重组禽副粘病毒疫苗及其制备和使用方法

重组禽副粘病毒疫苗及其制备和使用方法
【专利说明】重组禽副粘病毒疫苗及其制备和使用方法
[0001] 本申请是申请日为2010年8月20日、发明名称为"重组禽副粘病毒疫苗及其制备 和使用方法"的发明专利申请No. 201080045564. 7的分案申请。
[0002] 通过引用合并入本文
[0003] 本申请要求保护2009年8月21日提交的美国临时申请系列No. 61/235,912的利 益。 发明领域
[0004] 本发明设及禽副粘病毒（APMV)和APMV序列。本发明设及用于插入和表达外源基 因W用作保护免受多种病原体侵害的安全免疫媒介物的病毒载体。其设及在反向遗传学体 系中用于产生活减毒疫苗的载体疫苗。其还设及可用于在体外表达载体中产生亚单位或用 作待被整合入病毒或质粒类型体内表达载体的序列的多核巧酸。
[0005] 本发明设及未修饰的和经修饰的APMV病毒，其制备和使用方法W及某些DNA和蛋 白质序列。更具体地，本发明设及其中病毒的天然基因组已被改变的APMV病毒广APMV突 变体"或"重组APMV")和设及制备及使用此类APMV变体或重组APMV的方法。
[000引发明背景
[0007] 病毒载体疫苗代表疫苗开发的最快速成长领域之一。主要的全球感染性疾病HIV、 肺结核（tuberculosis)和追疾的许多处于临床开发中的疫苗是基于病毒载体。动物的病 毒载体疫苗已上市，例如用于陪伴动物（companionanimal)和家禽的禽痘病毒疫苗、用于 家禽的禽瘤疹病毒载体疫苗和用于野生动物的痘苗病毒载体疫苗。但其它家畜类载体疫 苗处于开发中。病毒载体疫苗的有利方面是它们可被安全地施用，运是由于使用已被大大 减毒并且其本身在动物中不引发疾病的载体主链所致。目前使用的病毒载体的不利方面 是母传抗体或因W往感染而获得的抗体的存在。此类抗体将中和载体病毒，从而减少载体 疫苗的成功。载体疫苗开发的一个主要动力是最先在亚洲、随后在欧洲和非洲发生的高致 病性流感病毒册N1的出现。已开发了几种载体疫苗候选物，包括禽痘病毒（Taylor等人， 1988)、痘苗病毒（化ambers等人，1988)、劳氏肉瘤病毒化unt等人，1988)、腺病毒（Tang等 人，2002,Gao等人，2006)，委内瑞拉马脑炎病毒（Schultz-化er巧等人，2000)、新城疫病 毒扣S6, 719, 979,Veits等人，2006,Swayne等人，2002,Park等人，2006)、传染性喉气管炎 的瘤疹病毒（Veits等人，2003)，火鸡的瘤疹病毒值arteil等人，1995)W及基于腺病毒 的载体疫苗化oelscher等人，2008,Toro等人，2007)。已在首次用于实验的鸟中测试了运 些载体疫苗的功效，但到目前为止还没有公布关于运些载体疫苗在对所述病毒载体和/或 由所述插入物编码的蛋白质有预存免疫的鸟类中的功效的报导。
[0008] 副粘液病毒科包括人（麻疹，腮腺炎，副流感和呼吸道合胞病毒）和动物病原体 (新城疫病毒和牛攝病毒），所述病毒对公共卫生W及全球经济造成重大影响化amb等人， 2007)。该病毒科的成员定义为具有单组分（monopartite)反义单链RNA基因组。副粘液 病毒科由两个亚科即副粘病毒亚科（Paramyxovirinae)和肺炎病毒亚科（Pneumovirinae) 组成。根据最近的重新分类，副粘病毒亚科包括5个属即麻疹病毒属（Morbillivirus)、亨 尼波病毒属化enipavirus)、Rubulavirus、呼吸系病毒属巧espirovirus)和Avulavirus， 而肺炎病毒亚科包括肺炎病毒属（Pneumovirus)和偏肺病毒属（Metapneumovirus) (Mayo， 2002)。禽副粘病毒（APMV)被分类在腮腺炎病毒属中，包括已使用血凝抑制化I)试验 (Alexander, 1988)确定的9个抗原上不同的血清型。