[0114] 3. 3. 30V2片段定向连接 [011引
[0116] 混匀，于恒溫水浴锅16 °C连接过夜。
[0117] 3. 3. 4连接产物转化D册a细胞及重组质粒的提取鉴定
[0118] 连接产物转化至D册a感受态细胞，涂布于含抗生素的LB固体培养基上，倒置培 养，37Γ培养12~16h，挑取单个阳性菌落摇菌过夜培养，提取重组质粒。将重组质粒进行 PCR鉴定和双酶切鉴定。鉴定正确的质粒送往生物公司进行测序。将测序正确的重组质粒 命名为PGFP-0V2-ERE。
[011引 4实验结果
[0120] 4. 1卵清蛋白启动子5'端序列0V2和ERE的克隆结果
[0121] 取卵清蛋白启动子5'端序列0V2和雌激素反应元件ERE的PCR扩增产物4μL于 0.8%琼脂糖凝胶上电泳显示，约在300069和60069的位置出现一条特异性条带，运与0￥2 片段大小约2.8化及ERE片段大小666bp相符。（参见图3和图4)
[0122] 4. 2含有雌激素反应元件（estrogenresponseelement,ERE)的慢病毒表达载体 pGFP-ERE的构建鉴定
[012引 （1)将重组质粒WERE设计的引物，W质粒为DNA模板，进行PCR鉴定。在0.8% 琼脂糖凝胶上电泳显示。得到大小约为6(K)bp的特异性，与ERE片段666bp大小相符（参 见图5)。
[0124] (2)重组质粒pGFP-ERE进行EcoRI和Agel双酶切鉴定，得到一条约为7. 2化的 大条带和66化P的目的基因小条带（参见图6)。质粒pGFP-ERE双酶切结果与预期结果一 致。
[0125] (3)重组质粒pGFP-ERE送上海汉恒生物技术有限公司进行重组质粒上ERE片段测 序，并对测序结果进行BLAST同源性分析。
[0126] 根据测序结果，其中的66化P的ERE序列与公布的序列有99%的同源性，W及质 粒PCR扩增及双酶切反应鉴定综合分析可W认定邸E基因片段已成功插入表达载体中，获 得有雌激素反应元件ERE的慢病毒表达载体pGFP-ERE。说明可W用重组质粒pGFP-ERE进 行下一步载体的构建。4. 3鸡卵清蛋白启动子5'端序列0V2表达载体PGFP-0V2-ERE构建 鉴定（1)将重组质粒进行0V2片段的PCR鉴定。得到大小约为2.8化的特异性，与片段0V2 的2.8化大小相符（参见图7)。
[0127] 似重组质粒PGFP-0V2-ERE进行和Agel双酶切鉴定，得到一条约为7.8化的线状 条带和约2.8化的条带（参见图8)。双酶切结果与预期结果一致。
[0128] (3)重组质粒PGFP-0V2-ERE送上海汉恒生物技术有限公司进行重组质粒上0V2片 段测序，并对测序结果进行BLAST同源性分析。
[0129] 结果显示，其中约2. 8化(279化P)的0V2序列与公布的序列有99%的同源性，W 及质粒PCR扩增及双酶切反应鉴定综合分析可W认定启动子5'端序列0V2基因片段已 成功插入表达载体中，获得0V2的慢病毒表达载体PGFP-0V2-ERE。说明可W用重组质粒 PGFP-0V2-ERE进行下一步载体的构建。
[0130] 利用重组质粒PGFP-0V2-ERE构建纳豆激酶慢病毒载体，分别转染输卵管上皮细 胞和成纤维细胞，可通过观察绿色巧光在细胞中的表达验证卵清清蛋白启动子的特异性。 构建得到纳豆激酶慢病毒载体转染在成纤维细胞上基本没有巧光，而在输卵管细胞上发现 巧光（参见图9)，说明本发明设计的卵清蛋白启动子具有特异性表达性。
[0131] 5 讨论
[0132]pLVshRNA-eGFP载体是基于HIV1的慢病毒RNA干扰载体，大小为7. 8化，包含了生 产慢病毒所必须的病毒原件W及提高病毒滴度及基因表达效率的原件。载体结构紧凑，具 有包装效果稳定，病毒滴度高等优点。并且pLVshRNA-eGFP载体表达EGFP巧光蛋白，可W 方便地观测病毒感染效率W及用流式巧光分选的方法筛选出阳性细胞。
[0133] 为了实现纳豆激酶外源基因慢病毒表达载体在禽类输卵管组织中的特异性表达 必须有组织特异性启动子的参与。鸡卵清蛋白启动子慢病毒表达载体的构建，为纳豆激酶 克隆载体提供慢病毒启动子载体。
[0134] 本章发明W新鲜鸡血为材料，根据GenBanK中已发表的鸡卵清蛋白5'端序列启动 子0V2和ERE(其中ERE是启动子0V2序列的调控元件，提高0V2表达量），设计0V2和ERE 序列片段引物，PCR扩增得到卵清蛋白启动子大小约为2.8化的5'端0V2序列，和大小为 666bp的ERE片段。回收ERE基因片段，利用引物中添加的EcoRI和Agel内切酶对ERE基 因和慢病毒载体pGFP进行双酶切。切掉慢病毒载体pGFP上原有的CMVpromoter元件，暴 露两端黏性酶切位点，使环状型慢病毒载体变成线状型质粒载体。将双酶切回收产物按适 当比例混合，进行ERE克隆载体连接。连接产物转化D册a型感受态细胞摇菌过夜培养，小 量提取重组质粒DNA。对重组质粒载体进行PCR及EcoRI、AgeI双酶切鉴定，结果与预期结 果一致。将PCR及双酶切鉴定正确的重组质粒送往生物公司进行测序鉴定。根据测序结果 中的66化P的ERE序列与GenBanK公布的序列有99%的同源性，可W认定ERE基因片段已 成功插入表达载体中。将测序正确的重组质粒命名为pGFP-ERE。
