F鸡蛋中两次亚传代（subpassage)后在任 何时间点上任何收集的鸭组织都未分离出病毒。因此，基于可获得的APMV-8序列信息设计 RT-PCR引物，W检测在收集的组织样品中病毒RNA的存在（图7)。在感染后第2天，在气 管（图6)、肠和膜腺中检测到病毒RNA，而在感染后第4天在所有分析的器官中检测到病毒 RNA。在感染后第7、14和28天，只在气管和肺中检测到病毒RNA。使用获自模拟接种禽类 的器官的RNA进行的RT-PCR未扩增到RT-PCR片段，表示运些禽类中不存在APMV-8的扩增。
[0162] 为了评估被研究的病毒的病理潜能，分析器官中显微镜损伤的存在（图8)。在感 染后第2天，在所有感染的鸡中观察到轻度多病灶增生性气管炎。其余器官显示与对照组 无差异。APMV-8感染的鸡显示在感染后第4天气管的呼吸上皮的病灶减小或再生（表示愈 合）。此外，禽类也显示表示病毒感染的轻度多病灶淋己细胞性膜腺炎。感染的鸡在感染后 第7天显示肺的变化，例如中度至重度的BALT、气管的变化例如卡他性气管炎和多病灶淋 己细胞性膜腺炎。运些发现与抗原性刺激一致。在感染后第14天，在感染的鸡中观察到与 愈合一致的气管变化W及表示病毒感染的膜腺变化例如表示病毒感染的淋己细胞性膜腺 炎。在感染后第28天，在一些感染的鸡中只观察到轻度卡他性气管炎和轻度肠炎。在感染 的鸭中，在感染后第2天观察到多病灶轻度淋己细胞性气管炎、肺的变化（间质性肺炎）和 肠的变化（淋己细胞性肠炎），而在感染后第4天看见与呼吸道感染一致的气管变化。在感 染后第7天，感染的鸭显示与病毒感染一致的淋己细胞性气管炎和膜腺炎，而在感染后第 14天观察到的卡他性气管炎表示愈合。此外，感染的鸭在感染后第14天显示淋己细胞性膜 腺炎。后来，在感染后第28天，在感染的鸭的肺中注意到BALT增生W及还有轻度多病灶异 嗜性气管炎化eterophilictracheitis)。两种病理性显微镜损伤都表示病毒感染。在未 感染的对照中未观察到被检查器官的变化。 阳16引 J.诱导免巧巧麻所需的最小剂量的确定
[0164] 为了检查诱导鸡中血清转化所必需的最小感染剂量，将APMV-8的10倍稀释物用 于感染10只1日龄SPF鸡（图9)。对于HI测试，使用4个HA单位，其导致被视为阳性的 阔值16。在感染后第14天获取的血清样品显示为103的EID50足W在4/10只鸡中诱导被 认为是阳性的免疫反应（GMT11)。在用104的EID50感染后第14天，10只禽中有9只显 示> 16的滴度（GMT34)。利用1〇5和10 6的EID50的感染在感染后第14天在所有禽中诱 导> 16的HI滴度，GMT分别为73和137。
[0165] 基于该结果，用从l(f/禽的剂量EIDs。直至10V禽的剂量EIDs。的APMV-8感染8 只鸭的每一只（图10)。8只鸭中有6只在感染后第14天产生显著的滴度16)，在用 10^禽的EID50感染后GMT为14。在感染后第14天，用10^禽的EIDs。感染的6/8只鸭和 用1〇6/禽的61?。感染的7/8鸭产生显著的滴度16)，GMT分别为17和23。
[0166] 实施例3APMV-8的全长序列的确定
[0167] 为了确定APMV-8的全长序列，最初需要病毒RNA序列信息。为此，通过使用引物 (APMV-pol^，参见表1)克隆病毒基因组的3'-末端，所述引物包含基于APMV1 (Genbank登 录号AF077761)、APMV-2(Genbank登录号抓338414)和APMV-6(Genbank登录号EF569970) 的可获得的3'-序列的简并序列。使用化曲PureRNA分离试剂盒（Roche,Mannheim, Germany)从尿囊液纯化病毒RNA。