在运9个血清型中，属于APMV-1亚 型的分离株可引起商业家禽的灾难性疾病，并且被分类为速发型新城疫病毒（NDV)。NDV 的更溫和形式被称为中发型和缓发型分离株，其中后一种形式在家禽中大多无症状。属于 APMV-2、3、6和7的分离株也与家禽的疾病相关。具体地，APMV-2和3的分离株引起的感 染可引发轻度呼吸性疾病和蛋质量和数量上的问题度ankowski等人，1981 ;Redmann等人， 1991 ;Tumova等人，1979 ;Zhang等人，2007)。已知APMV-6和7的分离株感染火鸡、鸭和候 鸟并且可诱导呼吸性疾病，所述疾病可牵设继发感染（Saif等人，1997;化ortridge等人， 1980)。在另一方面，已从鸭、水禽和其它野生鸟类分离了APMV-4、5、8和9的分离株，但所 述鸟类在病毒感染后极少显示临床症状（Alexander等人，1983 ;Capua等人，2004 ;Gou曲 等人，1984;Maldonado等人，1995 ;化ortridge等人，1980)。
[0009] 几个NDV分离株的完整基因组序列已被确定并且用于阐释NDV毒力的各种决定 簇（deLeeuw等人，1999;K;rishnamu;rthy等人，1998;Zou等人，2005)。在最近两年中， 除APMV1外的几种APMV序列已被公布，例如APMV-2的GenBank登录号抓338414、APMV-3 的EU403085、APMV-4 的FJ177514、APMV-6 的EU622637、APMV-7 的FJ231524、APMV-8 的 FJ215863、FJ215864和FJ619036、APMV-9的抓910942。除了序列信息外，关于致病因子知 之甚少。APMV2-9的分离株大部分是从候鸟分离的。有趣地，鲜见用此类分离株对鸡进行 实验性感染的报导（Saif等人，1997)。由于运些APMV在野生鸟类中广泛传播，并且在某 些情况下已从有时引起它们死亡（Saif等人，1997 ;Shihmante;r等人，1998 ;Shihmante;r等 人，1998)的商业鸟群中狂hang等人，2007)分离到所述APMV，因此需要了解关于它们在禽 类中的毒力的知识。
[0010] 大多数APMV分离株引起相对轻度的疾病，所述疾病在伴随细菌或病毒感染存 在时可恶化，运可能导致经济影响。具体地，APMV-2最早在1956年作为二级病原体从南 加利福尼亚的受急性喉气管炎影响的鸡中分离到度ankowski等人，1960)。由于该血清 型的许多株已从几个鸟类物种分离到，运表明APMV-2在世界上被广泛传播（Amlral等 人，1984;&radshaw等人，1979;Fleury等人，1979 ;Goo血an等人，1988;Lang等人，1975 ; Lipkind等人，1982;Lipkind等人，1979;Zhang等人，2006)。Bankowski等人报导 了产蛋 雌火鸡对APMV-2的自然W及人工暴露造成了解化率和家禽产率（poultry^eld)的显 著下降度ankowski等人，1981)。APMV-4分离的最初实例是从美国密西西比候鸟迁栖所 经路径上的猎人杀死的野生鸭（Webster等人，1976)W及在家禽的流行性感冒监测分析 (influenzasurveillanceprogramsofpoultry)期间在香港从鸡、鸭和碟（Alexander等 人，1979)分离到。除了来自患有出血性肠炎的环颈鸭的分离株（Gou曲等人，1984)外，所 有其它分离株在家禽中似乎是非致病性的，并且发现它们在全世界的水禽中具有广泛分 布（Stanislawek等人，2002;Tumova等人，1989;Yamane等人，1982)。Gou曲等人报导在用 来自环颈鸭的分离株鼻内接种1周龄小鸭子和2周龄鸡后未获得临床体征，并且HI滴度极 低（1:8或更低）（Gou曲等人，1984)。类似地，作为流感监测项目的结果，APMV-6的第一个 分离株也是来自香港的家禽，并且据报导在鸡中是非致病性的（基于来自实验性感染的鸡 的低HI滴度）（Shortridge等人，1980)。然而，已报导了导致轻度呼吸性疾病和产蛋问题 的火鸡APMV-6感染（Alexander, 2003)。
