制方法：将配制材料溶于950ml去离子水后，加入约500μ L5mol/L化0H调节 抑至7. 2,定容至1000血，高压下水蒸气灭菌20min，待冷却至60°C，每血加入0. 5μLlOmg/mL的Amp胆存液至终浓度为50μg/mU旋动混匀培养基，取已灭菌好的Φ10mm玻璃培养 皿，每个培养皿中加入适量培养基铺制平板，冷却后4°C保存备用。
[0048] (3)氨节青霉素胆存液（Amp,lOOmg/mL):溶解Ig氨节青霉素钢盐溶于去离子水 后，最后定容至10血，分装到1.5血的化pendo计试管中，4°C保存备用。常W50μg/mL终 浓度添加于LB培养基中。
[004引（4)Imol/LCaC!2:称取14. 7g0日化甜20溶于足量的水中，定容至100血，高压灭 菌20min，4°C保存备用。常用0.Imol/L化CI2溶液。
[0050] (5)含15%甘油的0.1111〇1/10日(：12溶液：在10血1111〇1/10日(：12中加入15血纯甘 油，加水定容至100血，高压灭菌20min，4°C保存备用。
[0051] 2.6实验主要仪器设备
[0052] 超净工作台 苏州净化设备厂 电泳仪及平板电泳槽 北京六一仪器厂 巧?C〇2培养箱 德国技就舱US公司 普通PC反仪 美国Thermo公司
[0053] 凝胶成像系统 北京五洲东方科技发展有限公司 -70°C低温冰箱 美国Thermo公司 普通冰箱 中国海尔 隔水式恒溫培养箱 上海森信实验仪器有限公司 电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司 低速离也机 上海森信实验仪器有限公司 格液枪 Eppendo计公11;, 度力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司 制冰机 北京德天佑科技有限公司
[0054] 3实验方法
[005引3. 1鸡卵清蛋白启动子基因5'端序列0V2及ERE的克隆
[0056] 3. 1. 1鸡基因组DNA的提取
[0057] 将种鸡场购得的母鸡采用颈部放血，采集2mL新鲜鸡血。用TIANGEN(天根）公司 的DNA提取试剂盒TIANampGenomicDNAKit(产品目录号：DP304)提取鸡血基因组DNA作 为DNA模板。将获得的鸡基因组DNA溶液保存在-20°C的低溫冰箱中。
[0058] 3. 1. 20V2、ERE引物设计
[0059] 根据GenBanK中已发表的鸡卵清蛋白启动子基因序列0V2(GenBank登入号码： J00895. 1)和ERE(GenBank登入号码：S82572. 1)。设计引物扩增鸡卵清蛋白启动子0V2和 ERE序列片段。其中在0V2引物上游F加上Spel酶切位点、下游R加上Agel酶切位点（表 1)。在ERE引物上游F加上EcoRI酶切位点、下游R加上Spel和Agel酶切位点（表2)。
[0060] 表1:0V2引物序列
[0061]
[0062]引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司进行合成。
[0063] 3. 1. 30V2、ERE的扩增
[0064] 在PCR反应管中加入W下试剂，加样过程在超净台操作。
[006引（1) 0V2的PCR反应体系：
[0066]
[0067]似0V2的PCR反应程序：94°C变性5min，进入循环（94°C变性lmin、54°C退火 45sec、72°C延伸3min)，共35个循环。最后72°C延伸10min，4°C保存。
[006引做ERE的PCR反应体系：
[0069]
[0070]
[0071] (4化RE的PCR反应程序：94°C变性5min，进入循环（94°C变性30sec、56°C退火 45sec、72°C延伸Imin)，共35个循环。最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0072] 3. 1. 4扩增产物凝胶电泳观察结果，拍照
[0073] 将上述步骤获得的扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳观察结果，拍照。琼脂 糖凝胶大体流程如下：
[0074] (1)称量：通常所说的0. 8%、1%的胶都是指的质量体积分数，即所称取的琼脂糖 粉的质量（g)比所加的TAE缓冲液的体积（血）即胶的浓度。0.8%的胶需要琼脂粉0. 104g， 1 3mT' 的TAE。
[007引似烙胶：将所称量的琼脂粉与TAE在锥形瓶中混合，在微波炉内反复加热2~3 次至琼脂粉溶解并无气泡。