按照制造商的说明书，使用5'RACESystem化rRapid AmplificationofcDNAE；nds2.0版（Invitrogen)扩增序列。获得几个片段，将其进行 凝胶洗脱，克隆入ΤοροTA克隆载体（Invitrogen)，对阳性选择的克隆进行测序。在针对 NCBI数据库进行的nblast捜索中分析获得的核巧酸序列，显示无相似性。针对NCBI数据 库的忧lastx捜索显示与禽副粘病毒2 (APMV-2/鸡/加利福尼亚Aucaipa/56,Genbank 登录号抓338414)的核蛋白呈现83%的相似性，W及与禽副粘病毒6株（APMV-6/碟/远 东/4440/2003,Genbank登录号EF569970)的核蛋白呈现56%的相似性。利用该引物，使 用 5,RACESystemforRapidAmplificationofcDNAE；nds2.0 版（Invitrogen)进行 引物步移法。5' -RACE产生约8(K)bp的片段。通过使用该技术，基于来自先前序列的序 列信息（其已被用于描述新型寡核巧酸）获得新的序列信息。也通过5' -RACE法确定病 毒基因组的5'-末端。在用T4RNA连接酶1Wew化glandBiol油S)连接RNA后获得病毒 基因组的3'-末端。利用化曲化reRNA分离试剂盒（Roche)再次纯化连接反应物，使用 如perscriptIIIOneSt巧RT-PCR试剂盒，利用PlatinumTaqQnvitrogen)进行RT-PCR。 将获得的cDNA片段克隆入pCR2. 1载体（Invitrogen)中，并且对其进行测序。在两个方向 上对来自每一个克隆片段的3个质粒进行测序，获得每核巧酸有6个覆盖度的序列。
[0168] 被分析的APMV-8株的全长基因组序列为15342个核巧酸，运与对于副粘病毒亚科 (Paramyxovirinae)的六规则（the rule of six) (Calain，P. &Roux，L.，1993)-致。已检 测到6个开放阅读框（ORF)，它们编码蛋白质。使用蛋白质序列与其它禽副粘病毒的蛋白质 的相似性将蛋白质的顺序确定为3'-NP-P-M-F-HNA-5'(基因组序列SEQ ID N0:lW5' 至3'方向的反基因组形式存在）。运些蛋白质的ORF的推定起始和终止密码子W及理论分 子量(Swiss Institute of Bioinformatics ExPASy网站）不于表2中。
[0169] 表2由APMV-8序列编码的蛋白质的参数
[0170]
[0171] 通过确定NP基因的推定基因起始序列（前导序列）和L蛋白的推定基因末端序 列（尾随序列）来确定推定的基因组前导序列和尾随序列。前导序列位于核巧酸1至核 巧酸55。NP基因的推定基因起始序列（nt56-63)终止了其前导序列。尾随序列位于病 毒基因组中的最后基因末端序列之后。由于RNA聚合酶基因的两个推定基因末端序列（nt 15161-15171或15288-15297)的存在，已鉴定了两个推定的尾随序列（ntl5172-15342或 nt15289-15342)。推定的基因起始序列（含有多聚G的序列）和基因末端序列（用于多 聚腺巧酸化的信号序列）W及基因间序列的位置概述于表3中。
[0172] 表3 APMV-8的推定基因起始、基因间和基因末端序列的序列和定位
[0173]
[0174] 表4沈Q IDNO与DNA和蛋白质序列
[0175]
[0176]APMV-8的推定的基因起始序列是保守的，其包含多聚（C)5序列，后接3'-GCU-5' 序列。唯一例外是病毒RNA聚合酶的推定的基因起始序列（3'-CUCCCGCU-5')。推定的基 因末端序列也是保守的，并且在基因组病毒5'序列中包含多聚扣)e序列（表5)。
[0177] 表5APMV-8的基因起始和基因末端序列 [017引