[0011] APMV-8(碟/特拉华/1053/76)最早在美国从猎人杀死的加拿大碟（黑额黑雁 度rantacanadensis))分离而来（Rosenberger等人，1974)。南西班牙的猎鸟的血清学 研究（1990至1992)显示，APMV-8抗体在达到43%的测试血清中大量存在（Maldonado等 人，1995)。就APMV感染测定新西兰的活的健康驯化野鸭的状态的另一个血清学研究显示， APMV-8抗体在56%的测试血清中存在（Stanislawek等人，2002)。Warke等人（2008)描述 了 16%至31 %的被研究鸡血清可能本来具有APMV-8抗体。但因现有的抗APMV1的高滴度， 假阳性HI测试的可能性也可能存在，因为血清在HI测定中不能非常特异性地反应。除当 就禽流感病毒研究群体时分离的APMV-8的少数水禽分离株外（Stallknecht等人，1991)， 一直缺乏关于该病毒的流行和致病性的信息。
[0012] 用于NDV的负链RNA基因组的反向遗传学体系的开发使得可能将外源基因序列插 入基因组，从而使得可能产生用于接种和基因治疗的重组NDV载体（Krishnamudhy等人， 2000 ;Peeters等人，1999iRoemer-Oberdoerfer等人，1999)。已报导了表达外源病毒蛋白 例如流感病毒A型的化亚型的HA蛋白（化kaya等人，2001)、传染性腔上囊病病毒的VP2 蛋白（IBDVHHuang等人，2004)、册亚型（Veits等人，2006;Ge等人，2007)和亚型H7(Park 等人，2006)的禽流感染病毒血凝素的重组NDV载体。然而，仅在SPF禽中证明了大多数此 类疫苗的功效。NDV在家禽中引起灾难性疾病，导致家禽工业的严重经济损失。因此在世 界上大多数国家常规地给商业鸡接种抗NDV的疫苗。因此，来自已免疫的亲代群体的鸡具 有高水平的母传抗体。常规活NDV疫苗即使在运些抗体存在的情况下也提供保护作用。然 而，重组NDV疫苗（具有外源基因插入）与活NDV疫苗相比较通常更加减毒，它们的功效在 NDV母传抗体存在的情况下可被削弱。因此，存在对可为用于表达异源抗原的安全疫苗提 供基础的载体疫苗平台的需要。理想地，重组疫苗可诱导强体液免疫反应，可适用于大量施 用，并且廉价。
[001引发明概述
[0014] 本发明设及包含（i)重组APMV和（ii)药用或兽医学可接受的载体的疫苗或组合 物。本发明包括用于修饰APMV的基因组W产生重组APMV病毒或APMV病毒载体的方法；通 过此类方法制备的经修饰的APMV;DNA和蛋白质序列；W及利用此类重组APMV感染细胞和 宿主动物W引起所述细胞和宿主动物扩增外源DNA和由该外源DNA编码的蛋白质（包括抗 原性蛋白质）的方法。
[0015] 本发明的一个方面设及APMV病毒、参与制备经修饰的或重组的病毒的DNA和蛋白 质序列。本发明的一个实施方案设及APMV-2、4、6或8的基因组和蛋白质序列。
[0016] 本发明的另一个方面设及经修饰的重组APMV病毒（所述病毒具有增强的安全性、 强体液免疫反应）W及制备此类重组病毒的方法。
[0017] 本发明的另一个方面设及与已知的APMV或其它重组疫苗相比具有升高的安全水 平的重组APMV病毒疫苗或组合物。
[0018] 在另一个方面，本发明提供了用于在宿主中表达基因产物的未修饰的和经修饰的 APMV病毒载体。
