草下麟化5mg/L)的筛选 培养基NeS中进行筛选培养。所采用的质粒与标记同上。
[0027]图5为用包裹金粉的质粒轰击玉米愈伤组织后，经过在含草下麟的抗性筛选培养 基上进行数次继代后，我们挑选白色，干燥，松散的抗性愈伤组织，转入基因枪-再生I培 养基中进行培养。所采用的质粒与标记同上。
[0028] 图6为提取的玉米愈伤组织DNA进行PCR鉴定图。1-12均为转基因玉米愈伤组 织，1-4为转P3301-M17-B载体的玉米愈伤组织，5-8为转P3301-M17-N载体的玉米愈伤组 织，9-12为转P3301-M17-N-B载体的玉米愈伤组织，CK为空白对照。
[0029] 图7为RT-PCR的方法检测GUS的表达量图。在所有的转基因玉米愈伤组织中，双 侧构建M17的P3301-M17-N-B中GUS的条带亮度无论和对照还是单侧构建的载体相比，亮 度明显增加，而单侧构建的两个载体体现的GUS转录水平也高于对照即P3301空载体。
【具体实施方式】
[0030] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 阳〇3U 实施例1烟草MR序列M17基因的克隆与表达分析 阳03引（一）、材料
[0033]1、野生型烟草Nicotianat油acumL.，玉米再生系Hill
[0034]本研究所用的大肠杆菌菌株为D册a(实验室自己保存），含有CaMV35S启动子驱动 的Gus基因的植物表达载体PCAMBIA3301 (北京大学崔礼嘉教授提供）；pMD18-T克隆载体 (购自Takara生物公司）；各种常用抗生素；构建载体所需要的限制性内切酶基因枪转化 所需要用到的各类生化试剂。
[0035] 2、培养基及常用溶液配制
[0036] (1)LB (Luria-Bertani)培养基QL体系）
[0037] 膜蛋白腺（Tryptcme ) lOg酵母粉（Yeast紛tract) 5g NaCl 1化 "W' 琼脂粉（Agar) 15g
[0038] 补水至IL(液体培养基无需加入琼脂粉）
[0039] 似YEP培养基（1L体系）
[0040] 朦蛋白腺（tryptone ) lOg酵母粉（yeast extract) lOg NaCI 5g 琼脂粉（agar) 15g
[0041] 补水至IL(液体培养基无需加入琼脂粉）
[00创 做卡那霉素溶液配制（50mg/mU
[0043] 称取2. 5g卡那霉素，定容与50ml的灭菌水中，充分溶解。
[0044] 0. 22um滤膜过滤除菌，分装1ml，-20°C保存 |；0〇45] (4)氨节霉素配制（lOOmg/mD
[0046] 称取5g氨节霉素，定容与50ml的灭菌水中，充分溶解。
[0047] 0. 22um滤膜过滤除菌，分装1ml，-20°C保存。
[0048] 妨利福平溶液配制（50mg/mU W例称取2. 5g利福平置于50ml塑料离屯、管中，加入40ml甲醇，振荡充分混合溶解之 后定容50ml，可W满旋。
[0050] 0. 22um滤膜过滤除菌，分装1ml，-20°C保存。 阳05U 配制时每毫升可加入3~5滴ION化OHW助溶。若WDMS0做溶剂，可不滴加化OH。
[0052] (6)IPTG配制（24mg/ml)
[0053] 称取1. 2gIPTG，定容与50ml的灭菌水中，充分溶解。
[0054] 0. 22um滤膜过滤除菌，分装1ml，-20°C保存。 阳化5](二）、方法
[0056] 1.烟草MR序列M17的克隆 阳057] 1.1实验用到的引物
[0058] 本实验所需引物由上海生工合成，P1-P4均为M17序列引物，其中P1-P2为含化〇1 酶切位点的M17引物，P3-P4是含Bs巧II酶切位点的M17引物。
[0059] P1 :5' -CATGCCATGGTGTCATATTTGGCT-3'
[0060] P2 :5' -CATGCCATGGATCCCAACTATGG-3'
[0061] P3 :5' -GGGTTACCTGTCATATTTGGCT-3'
[0062] P4 :5' -GGGTTACCATCCCAACTATGG-3' 阳〇6引1. 2烟草基因组DNA的提取（小量法） W64] 1)取l-2g新鲜烟草叶片放入1. 5ml离屯、管中，将离屯、管浸入液氮中，用研磨棒研 磨成粉末。 W65]。在研磨好的粉末中加入500μLCTAB提取缓冲液，剧烈摇动混匀，65°C水浴锅。
[0066] 如每个离屯、管中加入预热的300 μ L提取液，轻轻混匀。
[0067] 4)将样品于65°C水浴保持15~30分钟。（其间用手摇动Ξ次）