[0179]运些序列是基于对于禽腮腺炎病毒属的其它副粘病毒描述的序列预测的（化ang等人，2001，化yak等人，2008,Jeon等人，2008)。对于RNA聚合酶的0RF存在两个可能的起 始密码子。第一个起始密码子（η巧273-8275)位于HN0RF与病毒RNA聚合酶0RF之间的 基因末端-基因间区域-基因起始区域内。运使得该起始密码子可能性很小，但并非不可 能。第二个起始密码子（8297-8299)位于基因末端-基因间区域-基因起始区域的下游， 并且可能充当起始密码子用于起始APMV-8的RNA聚合酶的翻译。
[0180]APMV-8的基因组的长度为 15：34化t。运比APMV-1(SQIDNO: 15,15186nt， (1616611讯&口6616'3，1999)、4口]\1￥-2669 10側：16，14,904111，8油61址等人，2008)和 APMV-4(SEQIDN0:18，15054nt，化yak等人，2008)大，而比APMV-3(SEQIDN0:17， 16,27化1，1(皿曰'等人，2008)和八口]\^-966910^:20，15,438111，8曰1111161等人，2009)小。 前导序列的55nt的长度似乎在所有APMV之间是保守的（Krishnamudhy&Samal，1998， deLeeuw&Peeters，1999,Subbi址等人，2008,Nayak等人，2008,Kumar等人，2008,Samuel 等人，2009)，而尾随序列似乎在长度上是可变的。对于APMV-8,病毒基因的基因起始和 基因末端序列也是高度保守的（如表5中显示的）。对于APMV-2(Subbi址等人，2008)、 APMV-3(Kumar等人，2008)、APMV-4(Jeon等人，2008,化yak等人，2008)、APMV-6(Chang等 人，2001)和最近对于APMV-9(Samuel等人，2009)的序列也有运样的描述。全长序列的核 巧酸数是6的倍数，运与6对于副粘病毒的基因组的作用一致（Kolakofsky等人，1998)。
[0181]APMV-1、2、3、4、6、8和9基因组序列之间的序列同一'性示于表6中。
[018引表6APMV-1，2, 3, 4,6, 7,8和9的基因组之间的序列同一性百分比
[0183]
[0184]使用VectorNTI11. 0 (PC)软件包（Invitrogen，1600FaradayAve.，Carlsbad, CA)测定两个核酸或多肤序列之间的百分比序列同一性。将缺口开放罚分15和缺口延伸罚 分6.66用于测定两个核酸的同一性百分比。用缺口开放罚分10和缺口延伸罚分0.1测 定两个多肤的百分比同一性。基于更短的序列计算百分比同一性。
[0185] 实施例4利用APMV-8株接种1日龄肉鸡
[0186] 按照下面显不的表7将20只1日龄的肉鸡分成两组。
[0187] 在第1天，给1日龄鸡放血W使用血凝集抑制测定法（HI测试）来测定针对新城 疫病毒（NDV)和APMV-8的抗体状态。运一测试使用来自NDV株Lasota或APMV-8感染的 SPF蛋的尿囊液进行。将4个HA单位的NDV株Lasota或APMV-8和1%鸡红细胞用于HI 测试。所得的HI滴度显示鸡的血清包含针对NDV的HI抗体，但无可检测的针对APMV-8病 毒的抗体。
[018引表7. 1日龄肉鸡的感染/接种[0189]
[0190] 在第1天，通过鼻途径用10??。的APMV-8株感染10只鸡的组1，组2的10只鸡 不被感染，用作对照。
[0191] 在感染后14天（第14天），给鸡放血，再次分析所获得的血清样品中针对NDV和 APMV-8的HI抗体的存在（图20)。结果显示，APMV-8接种的鸡显示使用APMV-8作为抗原 的HI滴度。APMV-8特异性HI滴度为128至2048。针对NDV的HI滴度下降至低于16的HI 滴度，从而它们被认为不是NDV阳性的。此结果显示针对NDV的鸡母传抗体未阻止APMV-8 的感染，从而运类抗体不太可能干扰APMV-8接种。