[0019] 本发明的另一个方面设及通过将来自任何来源的DNA插入APMV基因组的基因间 区域或非必需区域而修饰的重组APMV病毒。根据本发明使用具有编码和表达抗原的异源 基因的合成地修饰的APMV病毒重组体来产生新型组合物或疫苗，
[0020] 本发明的另一个方面设及提供反向遗传学体系的APMV病毒载体，其中所述载体 可在不同的宿主动物中用作主链用于重组疫苗或组合物。
[0021] 在一个方面，本发明设及用于在W组合物或疫苗接种的宿主动物中诱导免疫反应 的药物组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包括药用可接受的载体和经修饰的APMV重组病 毒或病毒载体。在本发明的另一个方面，所述重组APMV病毒或病毒载体在病毒基因组的非 必需区域内包括编码来源于病原体的抗原性蛋白质的异源DNA，其中当给宿主施用时，所述 组合物或疫苗能够诱导特异于由所述病原体编码的蛋白质的免疫反应。
[0022] 本发明的另一个方面设及用于在动物中诱导对抗原的免疫反应的方法，所述方法 包括用含有经修饰的重组APMV病毒或病毒载体（所述载体包含和表达所述动物的病原体 的抗原决定簇）的疫苗或药物组合物接种动物。本发明的另一个方面设及在初免-加强方 案中诱导动物的对抗原的免疫反应的方法。
[0023] 本发明的另一个方面设及通过向细胞引入经修饰的重组APMV病毒来在体外细胞 培养物中表达基因产物的方法，其中所述基因可W是来源于病原体的抗原性蛋白。
[0024] 附图概述
[00巧]可结合附图理解通过举例给出的下列详细描述，运些实例并不意在将本发明限定 于所描述的具体实施方案，其中：
[0026] 图1是显示在用APMV-2、4、6于含胚鸡蛋中进行实验性感染后从鸡的几个器官进 行的病毒分离列表。
[0027] 图2是显示在用APMV-2、4、6进行实验性感染后鸡的几个器官的组织学结果列表。 [002引图3描述了利用APMV-2、4或6实验性接种的SPF鸡中的HI抗体滴度。对感染后 第2、4、7、14和25天收获的鸡血清样品进行HI测试W分析HI抗体的存在情况。
[0029] 图4显示利用APMV-8实验性感染的SPF鸡和鸭内的HI抗体滴度。利用剂量为 10屯1馬。的APMV-8口鼻感染鸡和鸭。在感染后第2、4、7、14和28天收集血清样品，利用 APMV-8抗原通过HI测试分析所述样品。HI血清滴度（Wlog2表示）示于左轴上。
[0030] 图5显示在利用APMV-8的初免/加强接种方案过程中SPF鸡中HI抗体滴度的发 展情况。在第1天（初免）和第14天（加强）利用剂量为106ΕΙ05。的APMV-8感染1日龄 SPF鸡。在第一次感染后第7天和第14天获得血清样品，在第二次感染后第7天和第14天 获得血清样品。对血清进行HI测试。HI血清滴度（Wlog2表示）示于左轴上。
[0031] 图6显示通过琼脂糖凝胶电泳分析RT-PCR产物。在感染后第2天从非感染的鸭 (C1-C5)和APMV-8感染的鸭（11-15)获取气管组织。将组织匀浆，制备RNAW用于RT-PCR。 平行制备水对照（W)。在1.5%琼脂糖凝胶上分离反应产物。通过使用lOObp分子量梯度 (New化glandBiol油S)作为片段大小的对照。DNA片段的大小显示于右边。
[0032] 图7是显示来自用APMV-8实验性感染的鸡和鸭的病毒分离列表。在含胚鸡蛋中 进行鸡组织的病毒分离，通过RT-PCR检测来自鸭组织的病毒RNA。
[0033] 图8是显示在用APMV-8感染鸡和北京鸭后几个器官的组织学检查结果的列表。
[0034]图9显示在用不同剂量的APMV-8感染后在SPF鸡中HI抗体滴度的发展情况。在 第1天用不同感染剂量（ID)的APMV-8感染或用病毒转运液（VTM)模拟感染1日龄SPF鸡。 在感染后第7天和第14天获取血液，通过HI测试分析获得的血清样品。HI血清滴度（W l〇g2表示）示于左轴上。血清样品的几何平均滴度（GMT)示于最底行。
