专利名称：Hsv－1病毒载体系统及构建和快速导入方法
技术领域：
本发明涉及遗传工程C12N 15/00，病毒载体介导的基因转移技术及构建。
随着社会健康保障体系的完善和发展，人口老化现象在我国乃至全世界已日趋显著，患Alzheimer氏病(老年性痴呆症)的患者数量也随之不断增加。这是一种以慢性进行性痴呆为主要临床表现的大脑变性性疾病，迄今为止，尚无任何有效的治疗办法。由于这种疾病造成患者生活不能自理，给家庭和社会造成沉重的负担。因此，Alzheimer氏病已成为困扰人类的一大难题。
近年来，分子生物学技术及现代医疗技术的飞速发展，给Alzheimer氏病的基因治疗提供了可能性。因此与其它的疑难症及不治之症的基因治疗一样，Alzheimer氏病的基因治疗研究，已成为目前世界各国关注的热点。神经病理学研究证明，Alzheimer氏病的主要病理改变是大脑内侧颞叶部位的神经元细胞，随着年龄的增长，不断发生变性、减少和萎缩，并由此而引起这些神经元功能降低或丧失，因为这些神经元和记忆功能相关，因此，上述神经元的变性及其功能丧失将造成痴呆。这些神经病理学研究结果也告诉我们，如果进行Alzheimer氏病的基因治疗，其关键是如何改善和恢复变性神经元的功能。目前国际上，尤其是美国Alzheimer氏病的基因治疗，研究发展很快，并且已经建立了旨在将Alzheimer氏病的基因治疗技术实用化的大型研究企业(Geron，California，1993)，专门从事细胞老化的分子生物学研究，针对淀粉样变性的基因治疗和用生长因子为目的基因的基因治疗研究，有的也已经进行临床实验阶段。但是，这些基因治疗所采用的治疗方案都是先给病人做开颅手术，然后经手术开颅部位向脑内直接注入载体细胞的体细胞基因治疗方案。这种基因导入途径不但是有创性的，而且也难以准确定位，对于Alzheimer氏病的患者来说，都必须先施行开颅手术，这一点是很难以接受的，而且要维持治疗效果，需再次开颅向颅内重复给药，这就更难实施。所以该唯一治疗方案也难以推广应用。因此，探索由外周神经采用非手术方式，向皮质中枢导入目的基因的新途径，对于实施脑内神经元疾病的基因治疗具有重要意义。
本发明的目的是提供一种不需手术、患者无痛苦的基因治疗物质、其构建方法及快速高效给药方式，一种单纯疱疹病毒-I型(HVS-1病毒)载体系统的构建及快速导入方法。HVS-1病毒载体系统的表达式
它含有缺陷型单纯疱疹病毒HSV1的启动子IE、外源目的基因神经生长因子NGF、SV40和HSV1包装点as，其特征是目的基因NGF的功能片段cDNA在BamH1酶切位点上，形成HSV-1病毒载体系统。
性质对宿主神经细胞具有高度特异性，特别是对有丝分裂后的神经元细胞具有高度亲嗜性。
HVS-1病毒载体系统的构建方法包括利用生物工程产品的外源目的基因NGF、单纯疱疹病毒-I型、内切酶、连接酶、应用分子生物学的基因重组技术，其特征是将外源性目的基因NGF(神经生长因子)的互补(cDNA)功能片段克隆到病毒载体的内切酶BamH1的酶切位点上，构建成HSV-1病毒载体系统。构建好的质粒经过转化、扩增后，用溶菌酶SDS裂解细菌，酚氯仿提取DNA、乙醇沉淀、TE溶解DNA，通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡高心法，45000rpm18小时，提纯质粒DNA。应用分子生物学的缺失变异包装技术，对上述构建的粒子进行转染和对HSV-1载体病毒进行包装。以HSV-1 17tsk辅助病毒感染Vero细胞，将脂质体DNA复合物逐渐加到无血清培养液中混匀，31℃培养三天，获得有病毒外膜的载体病毒，用空斑形成实验测定病毒滴度为107pfu/ml。
HSV-1病毒载体系统用于临床的快速导入方法，利用其对神经元细胞的高度亲嗜性，选择嗅神经作为导入通道，将0.1mlHSV-1，病毒滴度为106pfu/ml，从鼻腔注入，该构建成的这种单纯疱疹病毒-I型载体系统便能迅速进入Alzheimer氏病的病变部位(中枢的海马、杏仁核等内侧颞叶部位)通过外源目的基因产物神经生长因子NGF对功能降低或丧失的病变神经元起到赋活的作用，从而达到对Alzheimer氏病基因治疗的目的。