[0192] 在感染后14天（第14天），使组1和组2的鸡分开。再次用10??。的APMV-8 株感染组1(组1-1)和组2(组2-1)各自的5只鸡（表7)，每一组中的剩下的5只鸡（组 1-2和组2-2)不被感染。本实验经设计用W研究鸡的后一感染对感染是否具有影响W及第 二次感染（加强接种）是否会增加抗体滴度。14天后（第28天），给所有鸡再次放血，研 究血清中APMV-8和NDV抗体的存在。血清滴度（图21)显示，第14天的第一次接种（组 2- 1)诱导了范围在32至512之间的APMV-8特异性抗体滴度。在只在第1天接种的鸡（组 1-2)中，抗体滴度下降至范围在128至512之间的滴度。在已在第1天和第14天接种的 鸡（组1-1)中，APMV-8特异性抗体滴度不增加，表明用于第二次感染的病毒被第一次感染 诱导的APMV-8特异性抗体中和。未接种对照（组2-2)的血清不包含APMV-8特异性HI抗 体。在第28天，NDV抗体进一步下降，20只鸡中只有11只鸡显示针对NDV抗原的任何HI 滴度，而在第14天有14只鸡显示抗NDV的低抗体滴度。
[019引实施例5含胚SPF蛋的卵内接种
[0194] 进行本研究W测试利用APMV-8的卵内接种是否导致鸡的抗体反应W及卵内接种 是否干扰解化率和存活率（liv油ility)。
[019引 在研究 1 中，在解育的第 18 天使用INOV(UECT(PfizerAnimalHealth，NY，USA)， 利用APMV-8病毒株卵内接种108枚SPF蛋。将病毒稀释在0.9%无菌化Cl盐水中。稀 释病毒的返滴定化acktitration)显示105'5ΕΙ050/100μ1的滴度。作为对照，用0. 9%无 菌化C1盐水接种108枚蛋。用于接种的体积为100μ1/蛋。从对照组解化出80只鸡，从 APMV-8接种的组解化出45只鸡。将来自每一个组的10只鸡转移到一个化rsefall-Bauer 单元中。此外，将APMV-8接种组的鸡与对照组的5只鸡共同混合在化rsefall-Bauer单元 中，W测试接种后APMV-8的传播。随意提供水和饲料。在解化后14天和28天，采集血液样 品，使用4个HA单位和1 %的鸡红细胞测试针对APMV-8的HI抗体的存在情况。结果（图 22)显示，在解育的第18天卵内接种导致免疫反应，如通过测试的血清样品中HI滴度的存 在表明的。在解育后14天，在卵内接种的组中观察到256至4048的HI滴度。在接触的鸡 的血清中，在与来自接种组的鸡接触后14天观察到256至2048的HI滴度，表明用于接种 的病毒排毒（shedding)。对照组不显示任何特异于APMV-8的HI滴度。14天后，再次给鸡 放血，其在APMV-8接种组中显示256至4096的滴度，并且在APMV-8接触组中显示256至 1024的滴度。对照组未显示APMV-8HI抗体的存在，
[0196] 在研究2中，在解育的第19天使用IN0VCUECT卵内接种88枚SPF(无特殊病原 体）蛋。将APMV-8病毒株稀释在0.9%无菌化C1盐水中。如在稀释的病毒的返滴定后观 察到的，病毒的滴度为105'7?ID5。/100μl。作为对照，用0.9%无菌化Cl盐水接种88枚SPF 蛋。用于接种的体积为100μ1/蛋。从对照组（化印解化出74只鸡，从APMV-8接种的组 解化出76只鸡。将来自每一个组的10只鸡转移到一个化rsefall-Bauer单元中。随意提 供水和饲料。在解化后14天，采集血液样品，使用4个HA单位和1 %的鸡红细胞测试针对 APMV-8的HI抗体的存在。结果（图23)显示，在解育的第19天进行卵内接种导致了免疫 反应，具有特异于APMV-8的HI滴度。在解育后14天，在APMV-8卵内接种的组中观察到 256至4048的HI滴度。对照组未显示任何特异于APMV-8的HI滴度。在解育后第28天再 次给鸡放血。APMV-8接种的组的HI滴度在512至4096的范围内（图23)，而对照鸡的血 清仍然为APMV-8阴性。