[0035]图10显示在用不同剂量的APMV-8感染后北京鸭中HI抗体滴度的发展情况。在 第1天用不同感染剂量（ID)的APMV-8感染或用病毒转运液（VTM)模拟感染1日龄SPF北 京鸭。在感染后第7天和第14天获取血液，通过HI测试分析获得的血清样品。HI血清滴 度（Wlog2表示）示于左轴上。血清样品的几何平均滴度（GMT)示于最底行。
[003引图11是显示相应DNA和蛋白质序列的SEQIDNO的列表。
[0037] 图12A描述了APMV-8株（APMV-8:SCWDSID:M-7,从野鸭分离的）的全长基因组 序列和全长APMV-8基因组的遗传图谱。
[0038] 图12B描述了编码APMV-8核蛋白（NP)的DNA序列（SEQIDN0:2)和NP蛋白序 列（SEQIDN0:3)。
[0039] 图13描述了编码APMV-8憐蛋白（巧的DM序列（SEQIDN0:4)和P蛋白序列 (沈QIDNO:5)。
[0040] 图14描述了编码APMV-8基质蛋白（Μ)的DM序列（SEQIDN0:6)和Μ蛋白序列 佛QIDNO:7)。
[00川图15描述了编码APMV-8融合蛋白（巧的DNA序列（SEQIDN0:8)和F蛋白序列 (沈QIDNO:9)。
[0042] 图16描述了编码APMV-8血凝素/神经氨酸巧酶（HN)的DM序列（SEQIDNO: 10) 和HN蛋白序列（沈QIDNO: 11)。
[004引图17描述了编码APMV-8聚合酶（L)的DNA序列（SEQIDNO:和L蛋白序列 (SEQIDN0:13)。该APMV-8L(1)蛋白是从位于SEQIDN0:1 的位置 8273-8275 处的ATG密码子翻译的。
[0044]图18描述了APMV-8聚合酶（L)的蛋白质序列似（SEQIDN0:14)。该APMV-8L似 蛋白是从位于SEQIDNO: 1的位置8297-8299处的ATG密码子翻译的。SEQIDNO: 14不包 含SEQIDNO: 13的前8个氨基酸。
[004引图19A是APMV-8反向遗传学体系的流程图。图19B描述了APMV-8病毒在MDCK 细胞中的复制结果。
[0046] 图20描述了在APMV-8接种2周后商业肉鸡的HI测试结果。
[0047] 图21描述了在APMV-8接种4周后商业肉鸡的HI测试结果。
[0048] 图22显示在卵内接种（inovovaccination)后第18天HI测试的结果（研究1)。
[0049] 图23描述了在卵内接种后第19天HI测试的结果（研究2)。
[0050] 图24显示了在卵内接种后第18天HI测试的结果（研究3)。
[005。图25描述了 5'-全长基因组（5'-化G)和3'-全长基因组（3'-化G)序列，包括 侧翼序列。
[0052]图 26 描述了pcNDA-NP，pcNDA-P，pcDNA-L和PCDNA3-T7的质粒图谱。
[0053]图 27 描述了PUC18-MG-APMV-8和PCITE4A-EGFP的质粒图谱。
[0054] 图28描述了pUC57-FkAPMV-8的质粒图谱。
[0055] 图29描述了微型基因组APMV-8序列。
[0056] 图30显示NP蛋白质序列比对W及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。
[0057]图31显示P蛋白序列比对化及DM和蛋白质水平上的序列同一性。
[005引图32显示Μ蛋白序列比对W及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。
[0059] 图33显示F蛋白序列比对化及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。