[0068] 5)冷至室溫，加入200 μ L氯仿/异戊醇，轻轻充分混匀。
[0069] 6) 12000巧m，离屯、10 分钟。
[0070] 7)取上清液，加入250 μ L异丙醇，轻轻混匀。 阳07U8) 1200化pm，离屯、10分钟，倒掉上清液，并用70%乙醇洗涂沉淀一次。 阳072] 9)真空干燥10分钟，或室溫干燥30分钟。
[0073] 10)用 50μLd地2〇 溶解DNA。
[0074] 11)加入 1. 5μLRNase(RNaselOmg/ml)，37°C保溫 30 分钟。-20°C长期保存。 阳0巧]1. 3M17的克隆
[0076] 利用人工合成的引物P1-P4, W烟草基因组DNA为模板进行扩增。
[0077] PCR反应体系（40化）：
[0078]
阳口巧]注：Prime引物稀释：5,primer5μ L+3，primer5μ L+d地2〇240 μ L
[0080] 按照W下程序进行扩增：94°C预变性5min ;94°C变性40sec ;56°C退火45sec ; 72°C延伸lmin，30个循环；72°C保持5min，4°C保溫。
[0081] 1.4DNA片段的回收
[0082] 按照回收试剂盒（天根公司）的使用说明进行：
[008引 （1)用干净的刀片将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，尽量切除多余部 分，放入干净的离屯、管中。
[0084] 似向胶块中加入3倍体积（即300μL)溶胶液BN，50°C水浴放置10分钟，其间 不断溫和地上下翻转离屯、管，W确保胶块充分溶解。 阳0财做在溶胶的同时，向吸附柱CA2中加入500μL平衡液BL，1200化pm离屯、1分钟， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0086] (4)胶块完全溶解后，静置2分钟，等待胶溶液溫度降至室溫上柱。
[0087] 妨将第2步所得溶液加入已平衡的吸附柱CA2中，室溫放置2分钟，1200化pm离 屯、30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 阳0蝴 （6)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，静置2分钟，12000巧m离屯、30-60秒， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
[0089] (7)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12000巧m离屯、30-60秒，倒掉废液。
[0090] (8)将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm离屯、2分钟，尽量除尽漂洗液。
[0091] (9)将吸附柱置于室溫放置数分钟，彻底地惊干，W防止残留的漂洗液影响下一步 的实验。
[0092] (10)将吸附柱CA2放到一个干净离屯、管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30 μ L (1地2〇,室溫放置2分钟，12000巧m离屯、2分钟收集DM溶液
[009引（11)将得到的30μL溶液继续悬空滴加到吸附柱，重复步骤10,所得到的即为回 收片段，立即使用或者保存于-20°C长期保存。
[0094] 1. 5 与pMD18-TSimplevector进行连接 阳0巧]将回收目的基因与PMD18-TSimplevector进行连接，命名为PMD18-T-M17N(含 化〇1酶切位点）、PMD18-T-17B(含Bs巧II酶切位点）。经PCR鉴定，测序并分析。（测序 分析结果参见【附图说明】中的图1)
[0096] 采用W下连接体系进行连接反应：
[0097]
阳09引混匀，放置16 °C过夜。
[0099] 1. 6大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
[0100] (1)从于37°C培养16-2化新鲜平板上挑取一个单菌落，接种于15mlLB液体培养 基的Ξ角瓶中，37°C，190巧m振荡培养过夜（约1地）。 阳W] 似取1. 6ml菌液接到一个含有14. 4mlLB液体培养基立角瓶中，37°C，21化pm培 养 90min。
[0102] (3)再取出10ml菌液转接到一个含有9