0mlLB液体培养基Ξ角瓶中，37°C，210巧m 培养lOmin
[0103] (4)将菌液分装到2个50ml离屯、管中，冰上放置10min，4°C，5000巧m离屯、7min， 倒出培养液，回收菌体，将管倒置IminW便培养液流尽。（注意无菌操作）
[0104] (5)用冰预冷的0.IM化Cl2(新鲜解冻的）0. 5ml在冰上用枪吸打，使其沉淀悬浮。 再补加0. 1M化C12至20ml。立即放在冰上静置30min(从接触化C12开始计时）。4°C， 500化pm离屯、7min，回收菌体。加入2ml冰预冷的0. 1M化CI2悬浮细胞（冰浴上操作）。 阳1化](6)分装：感受态细胞85μL，加上15μL纯甘油。100μL分装，-80°C保存。 阳106] 1. 7碱裂解法小量提取质粒DNA 阳107] 相关溶液配制：
[0108]溶液一（用时置于冰上）：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-cl(pH8. 0)，lOmmol/L邸ΤΑ(PH8.0)，高压灭菌，4°C保存。 阳109] 溶液二（现用现配，1000μL量）：800μL(1地2〇, 100μL氨氧化钢（2mol/L)，100μΙSDS(10%)，室溫保存。 阳110] 溶液Ξ(用时置于冰上）：60μΙ乙酸甲巧mol/L)，11.5yL冰乙酸，28.5μΙ d地2〇,用醋酸调抑值到4.8,高压灭菌，4°C保存。 阳1?] 1)取培养的菌液1. 5ml于1. 5ml的小离屯、管，500化pm离屯、2min，弃上清，再倒入 1. 5ml菌液，500化pm离屯、2min，弃上清，用100μL枪吸收余液。
[0112] 2)加入100μL溶液一，用縱满震荡器剧烈震荡，使菌体充分悬浮。 阳11引扣加入200μL溶液二溫和颠倒4-10次，避免剧烈震荡，冰浴5min。
[0114] 4)加入150μL溶液三溫和摇匀，冰浴5min。
[0115] 5)室溫12000巧m离屯、lOmin，小屯、吸上清至另一 1. 5ml离屯、管。
[0116] 6)加入与上清等体积的酪/氯仿/异戊醇（25:24:1),轻摇Imin，ISOOOrmp离屯、 5min，吸上清至另一离屯、管。
[0117] 7)加入与上清等体积的氯仿/异戊醇（24:1)，轻摇Imin，ISOOOrmp离屯、5min，吸 上清至另一离屯、管。
[0118] 8)加入两倍体积的无水乙醇，1/10体积的NaAc(p册.3)，颠倒混匀，-20°C沉淀 30minW上。 阳119] 9) 12000rmp离屯、10min，去上清，用 500μL70%乙醇洗涂一次，洗涂离屯、2min后 倒去乙醇，用枪吸尽多余乙醇，在超净台风干15min。 阳120] 10)加入40μLd地2〇溶解DNA，加入1. 5μLRNA酶，枪头打到液面下方，37°C消 化30min，4°C保存备用，-20°C长期保存。 阳12U 2、烟草MR序列M17在玉米愈伤组织中的表达
[0122] 2.1基因枪法所用培养基：
[0123] 高渗培养基：N6基本培养基基本成分巧mg/L2,4-D+0. 7g/Lk脯氨酸+0.Ig/ L肌醇+30g/L薦糖+0.Ig/L水解酪蛋白+36. 4g/L山梨醇+36. 4g/L甘露醇巧.7g/L琼脂 (p册.8)，灭菌后加入AgN〇3〇. 85mg/L。