[0060] 图34显示ΗΝ蛋白序列比对及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。
[006。图35显示L蛋白序列比对化及DNA和蛋白质水平上的序列同一性，
[00的]发明详述
[0063] 应理解在本公开内容，特别是在权利要求中，术语例如"包含"、"包括"、"含有"等 可具有美国专利法中所赋予的意义；例如，它们可意指"包括"、"包含"、"含有"等；并且术语 例如"基本上由……组成"和"基本上由……构成"具有美国专利法中所赋予的意义，例如， 它们允许有未明确记载的要素，但排除在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新特征 的要素。
[0064] 除非另外指出，否则按照常规惯用法使用技术术语。分子生物学中的常见术语 的定义可见于BenjaminLewin的GenesV，由OxfordUniversityPress, 1994(ISBN 0-19-854287-9)出版；Ken化ew等人（eds.)，TheEncyclopediaofMolecularBiology， 由BlackwellScienceLtd.，1994(ISBN0-632-02182-9)出版；和RobertA.Meyers(ed.)， MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference， 由VCH Publishers,Inc. ,1995(ISBN1-56081-569-8)出版。
[006引除非另外明确地指出，否则单数"一种/个（a)"、"一种/个（an)"、"该/所述 (the)"包括所指物的复数形式。类似地，除非另外明确地指出，单词"或"意指包括"和"。 单词"或"意指特定列表的任一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
[0066] 应指出，在本公开内容和所述权利要求和/或段落中，术语"禽副粘病毒"或 "APMV"可互换使用，意指和包括APMV-l、APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-5、APMV-6、APMV-7、 APMV-8及APMV-9。
[0067] 术语"动物"在本文中包括所有哺乳动物、鸟类和鱼。本文中使用的动物可选自马 科动物（例如，马）、犬科动物（例如，狗、狼、狐狸、丛林狼（coyote)、對（jackaU)、猫科动 物（例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其它大型猫科动物W及其它猫科动物包括猎豹和山猫）、 牛类动物（例如，牛）、猪类（例如，猪）、羊类（例如，绵羊、山羊、美洲驼、野牛）、禽类（例 如，鸡、鸭、碟、火鸡、鹤譜、锥、醋、雀、鹰、鸦、驼鸟、食火鸟（emu)和食火鸡）、灵长类动物 (例如，原猴、附猴、猴、长臂猿、猿）、人和鱼。术语"动物"还包括处于所有发育阶段（包括 胚胎期和胎儿期）中的个体动物。
[0068] 术语"多肤"和"蛋白质"在本文中可互换使用，意指连续氨基酸残基的聚合物。
[0069] 术语"核酸"、"核巧酸"和"多核巧酸"可互换使用，是指RNA、DNA、cDNA(互补DNA) 或cRNA(互补RNA)及其衍生物，例如包含经修饰主链的形式。应理解，本发明提供了包含 与本文中描述的序列互补的序列的多核巧酸。本发明中设及的"多核巧酸"包括正向链巧' 至3')和反向互补链（3'至5')。根据本发明的多核巧酸可不同的方式制备（例如， 通过化学合成，通过基因克隆等）并且可采取不同形式（例如，线性或分支的，单链或双链 的，或其杂交体、引物、探针等）。
[0070] 术语"基因组DNA"或"基因组"可互换使用，是指宿主生物的可遗传