[0076] (3)倒胶：在干净的胶槽内摆好梳子，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。
[0077] (4)拔梳：待大约20min后，轻轻拔掉梳子（若不好拔，可W滴加适量的TAE缓冲 液）。
[0078] 3. 1. 50V2、ERE的PCR产物纯化与回收
[0079] 从PCR反应液中回收纯化DNA片段，采用TaKaRa快速回收纯化DNA试剂盒（产品 号：A脚01)来回收DNA片段。
[0080] 3. 2含有雌激素反应元件（estrogenresponseelement,ERE)的慢病毒表达载 体pGFP-ERE的构建
[0081] 3. 2. 1慢病毒载体pGFP和ERE基因片段双酶切
[008引（1)将上文得到的回收产物ERE基因片段利用引物中添加的EcoRI和AgeI进行双 酶切，反应总体积20μL反应溫度37°C，酶切比。用TaKaRa快速回收纯化DNA试剂盒方法 进行回收ERE基因酶切产物。
[0083] 似慢病毒载体pGFP酶切反应体系
[0084]
[0085] 酶切掉慢病毒载体pGFP上原有的CMVpromoter元件，暴露两端黏性酶切位点，使 环状型慢病毒载体变成线状型质粒载体。反应溫度为37°C，酶切时间比。
[0086] 3. 2. 2载体pGFP酶切产物回收
[0087] 载体pGFP双酶切反应结束，在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳观察结果。从琼脂糖 凝胶中回收纯化质粒大片段，采用TaKaRa割胶回收质粒DNA试剂盒（产品目录号：D823A) 方法进行。
[0088] 3. 2. 3ERE克隆载体连接反应
[008引将回收产物按适当比例混合，采用T4DNA连接系统连接
[0090] (1)加样
[0091]
[0092]
[009引 似混匀，于恒溫水浴锅16°c连接过夜。
[0094] 3. 2. 4连接产物转化D册a型感受态细胞
[009引 （1)从本实验-70°C冰箱中取出D册a感受态细胞，解冻后立即放于冰上。
[009引 似在超净台上，将lOyL连接产物加入150yL感受态细胞，轻缓转动W混匀内容 物，冰浴30min，立即放42°C水浴热激90sec，快速转至冰浴中5min。
[0097] (3)加入850μΙ不含抗生素的液体培养基，摇匀，放恒溫摇床摇动复苏（200巧m)， 37°C保溫 60min。
[0098] (4) 12000巧m离屯、lOsec，吸去上清液900μL，剩余100μL悬浮菌液，涂布于LB固 体培养基（已加入50μg/mL的Amp)，待涂布的菌液被培养基吸干后，倒置培养基，于37°C 培养过夜（14~16h)。次日，取板，放4°C冰箱备用。
[009引妨用灭菌过的10μL的枪头挑出单菌落，放入5~10血已加Amp的液体LB培养 液中，放恒溫摇床（200巧m) 37 °C摇菌过夜培养。
[0100] 3. 2. 5重组质粒DNA的小量提取
[0101] 采用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒（目录号：DP103)方法进行。3. 2. 5重组质 粒载体PCR和酶切鉴定
[0102] 将获得的重组质粒作为模板DNA基因组，WERE的PCR扩增条件用PCR法进行鉴 定。并根据ERE引物设计时对其添加的特定酶切位点EcoRI和Agel进行双酶切鉴定。将 PCR及酶切鉴定正确的重组质粒送往生物公司进行测序鉴定。将测序正确的重组质粒命名 为pGFP-邸E。
[0103] (1)双酶切鉴定体系
[0104]
[0105] 置于37°C水浴中消化酶切比，凝胶电泳观察拍照。
[0106] (2)PCR鉴定体系
[0107]
[0108] 重组质粒的PCR反应程序设置与ERE的PCR扩增程序相同，凝胶电泳观察拍照。
[0109] 3. 3鸡卵清蛋白启动子5'端序列0V2的慢病毒表达载体PGFP-0V2-ERE的构建
[0110] 3. 3. 1慢病毒载体pGFP和0V2基因片段双酶切
[0111] (1)将上步得到的回收产物0V2基因片段和构建好的重组质粒pGFP-ERE分别利用 Spel和Agel进行双酶切，反应总体积20μL。反应溫度为37°C，消化酶切比。
[0112] 3. 3. 2酶切产物的回收
[0113] 用TaKaRa反应液DNA快速回收试剂盒方法分别回收重组质粒pGFP-ERE的酶切产 物线状大片段和0V2酶切产物小片段。