[0197] 在第3个研究中，在解育的第18天使用IN0VCUECT分别用103'弔1馬。和104'5EIDw 卵内接种组1和组2的108枚SPF蛋。将APMV-8病毒株稀释在0. 9 %无菌化Cl盐水中。 在第Ξ组中，用0. 9%无菌化C1盐水接种108枚SPF蛋作为对照。从组1解化出83只鸡， 从组2解化出79只鸡，从组3解化出88只鸡（参见表8)。在解化后，将来自每一个组的 10只鸡转移到一个化rsefall-Bauer单元中。随意提供水和饲料。在解化后，用100μ1体 积的10巧IDwAPMV-8病毒在颈部皮下接种来自组3的10只鸡。在解育后14天，采集血液 样品，使用4个HA单位和1 %的鸡红细胞（CRB巧测试针对APMV-8的HI抗体的存在。结果 (图24)显示，在解育的第18天卵内接种导致了免疫反应，具有特异于APMV-8的HI滴度。 在解育后14天，在APMV-8卵内接种的组中观察到4096至16384的HI滴度。对照组未显 示任何特异于APMV-8的HI滴度。用APMV-8皮下接种的组显示滴度在64至4096之间范 围的血清转化。在解育后第28天再次给鸡放血，测试APMV-8特异性HI抗体的存在。在解 育后第4周的HI滴度下降，范围在512至4096之间。对照组不显示任何特异于APMV-8的 HI滴度。皮下接种的组的HI滴度显示范围在32至256之间的HI滴度。
[019引表8
[0199]
[0200] 实施例6APMV-8株的反向遗传学的开发和表达异源基因的APMV-8突变体的产生 阳20。巧含APMV-8的NP、P巧L基闲的表武质粒的构律
[0202] 为了建立用于副粘病毒的反向遗传学体系，必需建立表达参与病毒RNA复制的蛋 白质的质粒。将3个APMV-8蛋白（核蛋白NP、憐蛋白P、RNA依赖性RNA聚合酶蛋白或蛋 白U的开放阅读框（0RF)克隆入真核表达载体pcDNA3(Invit;rogen，California,USA)。 为此，使用Hi曲PureRNA分离试剂盒（Roche,Basel,Switzerland)纯化包含APMV-8的 尿囊液的RNA。使用Titan化e化beRT-PCR试剂盒（Roche)将纯化的RNA用于逆转录聚 合酶链式反应（RT-PCR)。使用适当的引物对：[NP(NP-FP，NP-RP)、P(P-FP，P-RP)、UL-FP， kRP)，参见表9]扩增运些蛋白质的0RF。在0. 7 %琼脂糖凝胶上分离反应产物，按照制造 商提供的方案使用QIAquickGelExtraction试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany)从凝胶 洗脱反应产物。将RT-PCR片段与适当的限制性内切酶（NP和P利用EcoRI/Notl;L利用 化ηI/Notl) -起溫育，再次凝胶洗脱，将其连接至用适当的限制性内切酶切割的真核表达 载体pcDNAS中。将连接反应物转化入ToplOF细胞（Invitrogen)，用适当的限制性内切酶 消化从ToplOF细胞收获的质粒DNA(参见上文）。对包含具有适当大小的DNA片段的质粒 (pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L)进行测序。
[0203] 表9.用扩增RNP复合物的蛋白质的基因的引物
[0204]
