一种鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体、构建方法及用图
【专利说明】-种鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体、构建方法及用途 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体、构建方法及用途。 (二）【背景技术】
[0002] 在21世纪，随着基因组时代的到来，蛋白质组学既将得到迅速发展，可W预料必 有大量人体蛋白质和多肤活性分子发现，为了大规模制备其中许多新发现的具有医学和工 业价值的蛋白质物质，基因工程表达系统现已再次成为新的研究热点，细胞基因工程产物 往往不具备生物活性，必须经过糖基化、径基化等一系列修饰加工后，才能成为有效的药 物，而且细胞基因工程又因为动物细胞的培养条件要求相当苛刻，成本太高，限制了规模生 产，而动物生物反应器由具有低成本、短周期、高效益的特点，能很好的满足W上要求，因此 科学家们想通过借助高等动物个体作为生物反应器来生产外源蛋白，特别是具有高价值的 药物蛋白，如人血清白蛋白化SA)、人血红蛋白（砸）、纤维蛋白原（fibrinogen)等。
[0003] 目前世界上许多公司在从事大型哺乳动物生物反应器研制的同时，又将研发目标 瞄准了转基因家禽，利用母鸡输卵管制作生物反应器，W求大规模生产人类药物。对输卵管 生物反应器的研究是从输卵管上皮细胞的培养，W及在培养的输卵管细胞内和在活鸡的输 卵管内研究外源基因的表达开始的。
[0004] 卵清蛋白基因在鸡输卵管中受到卵清蛋白特异性启动子的调控特异性的表达。卵 清蛋白在输卵管中高效特异性表达的特点是制作转基因鸡输卵管生物反应器的基本条件。 在鸡基因组中扩增出卵清蛋白基因的调控序列，并且将之与所要表达的目的蛋白相结合， 构建出能够在鸡输卵管细胞中特异性表达的表达载体。之后，通过一些生物学技术与手段， 将运样的表达载体整合到鸡基因组中，即可得到转基因鸡。转基因鸡生物反应器可W使目 的蛋白在鸡输卵管中特异性的表达，并且随着鸡蛋排出体外。因为转基因鸡生物反应器主 要应用于目的蛋白的生产，因此，如何保证目的蛋白表达的高效性和特异性是转基因鸡生 物反应器相关研究的重要方向。 (Ξ)
【发明内容】
[0005] 本发明目的是构建含有雌激素反应元件ERE的卵清蛋白0V与绿色巧光蛋白eGFP 融合基因的慢病毒载体，为进一步研究禽输卵管生物反应器提供实验基础。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] -种鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体，由鸡卵清蛋白启动子基因0V和鸡雌激素反 应元件ERE连接到慢病毒载体pLVshRNA-eGFP中替换质粒上的CMVpromoter元件获得，其 质粒图谱见图1，所述鸡卵清蛋白启动子基因0V序列如SEQIDNo. 1所示，所述鸡雌激素反 应元件ERE序列如SEQIDNo. 2所示。
[0008] 本发明还设及构建所述的鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体的方法，所述方法包括：
[0009] (1)鸡卵清蛋白启动子0V基因克隆：提取鸡基因组DNA作为模板，设计鸡卵清蛋 白启动子0V引物，分别采用PCR扩增获得0V目的基因产物和ERE目的基因产物；
[0010] 所述鸡卵清蛋白启动子ον引物序列如下：
[0011] 0V-F:5'-ACACTAGTGTCCTCAGACTTGGC-3'
[0012] 0V_R:5'-GCACCGGTTGAACTCTGAGTTGTCTAG-3' ；
[0013] 所述鸡雌激素反应元件ERE引物序列如下：
[0014]ERE-F:5'-GTGAATTCCAGAAAAATGCCAGGTGG-3'
[0015]ERE-R:5'-GCACCGGTCGCACTAGTGAGAGTAAGCAACAAT [001引CTTCT-3' ；
[0017] (2)含有雌激素反应元件的慢病毒表达载体pGFP-ERE的构建：用EcoRI和Agel分 别双酶切ERE目的基因产物和慢病毒载体pLVshRNA-eGFP载体，获得ERE目的基因片段和 线性化载体pLVshRNA-eGFP，连接ERE目的基因片段和线性化载体pLVshRNA-ERE-eGFP，获 得含有雌激素反应元件的慢病毒表达载体pGFP-ERE;
[0018] (3)鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体PGFP-0V2-ERE的构建：用Spel和Agel双 酶切0V目的基因产物和慢病毒表达载体pGFP-ERE，获得0V目的基因片段及线性化载体 pGFP-ERE，连接0V目的基因片段和线性化载体pGFP-ERE，获得鸡卵清蛋白启动子慢病毒载 体PGFP-0V2-邸E。