[0135] 再将0V2的PCR克隆产物回收片段插入载体pGFP-ERE中。同样经PCR和Spel、 Agel双酶切、测序鉴定。根据测序结果中的2.8化的0V2序列与GenBanK公布的序列有 99%的同源性可W认定启动子5'端序列0V2基因片段已成功插入表达载体中，获得0V2的 慢病毒表达载体PGFP-0V2-ERE，为纳豆激酶慢病毒载体构建提供了慢病毒启动子载体。
【主权项】
1. 一种鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体，由鸡卵清蛋白启动子基因ον和鸡雌激素反应 元件ERE连接到慢病毒载体pLVshRNA-eGFP中替换质粒上的CMV promoter元件获得，其质 粒图谱见图1，所述鸡卵清蛋白启动子基因0V序列如SEQIDNo. 1所示，所述鸡雌激素反应 元件ERE序列如SEQIDNo. 2所示。2. 构建如权利要求1所述的鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体的方法，所述方法包括： (1) 鸡卵清蛋白启动子0V基因克隆：提取鸡基因组DNA作为模板，设计鸡卵清蛋白启 动子0V引物，分别采用PCR扩增获得0V目的基因产物和ERE目的基因产物； 所述鸡卵清蛋白启动子0V引物序列如下： 0V-F:5'-ACACTAGTGTCCTCAGACTTGGC-3' 0V-R:5'-GCACCGGTTGAACTCTGAGTTGTCTAG-3' ； 所述鸡雌激素反应元件ERE引物序列如下： ERE-F:5'-GTGAATTCCAGAAAAATGCCAGGTGG-3， ERE-R:5'-GCACCGGTCGCACTAGTGAGAGTAAGCAACAATCTTCT-3' ； (2) 含有雌激素反应元件的慢病毒表达载体pGFP-ERE的构建：用EcoRI和Agel分别 双酶切ERE目的基因产物和慢病毒载体pLVshRNA-eGFP载体，获得ERE目的基因片段和线 性化载体pLVshRNA-eGFP，连接ERE目的基因片段和线性化载体pLVshRNA-ERE-eGFP，获得 含有雌激素反应元件的慢病毒表达载体pGFP-ERE; (3) 鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体pGFP-0V2-ERE的构建：用Spel和Agel双酶 切0V目的基因产物和慢病毒表达载体pGFP-ERE，获得0V目的基因片段及线性化载体 pGFP-ERE，连接0V目的基因片段和线性化载体pGFP-ERE，获得鸡卵清蛋白启动子慢病毒载 体PGFP-0V2-ERE。3. 如权利要求1所述的鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体在构建禽输卵管生物反应器中 的应用。4. 如权利要求1所述的鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体在构建纳豆激酶基因慢病毒载 体中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体、构建方法及用途。所述慢病毒载体由鸡卵清蛋白启动子基因OV和鸡雌激素反应元件ERE连接到慢病毒载体pLVshRNA-eGFP中替换质粒上的CMVpromoter元件获得，其质粒图谱见图1，所述鸡卵清蛋白启动子基因OV序列如SEQ？ID？No.1所示，所述鸡雌激素反应元件ERE序列如SEQ？ID？No.2所示。本发明构建的慢病毒载体pGFP-OV2-ERE具有特异性的启动子——鸡卵清蛋白启动子，以绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因，可以用现有的EGFP或者FITC的滤光装置检测，为进一步研究禽输卵管生物反应器提供了实验基础。
【IPC分类】A01K67/027, C12N15/66, C12N15/867
【公开号】CN105331637
【申请号】CN201510908542
【发明人】郭晓令, 吴志鹏, 蒋梅
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年12月10日