[0124] 继代培养基：N6基本培养基基本成分巧mg/L2, 4-D+O. 7g/Lk脯氨酸+0.Ig/L肌 醇+30g/L薦糖+0.Ig/L水解酪蛋白+2. 7g/L琼脂（p册.8)，灭菌后加入AgN〇3〇. 85mg/L。 阳1巧]基因枪-筛选培养基：N6基本培养基基本成分+1. 5mg/L2, 4-D+0.Ig/L肌醇巧g/L薦糖+10g/L甘露糖巧.7g/L琼脂（p册.8)。 阳1%] 基因枪-再生I培养基：MS基本培养基巧Og/L薦糖巧g/L甘露糖+0.Ig/L肌醇 +2. 7g/L琼脂（P册.8)。
[0127] 基因枪-再生II培养基：MS基本培养基巧5g/L薦糖巧g/L甘露糖+0.Ig/L肌醇 +2. 7g/L琼脂（P册.8)。
[0128] 壮苗培养基：MS基本培养基+0. 7g/Lk脯氨酸+0.8g/L天冬素+0.Ig/L肌醇 巧Og/L薦糖+10g/L葡萄糖+0.Ig/L水解酪蛋白+0. 5mg/LNAA+2. 7g/L琼脂（P册.8)。 阳129] 表1MS微量元素胆存液（1000X) 阳130]
阳135] 表4铁盐的配制方法（200X) 阳 136]
阳142] PH5.8N6培养基大量元素储存液（20X): 阳 143]
[0148] 2. 2常用溶液的配制 阳1例 乙酷下香酬（As) (lOOmM):称取196. 2mgAs,用5mlDMS0直接溶解，并定容至10ml，用0.22μm滤器超滤除菌，分装成每份1ml，避光胆于-20°C冰箱中备用。 阳150] 2, 4-D(Img/ml):取25mg的2, 4-D，加入少量95 %的酒精再加蒸馈水定容至 250ml，4°C保存。
[0151]NAA母液（0. 5mg/ml):称取lOOmgNAA置于小烧杯内，用1M的K0H溶液溶解NAA， 用水定容至200ml，4°C保存。 阳15引头抱霉素（cef) (lOOmg/mD:称取Igcef溶于10ml超纯水中，用0. 22μηι滤器超 滤除菌，配制好后，避光胆于-20°C冰箱中备用。
[0153] 2. 3基因枪转化（型号PDS-1000/He)转化玉米愈伤组织 阳154] 2. 3.1诱导愈伤组织 阳巧5] (1)取授粉后10-12天的玉米果穗，去除巷叶，切除穗顶端1厘米，在上部顶端轴屯、 插入綴子尖端，有助于无菌条件下处理幼穗。 阳156] (2)在超净台上把穿有綴子的穗放入无菌的广口瓶内。如果必要可W在一个广口 瓶内一次处理四穗。 阳157] (3)加700ml消毒溶液[50%商业漂白剂或5. 25%次氯酸钢，并加一滴Tween20] 淹没玉米穗。消毒20分钟。握住綴子末端，使消毒溶液流出，然后取出果穗放入盛满灭菌 水的烧杯里，在水里洗涂二次，在超净工作台上惊干。
[0158] (4)在超净台上，把穗子放在一个较大的培养皿上，用新的、解剖刀切除穗巧粒的 表面l-2mm。在此过程，使用酒精灯间歇的杀菌器具。 阳159] (5)利用解剖刀插入窄的末端于胚乳和果皮间，暴露胚乳种子表面，由上而下剥离 巧粒幼胚（面向玉米轴的底部）。运样不触坏幼胚，位于巧粒顶部，靠近巧粒底部。幼胚被 轻轻的附在刀片顶端，幼胚的胚轴面要与N6E培养基表面接触（角质鱗片面朝上），幼胚放 置的密度大约为30个/皿。
[0160] (6)用封口膜密封培养皿，28°C暗培养7-10天，即可见愈伤组织。用于基因枪转 化，需继代培养2周左右，待松散的II型愈伤长出时，转化效果较好。 阳161] 2. 3. 2实验材料的准备 阳162] (1)选取较好的松散的II型愈伤，转移到高渗培养基中，集中在培养基的中屯、放 置，摆成约3cm的圆形，基因枪轰击前4小时准备好。 阳163] (2)事先保存的表达载体的质粒DNA，通过DNA的凝胶电泳估计质粒DNA的浓度， 如果浓度较大，可适当稀释至30-6化g/μL。 阳164] 2. 3. 3金粉的制备 阳1化](1)称取金粉lOmg(20枪用），放入一支无菌的1. 5ml离屯、管中，加入1ml无水乙 醇，在振荡器上剧烈振荡lOmin，静置5min，10000巧m离屯、Imin，去掉上清。重复上述步骤 三狄。