[0019] 本发明还设及所述的鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体在构建禽输卵管生物反应器 中的应用。构建获得鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体，可W与其它外源基因进行基因重组形 成外源基因慢病毒载体，将外源基因慢病毒载体感染禽输卵管组织细胞，研究外源基因在 禽输卵管组织细胞上的表达水平。可作为外源基因在禽输卵管生物反应器分泌外源蛋白的 一种基础载体。
[0020] 本发明还设及所述的鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体在构建纳豆激酶基因慢病毒 载体中的应用。构建获得纳豆激酶慢病毒载体，可用于鸡输卵管上皮细胞及鸡胚成纤维细 胞上表达研究。
[0021] 本发明的有益效果主要体现在：本发明构建的慢病毒载体PGFP-0V2-ERE具有特 异性的启动子一一鸡卵清蛋白启动子，W绿色巧光蛋白EGFP作为报告基因，可W用现有的 EGFP或者FITC的滤光装置检测，为进一步研究禽输卵管生物反应器提供了实验基础。 (四）【附图说明】
[0022] 图1为本发明载体质粒图谱；
[0023] 图2为慢病毒载体pLVshRNA-eGFP质粒图谱；
[0024] 图3为卵清蛋白5'端序列0V2扩增结果图；Μ:DNAMark1000,Lane1-4:PCR amplificationgof0V2;
[00巧]图4为雌激素反应元件E肥序列扩增结果图；M:DNAMark100,Lanel-2:PCR amplificationgofERE;
[0026] 图 5 为pGFP-E肥质粒抽提PCR电泳结果图；M:DNAMark100,Lanel-2:PC民 amplificationgofplasmidpGFP-ERE;
[0027] 图6为质粒pGFP-E肥EcoRI/Agel双酶切凝胶回收结果；M:DNAMarklOOO， Lanel-2:DigestionofplasmidpGFP-ERE;
[0028] 图 7 为PGFP-0V2-E肥质粒抽提PCR电泳结果；M:DNAMark1000,Lanel-2:PC民 amplificationgofplasmid；
[0029]图8为质粒PGFP-0V2-ERESpel/Agel双酶切凝胶回收结果；M:DNAMark2000， Lanel-2:DigestionofplasmidpGFP-〇V2-ERE;
[0030]图9为豆激酶慢病毒载体分别转染输卵管上皮细胞和成纤维细胞后，绿色巧光在 细胞中的表达结果；A为成纤维细胞原代细胞巧为慢病毒感染成纤维细胞（隐性对照48小 时）；C为慢病毒感染鸡胚成纤维细胞（隐性对照72小时）；D为慢病毒感染输卵管上皮细 胞（48小时）；E为慢病毒感染输卵管细胞仍小时）；F为输卵管上皮细胞原代细胞。 (五）【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0032] 实施例1:
[003引一、实验材料
[0034] 实验动物：40周龄母鸡，购自于种鸡场。
[0035] 菌株及质粒：大肠杆菌菌株D册a由浙江大学动科院遗传育种与繁殖实验室保存 提供。
[0036] 慢病毒载体图谱：慢病毒载体pLVshRNA-eGFP(简写pGFP)(图谱参见图2)由北京 英茂盛业生物公司提供。
[0037] 主要试剂与工具酶
[0038]Taq DNA聚合酶、割胶回收试剂盒、DNA快速纯化回收试剂盒、DNA Marker购自 TaKaRa公司。血液基因组DNA提取试剂盒、普通质粒提取试剂盒购自TIAN GEN(天根）公 司。实验中用到的所有限制性内切酶、T4DNA连接酶购自化W化gland Biol油S(肥B.北京） 公司。
[0039] 2. 5主要药品和溶液的配制
[0040] (1)LB液体培养基（按1L体积配制计算）
[0041] 配制材料：细菌实验专用化C1lOg
[0042] 细菌实验专用膜蛋白腺 lOg
[0043] 细菌实验专用酵母提取物5g
[0044] 配制方法：将配制材料溶于950ml去离子水后，加入约700μ L5mol/L化OH调节 抑至7. 2,定容至1000血，高压下水蒸气灭菌20min，4°C保存备用。
[0045] (2)LB固体培养基（按1L体积配制计算）
[0046] 配制材料：细菌实验专用NaCl 1:0袋 细菌实验专用膜蛋白膝 1% 细菌实验专用酵母提取物 5g 细菌实验专用琼脂粉 1每
[0047] 配