单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex virus typeI，HSV-1)，具有嗜神经细胞的特点，能感染有丝分裂后的神经细胞，并在神经轴突及突触间运动，在神经元内长期潜伏感染。病毒DNA以闭合环状的双链形式存在于细胞核中，不影响细胞的功能。所以根据HSV-1的特点，应用构建的HSV-1系统携带NGF基因通过嗅神经通路，快速导入至Alzheimer神经中枢病变部位并获得高活性、长期高表达的效果，是成功地进行肿瘤基因治疗的决定因素和技术关键。本发明的病毒载体系统的构建及快速导入方法在国内外末见报导，为国际首创。
众所周知，实行有效的基因治疗，其关键之一还在导入的靶细胞中是否能基因治疗的逆病毒载体相比，其有明显特性(1)新载体对宿主细胞(神经元细胞)具有高度特异性，特别是对有丝分裂后的神经元细胞具有高度亲嗜性。(2)新型载体具有100％的导入效率。(3)嗅神经的生理特征只是与大脑内侧的颞叶部位相连通，利用这种病毒载体，通过自然感染途径，将目的基因从特定的外周神经导入后，可逆行到达与之相连系的中枢皮质神经元内，并在其中长期表达外源基因。因此选择这一通道给药，导入定位确切，易于发挥疗效。
权利要求
1.一种HSV-1病毒载体系统，用于Alzheimer氏病的基因治疗，其特征是单纯疱疹病毒-I型(Herpes Simplex Virus Type I，HSV-1)载体系统表达式
它含有缺陷型单纯疱疹病毒HSV-1的启动子IE、外源目的基因NGF、SV40、PolyA位点和HSV1包装点as，其特征是目的基因NGF的功能片段cDNA在BamH1酶切位点上，形成HSV-1病毒载体系统。性质对宿主神经细胞具有高度特异性，特别是对有丝分裂后的神经元细胞具有高度亲嗜性。
2.一种HSV-1病毒载体系统的构建方法，包括利用生物工程产品的目的基因NGF基因、缺陷型病毒、内切酶、连接酶、应用分子生物学的基因重组技术和缺失变异包装技术，其特征是将外源性目的基因神经生长因子基因的cDNA功能片段克隆在缺陷型病毒的内切酶BamH1的酶切位点上，构建成HSV-1病毒载体系统；构建好的质粒经过转化、扩增后，用溶菌酶SDS裂解细菌，酚氯仿提取DNA、乙醇沉淀、TE溶解DNA，通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法，45000rpm18小时，提纯质粒DNA。
3.根据权利要求2所述的HSV-1病毒载体系统的构建方法，其特征是所采用的缺失变异包装技术对构建的质粒进行转染和对载体病毒进行包装以1pfu/ml的HSV-1 17tsk辅助病毒感染Vero细胞，在37℃中吸附1小时，弃去病毒液，用无血清的1640培养液洗三遍，加2ml无血清培养液，将预先准备好的脂质体DNA复合物逐渐加到培养液中混匀，置31℃中培养三天，收获的病毒为包装有病毒外膜的载体病毒；用空斑形成实验测定病毒滴度为107pfu/ml。
4.一种使构建的HSV-1病毒载体系统用于临床的快速导入方法，其特征是利用病毒对神经细胞具有亲嗜性的特性，选择嗅神经作为该病毒载体的导入通道；将获得的高滴度HSV-1病毒载体0.1ml，滴度106pfu/Ml，从患者鼻腔注入，该载体能迅速进入Alzheimer氏病的病变部位，通过外源目的基因产物NGF对病变神经元功能的降低或丧失起到赋活的作用，从而达到对Alzheimer氏病基因治疗的目的。
全文摘要
HSV－1病毒载体系统及构建和快速导入方法,其特征是将外源性目的基因NGF神经生长因子基因的互补DNA(cDNA)功能片段克隆到病毒载体的内切酶BamHl的酶切位点上,并对构建的质粒转染和包装,构建成HSV－1病毒载体系统。利用病毒对神经有亲嗜性的特性,选择嗅神经作为该病毒载体的导入通道;将获得的高滴度HSV－1病毒载体0.1ml(浓度10
文档编号C12N15/64GK1242426SQ9811417
公开日2000年1月26日 申请日期1998年7月22日 优先权日1998年7月22日
发明者任常山, 张朝东, 隋承光, 陈红 申请人:中国医科大学