[0166] (2)加入1. 0ml灭菌重蒸水，高强度振荡重新悬浮，静置Imin，短暂离屯、3S，去掉上 清，重复Ξ次。
[0167] (3)加入0.25ml灭菌的重蒸水，重新悬浮后，平均分配至5支离屯、管中（每管 50yL)，-20°C保存。
[0168] 2. 3. 4微弹粒子的准备 阳169] (1)取50yL冷冻金粉溶液解冻，用手振荡均匀。 阳170] (2)在超净台中加入适量质粒DNA化〇-l(K)ng)用手振荡均匀，轻击管壁收集所有 液滴到管底部。 阳W] (3)加入50μLCaC!2,用枪头吸打一次，在低速縱满器上振荡，边振荡边加入20μL 亚精胺后，静置30S，用手振荡开，重新放到縱满器上振荡lOmin。
[0172] (4)取下离屯、管，静置5-7min，2000巧m离屯、15S，小屯、吸去上清，加入250μΙ冰冻 的无水乙醇到沉淀中，手指击打均匀，静置4-5min，离屯、2000巧ml5S，小屯、吸去上清。重复 上步操作，加入200μL无水乙醇，再洗涂一次，离屯、后，加入110-140μL无水乙醇，待用。 阳173] 2. 3. 5轰击受体材料
[0174] (1)打开超净台，用70%乙醇擦拭超净台内部和基因枪的表面及内部。将用酒精 浸泡的载体膜、铁丝网、用异丙醇浸泡一下可裂膜，放在滤纸上自然风干，圆形钢圈在70% 酒精中浸泡后取出在酒精灯上烧干。 阳17引 似把灭好菌的载体膜装入圆形钢圈，在载体膜中屯、加上10μL用质粒DNA包裹好 的微弹粒子，自然条件下惊干。打开气瓶，调节压力至2000psi。
[0176] (3)将可裂膜、铁丝网和载体膜安装进固定装置中。射击参数为：Gap distance:20min;微弹载体飞行距离：10mm;微弹飞行距离：7cm;压力：1350psi;真空 度：28inchesHg。把准备好的II型愈伤放在托盘上，将托盘插入倒数第二档。 阳177] (4)打开基因枪的电源，打开真空累，关闭基因枪的Π，按下抽真空键（VaC)，当真 空表读数达到28inches化时，使键置于保持化old)档。
[0178] (5)按下射击键（Fire)直到射击结束，按下放气键，使真空表读数归零。打开基因 枪口，取出培养皿，盖好盖子并用封口膜封好。
[0179] (6)轰击后的愈伤组织在高渗培养基上放置1小时后，倒入继代培养基，28°C暗培 养。
[0180] (7)被轰击的愈伤组织在继代培养基N6E上培养7-10天后，倒入含有草下麟 (2. 5mg/L)的筛选培养基N6S中筛选，28°C暗培养。每Ξ周更换一次培养基，筛选2个月左 右。筛选两个月后，挑选白色，干燥，松散的抗性愈伤，转入基因枪-再生I培养基，暗培养 2-3周后，当细胞开始变大后，转入基因枪-再生II培养基，光照培养。分化出小苗后，转入 壮苗培养基，待小苗根长出Ξ根W上，植株有10多厘米高时洗去培养基，转入灭过菌的营 养±与赔石的混合±中。待小苗长势相对稳定后移入溫室，使它开花结实。（轰击玉米愈伤 组织结果参见【附图说明】图3,图4和图5。） 阳1W] 2. 4玉米愈伤组织DNA的提取 阳182] (1)取约l-2g长势较好的白色松散抗性玉米愈伤组织于1. 5ml离屯、管中研磨至稀 糊状；
[0183] (2)加500μL预热至65°C的CTAB