[0205]a引物序列包含用于克隆的限制性内切酶切割位点。限制性内切酶位点W粗体标 示出。起始和终止密码子W斜体字突出。病毒特异性序列W下划线标示。
[0206]b根据病毒信使RNA的引物序列方向。
[0207] C位置在显示的全长基因组中是病毒特异性序列。 阳20引 巧含APMV-8的仓长基闲紀的质粒的构律
[0209] 为了产生包含全长APMV-8基因组的质粒，基于两个不同部分巧'-FLG，3'-FLG，参 见图25)产生的共有序列合成（Genscript，NewYork,USA)病毒的cDNA基因组。从核巧 酸1-5564合成病毒序列的5'-部分巧'-FLG，SEQIDNO: 47)。在此APMV-8序列之前为由 CMV-IE启动子组成的序列盒、随后为用于Xmal的限制性酶切割序列（用于可能的随后克 隆方法）和键头核酶序列。在该序列的5'-末端和3'-末端，分别添加NotI和SacII的 限制性内切酶切割位点。序列（核巧酸5503-15342)的合成的3'-部分（3' -FLG，SEQID N0:48)后接肝炎δ核酶序列和牛生长激素的poly-A信号序列。为了克隆目的，在3'-FLG 的5'-末端添加用于NotI限制性内切酶的序列，并且在该序列的3'-末端添加用于Sac II的限制性内切酶的序列。唯一的限制性内切酶度mtI)的序列位于5' -FLG与3'-FLG 的交叠部分（核巧酸5503-5564)内，该酶在全长序列的核巧酸5541处切割。将DNA的两个 部分（5'-化G，3'-化G)分开地连接至质粒pUC57(Genscript)中，得到质粒PUC57/5'-化G 和PUC57/3' -化G。为了将两个片段克隆在一起，用Bmtl和SacII切割PUC57/5' -化G，凝 胶洗脱含有5'-FLG的质粒。平行地，用相同的酶切割pU巧7/3'-FLG，洗脱片段3'-FLG。随 后将3' -FLG连接至含有5' -FLG的质粒中，获得包含处于CMV-IE启动子控制下的APMV-8 基因组的全长cDNA序列的质粒（pUC57-FkAPMV-8)。 阳210]巧含APMV-8微小基闲紀的质粒的构律
[0211] 使用由Conzelmann等人（JVirol. 68:713-719,1994)描述的方法，构建包含APMV-8微小基因组的所有功能元件的质粒（pMG-APMV-8)。质粒pMG-APMV-8包含侧翼连接 有T7启动子和反基因组δ肝炎病毒核酶序列的APMV-8基因组尾随区和前导区（Collins, 等人，PNASUSA88:9663-9667,1991)。该反基因组δ肝炎病毒核酶序列后接T7转录终止 子序列。W反义方向定位的加强型绿色巧光蛋白的编码序列位于在尾随区与前导区之间。3 个额外的G残基位于尾随信号之前，紧接Τ7启动子之后。该插入物侧翼连接限制性内切酶 切割位点EcoRI和NotI，将其平端克隆入质粒pU巧7。将该构建体亚克隆入质粒PUC18。 为此，随后用EcoRI和化ndIII切割质粒pMG-APMV-8,凝胶洗脱适当的片段，将其连接至 适当切割的质粒PUC18中，获得PUC18-MG-APMV-8。通过测序确认插入物的存在。 邮1引 化许表武T7聚合酶的表武质粒的产牛
[021引为了产生编码T7DNA依赖性RNA聚合酶灯7聚合酶）的质粒，通过Genscript合 成编码序列（GenBank登录号AY264778)。修饰T7聚合酶序列（SEQIDN0:49)W最优化 用于在真核系统中表达的密码子用法和除去序列中的可能的剪接供体/受体位点。T7聚 合酶编码序列侧翼连接有EcoRI(5')和NotI(3')位点。将合成的片段平端克隆入载体 pUC57(pOJ57-T7)。用EcoRI/Notl切割该质粒，凝胶洗脱T7聚合酶编码片段。随后将此片 段克隆入真核表达载体pcDNA3